Unidad 2 Cintica de Fermentaciones

2.1.- DETERMINACION DE LA CONCENTRACION CELULAR

Cuantificacin de clulas a travs del tiempo

OBJETIVO
Cintica de crecimiento

! Bacterias
De qu clulas ! Levaduras
hablamos ? ! Hongos filamentosos (mohos)
! Microalgas

Economa celular OPTIMIZACION

Funcionamiento anormal

Microorganismo de menor tamao (12 m)

Bacterias Variada morfologa
Fisin binaria
No tienen edad
Actinomycetes

4 8 m
Levaduras Morfologa ovalada, esfrica
Yemacin
La distribucin de edades ir cambiando
Respuesta del cultivo es funcin del tiempo

Hongos filamentosos
Microalgas eucarioticas
5 20 m
Crecimiento filamentoso (hifas)
Estructura miceliar
Crecimiento apical
Clulas viejas quedan
Lenta respuesta fisiolgica
Tambin reproduccin mediante esporas
Tamaos de celulas, virus, y otras cosas pequeas La biologia es un area
muy rica visualmente. Sin embargo muchas de las estructuras y eventos
biologicos ms interesantes son ms pequeos de lo que el ojo humano puede
ver sin ayuda. En realidad el ojo humano tiene una resolusion de cerca de 100
m. En el cuadro de abajo note que de todas las estructuras listadas, solamente
la celula vegetal est escasamente dentro de nuestra resolusion

El Microscopio opticoEl microscopio optico tiene un limite resolucon de cerca de 200

nm (0.2 m ). Este limite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 m ). Las
celulas observadas bajo el microscopio optico pueden estar vivas o fijadas y teidas.

El Microscopio Electronico de Transmisin(MET) El microscopio electronico de

transmisin (MET) tiene un limite de resolusin de cerca de 2 nm. Esto es debido a
limitaciones del lente usado para enfocar electrones hacia la muestra. Un MET mira a
replicas de celulas muertas , despues de haber sido fijadas y teidas con iones de
metales pesados. Los electrones son dispersados cuando pasan a traves de una fina
seccin del especimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre
una pantalla fluorescente

El Microscopio Electronico de Barrido (MEB)El microscopio elctronico de barrido

(MEB) tambien tiene un limite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite mirar a
celulas muertas, despues de haber sido fijadas y teidas con iones de metales pesados.
Con esta tecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del especimen.
Generalmente las bacterias se reproducen por biparticin, como se ve
en el siguiente esquema:

Tras la duplicacin del ADN, que esta dirigida por la ADN-

polimerasa que se encuentra en los mesosomas, la pared
bacteriana crece hasta formar un tabique transversal separador
de las dos nuevas bacterias. Pero adems de este tipo de
reproduccin asexual, las bacterias poseen unos mecanismos
de reproduccin sexual o parasexual, mediante los cuales se
intercambian fragmentos de ADN .

Puede realizarse por :

Transformacin
Conjugacin
Transduccin
 TRANSFORMACION: Consiste
en el intercambio gentico
producido cuando una bacteria
es capaz de captar fragmentos
de ADN, de otra bacteria que se
encuentran dispersos en el
medio donde vive.

CONJUGACIN: En este
proceso, una bacteria
donadora F+ transmite a
travs de un puente o pili, un
fragmento de ADN, a otra
bacteria receptora F-. La
bacteria que se llama F+
posee un plsmido, adems
del cromosoma bacteriano.

TRANSDUCCIN: En este caso la

transferencia de ADN de una bacteria
a otra , se realiza a travs de un
virus bacterifago, que se comporta
como un vector intermediario entre
las dos bacterias.
 Yemacin
Modalidad de reproduccin asexual propia de las levaduras.
Sobre la superficie de la levadura, comienza a formarse un brote
o yema.
El ncleo se duplica, y uno de los ncleos se introduce en el
brote que est en formacin.
Despus de un tiempo, la yema se separa de la clula
progenitora y se independiza, constituyendo un nuevo individuo.
Tambin, el brote puede quedar unido a la clula madre y formar
colonias.
Se forman dos clulas de distinto tamao, el citoplasma se
reparte en forma desigual.
La clula madre permanece.

Levadura X 1500
Yemacin de levaduras X 1500
 Cmo se cuantifica ???

NUMERO peso seco

turbidimetra
celdas de recuento (mtodo directo) volumen compactado MASA
recuento total en placas (UFC) dispersin de luz
nefelometra estimaciones fsicas ()
NMP estimaciones qumicas
mtodos instrumentales cambios en el medio de cultivo
Contador Coulter cambios en la clula
balances de materia
N UTRIENTES + O2 BIO MASA + CO2 + H2O + METAB OLITOS

Mtodos Fundamento Observaciones

Recuento en celda Conteo directo del N de
clulas
Recuento en placa Conteo del N de colonias
Nefelometra Dispersin de la luz
N.M.P. Estadstico
Peso seco Medicin directa
Turbidimetra Transmisin de la luz
Volumen empacado Centrifugacin
Fsicos y qumicos Variados, indirectos
Balances de masa Conservacin de la masa
Mtodos para la cuantificacin del crecimiento de poblaciones microbianas
Requiere clulas individuales y medio
limpio
Requiere clulas individuales,
influencia de las condiciones de
incubacin
Requiere cultivo homogneo y
traslcido
Requiere clulas individuales y medio
limpio
No admite slidos en el medio.
Trabajoso
Requiere clulas individuales y medio
limpio
Poco preciso
Cambios en viscosidad, pH. Anlisis de
componentes celulares
Gran cantidad de datos analticos
 2.2.- CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVOS POR LOTES

Modalidades
de cultivo por lotes (cargas, tandas, batch)
contnuo
por lotes alimentados

SISTEMA BATCH

ES UN SISTEMA
CERRADO

CURVA DE CRECIMIENTO

Fase de latencia (fase lag) [a]

Fase de crecimiento exponencial [b]

(fase logartmica) *

Fase estacionaria (mantencin) [c]

Fase de declinacin o muerte [d]

Fase de crecimiento crptico [e]

* Ecuaciones caractersticas

dX
= X X = X 0 e t
dt
X : Concentracin celular en masa [gr clula seca/lt]
t : Tiempo [hr]
: Velocidad de crecimiento [hr-1]
 Observaciones

Es posible distinguir tambin cortas fases de aceleracin

y desaceleracin del crecimiento

La fase estacionaria puede presentar una leve pendiente

positiva si el nutriente limitante es, por ejemplo, la fuente
de nitrgeno

Si se utiliza nmero de clulas en lugar de biomasa, aparecen

algunas diferencias en la curva:

Fase de latencia: no hay aumento de clulas viables

Fase estacionaria: no se apreciar aumento en caso

de limitacin por nitrgeno

A qu velocidad crece este cultivo ?

Hasta cundo crece un M.O. ?

Crecimiento diuxico

Cultivo discontinuo aerbico de la levadura Kluyveromyces lactis en

lactosuero desproteinizado. Condiciones: matraces Erlenmeyer con 1/5 de
su volumen de medio de cultivo bajo agitacin orbital a 150 rpm y a 30 C.

En la situacin representada en el grfico, en primer lugar

la levadura metaboliza la lactosa, fermentando una parte
de ella hasta etanol. Este alcohol es consumido
oxidativamente en una segunda etapa.

Se produce cuando el microorganismo dispone de dos

fuentes de carbono en el medio y no comienza a consumir
la segunda hasta que no ha agotado la primera.

SE OBSERVAN DOS FASES DE

CRECIMIENTO BIEN DIFERENCIADAS

Otro ejemplo comunmente citado es el crecimiento de

microorganismos en un medio conteniendo glucosa y
lactosa. La glucosa es rpidamente metabolizada,
mientras la utilizacin de lactosa queda paralizada por
represin catablica.
 Modelamiento de la Teora

dX
= X
dt pendiente de la recta

1 dX d ln X
= =
X dt dt

Integrando en
fase exponencial

ln
X
= t X = X 0 e t
X0

Tiempo de duplicacin
Lapso entre dos duplicaciones sucesivas

Tipo de clula td (h)

ln 2
td = Bacterias 0.3 2.0

Levaduras 1.0 4.0

ECUACIONES VLIDAS Hongos filamentosos 2.0 7.0

PARA LA FISIN BINARIA !!!

Bacterias Microalgas 18 35

Levaduras
Clulas animales in vitro 20 40

Organismos
filamentosos Tiempos de duplicacin caractersticos
2.3.- INFLUENCIA DE LOS FACTORES AMBIENTALES

= f ( MO, factores ambientales )

Microorganismo
Medio de cultivo
Temperatura
pH
Fuerza inica
Presencia de inhibidores
Presencia de tensoactivos
Actividad de agua
Potencial redox (eH)

Efecto cualitativo
Composicin del
Medio de cultivo Efecto cuantitativo

S
= M
KS + S
MONOD, 1949

CASO SIN INHIBICION !!!

Si S >>> KS = M
 Sustrato Organismo KS (mg/lt)
Glucosa Escherichia 0.07 2.0
Glucosa Aspergillus 5.0
Glucosa Saccharomyces 25.0
Glucosa Candida 4.5
Lactosa Escherichia 20.0
Metanol Pseudomonas 0.7
Fosfato Escherichia 1.6
Magnesio Klebsiella 0.56
Arginina Aspergillus 0.50
Triptfano Escherichia 5.0x10-4 1.0x10-3

Valores de Constante de Saturacin

S
= M
Concentraciones altas de sustrato
(K S + S ) 1 + S
KI

CRECIMIENTO
INHIBIDO
S
= M

Concentraciones altas de productos (K S + S ) 1 + P
KP
 Temperatura
de cultivo

Cada rama de la curva puede

ser modelada por una ecuacin
del tipo Arrhenius

Ea

R T
= Ae

MO psicrfilos (0-15 C) Ea [ 8 26 kcal/mol ]

MO mesfilos (20-40 C)

MO termfilos (45 C y superiores)

Bacterias ( 6 7.5 )
Existe valor ptimo Levaduras ( 3.5 5.5 )
Mohos ( 3 7 )
pH
No se ha formulado un modelo
Curva variada matemtico simple y general
para representarla

Su valor determina la posibilidad de ocurrencia

de reacciones de oxidacin de sustrato
Potencial
redox
Valor relevante para organismos
quimioauttrofos

Actividad Los MO requieren un nivel mnimo de aw

de Agua para posibilitar su desarrollo
aw > 0.85
 2.3.- DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO
Desarrollo de una fermentacin con mnimo costo por unidad de producto

materia clulas
informacin
energa metabolitos

1 Ca H bOc + m NH 3 + n O2 MO
q Cd H eO f N g + r CO2 + t H 2O + u Ch H i O j N k

% en peso, base seca

Elemento bacterias levaduras mohos

Carbono 46 52 46 52 45 - 55
Hidrgeno 8 12 8 12 8 12
Oxgeno 18 24 18 24 18 24
Nitrgeno 10 14 59 37
Magnesio 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.3
Fsforo 2.0 3.0 0.8 0.25 0.4 4.5
Azufre 0.1 1.0 0.01 0.25 0.1 0.5
Calcio 0.01 1.0 0.1 0.3 0.1 1.4
Potasio 1.0 4.5 1.0 4.0 0.2 2.5
Hierro 0.02 0.2 0.01 0.5 0.1 0.2
Otros <0.01 <0.01 <0.01

Compuesto

Protenas 50 60 35 - 45 25 40
Carbohidratos 6 15 30 45 40 55
Lpidos 5 10 5 10 5 10
Ac. Nucleicos 15 25 5 15 2 10
Cenizas 4 - 10 4 - 10 4 - 10

Composicin qumica de clulas microbianas

 Fuente de elementos mayores
C, H, O, N

Fuente de elementos menores

P, Ca, S, Mg

Fuente de elementos trazas

K, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Na, Al, Si, Cl, Cr, V
Ni, As, Se, Mo, Sn, I, Be, F, Sc, Ti, Ga, Ge, Br, W
Nutrientes esenciales
factores de crecimiento

Elementos

Definidos

Medio Mnimo (simple)

Medios de melaza
cultivo Licor de maceracin de maz
Suero de leche
Complejos Permeado de suero
Extractos
Licor de sulfito
Harinas y concentrados proteicos
Harina de soya
Hidrolizados
Aceites vegetales
Almidn de maz
Glucosa (de maz)
Amonio
urea
sales minerales
Suplementos vitaminas
aminocidos
 Formulacin de Medios de Cultivo

Conocer composicin del MO REQUERIMIENTOS

Definir las fuentes de nutrientes a utilizar

C C6H12O6

P K2HPO4

Mg MgCl2, MgSO4
N NH4Cl, (NH4)2SO4
MgSO4x7H2O, K2SO4, FeSO4x7H2O,
S
CuSO4x5H2O, Na2SO4
K KCl

Estimar las cantidades necesarias de cada fuente

Cuntas clulas vamos a hacer

yx/s

Glucosa 0.45 0.50 Cunto sustrato vamos a agregar

(NH4)2SO4 2.0 3.0 RENDIMIENTO
X
yx =
KH2PO4 10 15 Cmo estimarlo? s S
MgSO4x7H2O 20 - 25 Experimentalmente
Estimacin terica
Carbono f=1

% del elemento en Fuente

yx = f
s % del elemento en Clula = Carbono
Aerobio f = 0.6
Anaerobio f = 0.1

Determinar el nutriente limitante

Determinar la incorporacin de
otros nutrientes y trazas

Clculo de tampones
[ KH2PO4 + Na2HPO4 ] ~ 10 g/lt