MATERIALES:

RECOLECCIN

6 botellas de un litro
Cooler 4C
Termmetro

FILTRADO

Membrana de nitrato de celulosa de 45mm con poros de 0.22um

Embudo
Vaso de precipitacin

SONICADO

Ultrasonido
Solucin salina tamponada

CENTRIFUGACIN

Centrfuga
Vortex

MEDIO DE CULTIVO

Medio Fluka lauryl sulfate (caldo lauril sulfato de sodio ) and brilliant Green bile lactose
broth(caldo bilis verde brillante) (Coliformes totales)
Medio Fluka EC broth (caldo EC) (Coliformes fecales)
Cmara de flujo laminar

AISLAMIENTO y AMPLIFICACIN

Kit correspondiente
Nanodrop (Qubit)
Primers

PROCEDIMIENTO:

1. Se recoge las muestras de los tres ros 2 litros de cada y se almacena a 4oC .
2. Se realiza el filtrado 1 litro de cada muestra a travs de una membrana nitrato de
celulosa de 45mm con poros de 0,22um
3. La membrana se sonica con solucin salina tamponada con fosfato esteril (100ml) por 5
min para eluir los MOs.
4. El eluyente se centrifuga (5800 giros por 30min) y se descarta el sobrenadante.
5. El sedimento se agita en vortex y se almacena a 4oC.
6. Se prepara los medios de cultivo: Medio Fluka lauryl sulfate (caldo lauril sulfato de sodio
) and brilliant Green bile lactose broth (caldo bilis verde brillante) (Coliformes totales) y
Medio Fluka EC broth (caldo EC) (Coliformes fecales)
 7. Se siembra las muestras tomadas del sedimento en cada uno de los medios
8. Se toma una muestra del medio de forma pre-rayada para obtener cultivos puros y se
enrique con Medio Fluka lauryl sulfate (caldo lauril sulfato de sodio ) and brilliant
Green bile lactose broth (caldo bilis verde brillante) a 37C de la noche a la maana.
9. Se extrae el material gentico (ARN) de cada aislante bacteriano con ayuda del
protocolo del kit
10. Se utiliza la PCR con el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription para obtener
ADNc
11. Se cuantifica el ADN extrado
12. Se amplifica en PCR tiempo real con los primers correspondientes

GENES RESISTENCIA Antibiticos

blaTEM codifica para penicilina, cefalosporinas, monobactmicos,
resistencia a beta- carbacefem, carbapenems e inhibidores de la
lactmicos betalactamasa (-lactamasa)
sulI Codifica para En humanos, como el sulfametoxazol, la
sulII resistencia a las sulfadiazina y la sulfabenzamida, as como
sulfonamidas veterinaria, como el sulfanitrato, el
sulfapirazol, la sulfaquinoxalina y la
sulfadimetoxina.
tetA Codifica para resistencia a las tetraciclinas
tetW

Coliformes Totales: incluye una amplia variedad de bacilos aerobios y anaerobios facultativos,
Gram negativos y no esporulantes, capaces de proliferar en presencia de concentraciones
relativamente altas de sales biliares, fermentando la lactosa y produciendo cido o aldehdo en
24 hs a 3537C. Las bacterias identificadas genricamente como Coliformes Totales
pertenecen a la familia Enterobacteriaceae e incluye mayoritariamente cuatro gneros:
Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. Escherichia coli se encuentra
exclusivamente en heces, constituyendo entre el 95 y 97% de las especies coliformes de las
heces humanas; Klebsiella aporta un 1.5%, mientras que Citrobacter y Enterobacter aportan el
1.7%. La mayora de estas bacterias, una vez excretadas por materia fecal, pueden tambin
reproducirse en cursos de agua bajo condiciones adecuadas de materia orgnica, temperatura,
humedad y pH.
Coliformes Fecales o termotolerantes: las bacterias del grupo de las Coliformes Totales que
son capaces de fermentar lactosa a 44-45 C se conocen como Coliformes Fecales o
termotolerantes. Aproximadamente el 90-95% del grupo de las Coliformes Fecales est
formado por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella.
En base a lo anteriormente expresado, se considera que como especie bacteriana individual,
Escherichia coli es un buen indicador de polucin fecal, debido a que est presente en
concentraciones muy altas en las heces humanas y animales y raramente se encuentra en
aguas en ausencia de contaminacin fecal.