PRODUCCIN DE CIDO L-LCTICO POR BACILLUS SUBTILIS MUR1

ABSTRACTO

Bacillus subtilis MUR1 es una nueva cepa productora de cido lctico (LA) que tiene
potencial para la produccin industrial de LA debido a su alta productividad de LA,
alto rendimiento de conversin de sustrato y alta concentracin final de LA
producido. B. subtilis MUR1 puede producir 99,3 y 183,2 g / l de L-LA en 12 y 52 h
respectivamente Con un rendimiento de conversin del substrato del 98,5% y una
velocidad de produccin L-LA mxima de 16,1 g / l / h. Comparado Con cultivo
discontinuo, y varios cultivos alimentados con diferentes concentraciones iniciales
de glucosa, el Alimentados con una concentracin inicial de 30 g / l de glucosa
produjeron la concentracin final y la productividad ms altas De L-LA. El licor
esmerilado de maz puede utilizarse para sustituir en parte el extracto de levadura
en el medio de Produccin de L-LA por B. subtilis MUR1.

1. INTRODUCCIN

El cido lctico (LA) es un cido orgnico ampliamente utilizado en los alimentos,

Farmacutico, textil, cuero, qumico, cosmtico y polmero industrias. En la
naturaleza, hay dos formas pticamente activas: D- ( ) Y L - (+) LA, pero dado que
los niveles elevados de cido D - ( ) lctico son perjudiciales a los seres humanos, L-
LA es el ismero preferido en alimentos y productos farmacuticos industrias como
seres humanos slo tienen L-lactato deshidrogenasa. Industrialmente, LA se puede
obtener por medios qumicos o biotecnolgicos. Sin embargo, la sntesis produce
una mezcla racmica de DL-LA; mientras que la fermentacin puede producir ya sea
la forma sola o un racemato. Adems, el mtodo de produccin biotecnolgica ofrece
varias ventajas en comparacin con la sntesis qumica como bajo costo de sustratos,
temperatura suave y bajo consumo de energa. Por lo tanto, el 90% del total de LA
producido mundial se produce por fermentacin microbiana.
Bacillus subtilis ha sido considerado como un aerobia estricto para muchos aos. Sin
embargo, los estudios han demostrado que tambin puede crecer anaerbicamente
ya sea utilizando nitrato o nitrito como un electrn terminal aceptor o por
fermentacin. Debajo condiciones anaerbicas fermentativas, LA se produce por la
reduccin de piruvato con B. subtilis. A pesar de que hay numerosos informes sobre
la produccin de LA por algunas especies de Bacillus, incluyendo Bacillus coagulans,
Bacillus stearothermophilus, y Bacillus licheniformis y Bacillus sp. hay informacin
limitada en la produccin de LA, haba informado de que el cultivo aerbico de B.
subtilis produjo 3,7 g / l de LA con un rendimiento de conversin de glucosa del
49%. Recientemente, informaron que 105 g / l de L-LA fueron producidos por B.
subtilis CHl alsS de 10% de glucosa en 216 h de fermentacin. B. subtilis MUR1 es
un AL elevado que produce mutante UV seleccionado de B. subtilis 1A304
(U105MU331).
En este trabajo, describimos la Produccin de LA en lotes y fermentacin por lotes
alimentados por esta novela y compar su crecimiento y produccin de cido lctico
con su Cepa madre y otra cepa de B. subtilis (ATCC 6633). Adems, La posibilidad
de utilizar licor de maz para reemplazar parte se estudi el extracto de levadura en
el medio.
2. MTODOS
2.1. MICROORGANISMOS Y COMPOSICIN MEDIA

Se usaron tres cepas de B. subtilis productoras de L-LA. B. subtilis 1A304

(U105MU331) es una cepa recombinante que puede expresar eficientemente a-
amilasa, se proporcion por el Dr. Y.C. Leung (Universidad Politcnica de Hong Kong,
Departamento ABCT). B. subtilis MUR1 es un mutante UV de B. subtilis 1A304
(U105MU331). B. subtilis MUR1 se obtuvo exponiendo B. subtilis 1A304
(U105MU331) a la irradiacin UV a 254 nm y el cribado un gran nmero de colonias
supervivientes para la alta produccin de L lctico cido en frascos de agitacin con
caldo de infusin de corazn cerebral (Oxoid) Conteniendo 15 g / l de glucosa. B.
subtilis ATCC6633 se obtuvo de coleccin de cultivo microbiano del Politcnico de
Hong Kong Universidad. Las cepas se almacenaron en glicerol al 15% a 80C. MT
para preparacin de inculo contena: 20 g / l de glucosa, 30 g / l de martone, 20 g /
l de extracto de levadura, 6 g / l (NH4) 2SO4, 1,5 g / l de KH2PO4, 1,5 g / l de K2HPO4,
0,03 g / l de MgCl2, 0,08 g / l de MgSO _ {4} 7H _ {2} O y 2,3 ml / l solucin de
microelemento. La solucin de microelemento consisti en de 10,75 g / l de MgO, 2
g / l de CaCO3, 4,5 g / l de FeSO _ {4} 7H _ {2} O, 1,44 g / l de ZnSO _ {4} H2O, 1,12 g
/ l de MnSO _ {4} 7H _ {2} O, 0,25 g / l de CuSO _ {4} 5H _ {2} O, 0,28 g / H _ {2} O, H _
{3} BO _ {3} 0,06 g / l, 51,3 ml / l de HCl concentrado se esteriliz por filtracin).

El medio YE75 utilizado para la produccin de cido lctico consisti en: 75 g / L

extracto de levadura de grado industrial (Hy Yest 444, Kerry Ingredients (UK) Ltd.),
1,5 g / l de KH2PO4, 1,5 g / l de K2HPO4, 0,03 g / l de MgCl2, 0,08 g / l MgSO _ {4}
7H _ {2} O y 2,3 ml / l de solucin de microelemento. YE75 medio Se utiliz para la
comparacin de cultivos discontinuos, alimentados con cultivos discontinuos Y la
comparacin de las tres diferentes cepas de B. subtilis. YE50, YE50CSL25,
YE25CSL50 y CSL75, que se utilizaron para probar el reemplazo parcial o completo
del extracto de levadura con (CSL), contena 50 g / l de extracto de levadura, 50 g /
l de levadura Extracto + 25 g / l CSL, 25 g / l extracto de levadura + 50 g / l CSL y 75
g / l CSL, respectivamente. Los otros componentes del medio eran los mismos que
YE75 medio. Todos los medios con los fermentadores fueron esterilizados en
autoclave A 121C durante 20 min.
2.2. CRECIMIENTO BACTERIANO Y CONDICIONES DE FERMENTACIN DEL CIDO
LCTICO

El inculo se cultiv sobre placa de agar nutriente por rayado de un pequeo trozo
de material congelado e incubando a 37 C durante 24 h. la composicin del agar
nutritivo consisti en 3 g / l de extracto de carne, 5 g / l peptona y 15 g / l de agar.
El pH final del agar nutritivo fue de 6,8. UN de bacterias se inocul en un matraz de
1 litro que contena 100 ml MT y se incubaron a 37C, 270 rpm durante 15 h. Esta
semilla cultivo se inocul en 1 l Biostat B ms fermentadores con diferentes medios
de fermentacin. Las condiciones de cultivo para el lote y el lote alimentado fueron
37C, velocidad de agitacin de 50 rpm, y un flujo de aire de 3 l / min. El volumen de
trabajo fue de 800 ml. El pH se control con NaOH 10 M a 7,5. Se recogieron muestras
para medir el peso seco de las clulas, la glucosa y la concentracin de L-LA. Todos
los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
El cultivo en lotes se llev a cabo con concentracin inicial de glucosa de 200 g / l.
Tres cultivos discontinuos alimentados con glucosa inicial diferente
concentraciones de 150, 100 y 30 g / l. En lote alimentado Cultivos, se introdujo una
solucin de glucosa al 70% en el fermentador cuando la concentracin residual de
glucosa disminuy a 10 g / l. En el lote alimentado inicialmente con 150 g / l de
glucosa, se aliment 50 g / l de glucosa el fermentador despus de 24 h de
fermentacin. 70 y 50 g / l de glucosa se aadieron inicialmente al cultivo
alimentado con 100 g / l de glucosa a las 10 y 26 h de fermentacin respectivamente.
Para el alimentado inicialmente con 30 g / l de glucosa, se aliment glucosa
intermitentemente para mantener la concentracin de glucosa residual 10-30 g / l.
Se alimentaron 170 g / l de glucosa. Para los estudios de comparacin de diferentes
cepas de Bacillus y sustitucin de extracto de levadura con el licor de maz en el
medio, aliment los cultivos discontinuos usaron 30 g / l de glucosa.

2.3. MTODOS ANALTICOS

Se centrifug una muestra de cinco microlitros a 14.000 rpm durante 3 min; el

sedimento de clulas se lav con tampn de fosfato y secado a 100C hasta peso
constante para la determinacin de biomasa. La cantidad de glucosa y L-LA en el
sobrenadante se midi por un Analizador de Bioqumica (YSI 2700 SELECTTM). Alto
rendimiento cromatografa lquida (HPLC) equipado con un detector de UV se utiliz
para determinar la pureza ptica de la L-LA producida por B. Subtilis. Separaciones
se llevaron a cabo a 25C, utilizando un Astec CLC-L (15 cm 4,6 mm) columna
analtica. La fase mvil era 5 mM CuSO _ {4} con un caudal de 1 ml / min y el volumen
de inyeccin fue 20 ll. La deteccin de cido lctico se fij a 254 nm. D - ( ) lctico
cido y L - (+) - cido lctico como patrones.

3. RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1. CARACTERSTICA DE B. SUBTILIS MUR1 B. SUBTILIS MUR1
Se obtuvo exponiendo B. subtilis 1A304 (U105MU331) a irradiacin UV a 254 nm y
seleccin selectiva un gran nmero de colonias que crecen rpidamente y
sobreviven formadas Agar nutritivo, para la alta produccin de cido L-lctico en
frascos de agitacin con caldo de infusin de corazn cerebral (Oxoid) que contiene
15 g / l de glucosa. B. subtilis es una bacteria aerobia que tambin puede crecer bajo
condiciones no aireadas. Debido a que la aireacin se utiliza en este Produccin de
LA por B. subtilis, la biomasa microbiana formada Con un rendimiento de
conversin de glucosa del 49%. Recientemente, informaron que 105 g / l de L-LA
fueron producidos por B. subtilis CHl alsS de 10% de glucosa en 216 h de
fermentacin. B. subtilis MUR1 es un AL elevado que produce mutante UV
seleccionado de B. subtilis 1A304 (U105MU331). En este trabajo, describimos la
produccin de LA en lotes y fermentacin por lotes alimentados por esta novela y
compar su crecimiento y produccin de cido lctico con su cepa madre y otra cepa
de B. subtilis (ATCC 6633). Adems, la posibilidad de utilizar licor de maz para
reemplazar parte de que se estudi el extracto de levadura en el medio.
Durante el proceso es mucho mayor que los procesos que utilizan lactobacillus.
Mientras que la biomasa de los procesos de fermentacin de Lactobacillus
produccin de LA oscil entre 2 g / l y 15 g / l en, la biomasa de B. subtilis ATCC6633
y B. Subtilis MUR1 alcanz 29,5 y 59,1 g / l en este estudio, respectivamente. La
formacin L-LA es el objetivo principal ms que el crecimiento celular, pero mejorar
la tasa de crecimiento celular y junto con alta densidad celular tambin es un medio
para mejorar la produccin de cido lctico. La pureza ptica de la L-LA producida
por B. subtilis MUR1 determinada por HPLC, fue del 99,5%. Se sabe que la ptica la
pureza de la produccin de LA en Lactobacillus spp no es 95%, y el 5% de impureza
quiral de la L-LA puede aumentar el costo de purificacin. B. subtilis MUR1
representa una alternativa obteniendo L-LA pura ptica.

3.2. FERMENTACIN COMPARATIVA EN CULTIVO DISCONTINUO Y EN LOTES

ALIMENTADOS USANDO B. SUBTILIS MUR1

Una serie de estudios sobre los nutrientes necesarios para la produccin de LA han
informado de que la mayor cantidad de fuentes de nitrgeno suplementado, la
mayor concentracin de LA podra obtenerse. Nuestros estudios tambin han
demostrado que la cantidad de L-LA producido por B. subtilis aumenta con la
concentracin de levadura extraer en el medio (datos no mostrados). Con el fin de
maximizar se utiliz la produccin de L-LA, 7,5% de extracto de levadura industrial
en el medio de fermentacin.
El cultivo por lotes se ha utilizado de manera industrial para L-LA produccin. Las
concentraciones iniciales de glucosa tan altas como 200 g / l fueron utilizado en
algunas fermentaciones de escala industrial LA. Estudios cinticos sobre la
inhibicin del sustrato en la produccin de LA mostr que la concentracin final de
LA aument con el aumento de la concentracin de glucosa hasta 200 g / l. Sin
embargo, la presin osmtica causada por una alta concentracin inicial de glucosa
puede tener un valor negativo efecto sobre la productividad LA. En el presente
estudio, un cultivo discontinuo con concentracin inicial de 200 g / l de glucosa se
compar con tres cultivos discontinuos alimentados con diferentes concentraciones
de glucosa (150, 100 y 30 g / l). La fermentacin las condiciones fueron 37 C, pH
controlado a 7,5, velocidad de agitacin de 50 rpm y flujo de aire de 3 vvm. como se
muestra en la Fig. 1a, hubo una fase de retardo de 4 h en el lote cultura. La
concentracin de glucosa disminuy de 200 g / l a 42 g / l en 52 h (figura 1d). El
cultivo discontinuo alimentado con una glucosa inicial concentracin de 150 g / l de
glucosa consumida completamente despus de 24 h de cultivo y 50 g / l de glucosa.
Para la cultura alimentada por lotes con una concentracin inicial de glucosa de 100
g / l, la glucosa se utiliz completamente en 10 h, 70 y 50 g / l de glucosa fueron
aadido a las 10 y 26 h de cultivo, respectivamente. Para el alimentado con una
concentracin inicial de glucosa de 30 g / l, la glucosa se aliment
intermitentemente para mantener la glucosa residual concentracin a 10-30 g / l
(figura 1d). Se alimentaron 170 g / l de glucosa.
Las velocidades de crecimiento especficas mximas de los cultivos discontinuos
alimentados fueron similares (0,41-0,49 h 1), pero superior al mximo (0,17 h1) del
cultivo discontinuo (Tabla 1). Despus 12 h de cultivo, la biomasa de los cultivos
discontinuos alimentados fue mayor que el cultivo discontinuo (figura 1a). A las 52
h, el lote alimentado cultivo con una concentracin inicial de glucosa de 30 g / l,
Biomasa final mxima (55,2 g / l), el cultivo discontinuo y los otros dos cultivos
discontinuos alimentados tenan una biomasa final similar (34,2-36,2 g / l)
Despus de 52 h de fermentacin (Tabla 1), el cultivo discontinuo producido 143,2
g / l de L-LA con un rendimiento de L-LA de 90,3% y una productividad global de L-
LA De 2,75 g / l / h. El cultivo discontinuo alimentado con una glucosa inicial una
concentracin de 150 g / l produjo 137,7 g / l de L-LA, con 75% de L-LA Y una
productividad global de L-LA de 2,65 g / l / h. El lote alimentado Cultivo con una
concentracin inicial de glucosa de 100 g / l, producida 145,5 g / l de L-LA con un
rendimiento L-LA del 84,2% y una productividad L-LA global De 2,8 g / l / h. El
cultivo alimentado en lotes con una concentracin inicial de glucosa De 30 g / l,
produjo 183,2 g / l de cido lctico con un rendimiento 98,5% y una productividad
L-LA global de 3,52 g / l / h. Comparando el cultivo discontinuo y los tres cultivos
alimentados en lote, El cultivo discontinuo alimentado con una concentracin inicial
de glucosa de 30 g / L produjo la concentracin ms alta (183,2 g / l) de L-LA, (3,52
g / l / h) y mxima (16,1 g / l / h). Se produjeron 99,3 g / l de L-LA despus de 12 h
de cultivo (figura 1b). la menor productividad de los otros cultivos alimentados por
lote y cultivo discontinuo Podra haber resultado de la alta presin osmtica causada
por la Concentracin inicial de carbohidratos. Por encima de una concentracin
crtica de sustrato, La actividad reducida del agua combinada con la plasmlisis
Causa una disminucin en la tasa de fermentacin y utilizacin del azcar. Utilizando
un nivel bajo de la glucosa inicial y la alimentacin durante la fermentacin, la
inhibicin efectos de la glucosa en la produccin de L-LA y el proceso la eficacia se
ha mejorado mucho. Los resultados del cultivo discontinuo en este estudio estn
entre los ms altos cuando se compara con los informes publicados de produccin
de cido lctico Por cultivos discontinuos de bacterias de cido lctico. Los mejores
resultados con glucosa como sustrato fue de 150,2 g / l de LA con 100% de LA
Utilizando bacterias de cido lctico.

3.3. COMPARACIN DE LA PRODUCCIN DE B. SUBTILIS MUR1, B. SUBTILIS 1A304

(U105MU331) Y B. SUBTILIS ATCC6633

El cultivo en lote de la Fed con la concentracin inicial de glucosa de 30 g / l para la

comparacin de las tres cepas. Las condiciones de fermentacin fueron 37C, pH
controlado a 7,5, agitacin, velocidad de 50 rpm y flujo de aire de 3 vvm. B. subtilis
ATCC6633, fue capaz de crecer y producir L-LA en YE75 medio. Esta cepa tena
aproximadamente 3 h de fase de retardo y creci exponencial de 3-12 h, utilizando
la glucosa y el extracto de levadura en el medio (figura 2a). La mayor productividad
de L-LA fue durante la fase de crecimiento exponencial. Una productividad mxima
de 2,84 g /L / h a las 10-12 h, la tasa de crecimiento especfico (l) fue de 0,15 h 1
(Fig. 2a, c). Despus de 12 h de cultivo, la produccin de L-LA se estabiliza. B. subtilis
1A304 (U105MU331), el progenitor de B. subtilis MUR1, mostr una produccin
sostenible de L-LA durante la fermentacin de 52 h. Aunque la biomasa de B. subtilis
1A304 (U105MU331) fue la ms baja de las tres cepas (figura 2a), la concentracin
final de L-LA producido por B. subtilis 1A304 (U105MU331) fue 90,4 g / l con un
rendimiento de 96,8% (Tabla 2). La productividad general de L-LA (MP) fue 1,74 y
la mxima productividad fue 3,17 g / l / h a 10 - 12 h. Durante la fase de crecimiento
exponencial, B. subtilis 1A304 (U105MU331) produjo 50,6 g / l de L-LA, que fue el
56% de la final concentracin. En la fase estacionaria, la productividad L-LA
disminuy Mientras que la cantidad de glucosa consumida aument de 41% a 59%
Lo que podra indicar que el mantenimiento celular consume ms glucosa. Este
resultado sugiere que la produccin de L-LA por B. subtilis 1A304 (U105MU331)
est predominantemente asociada al crecimiento. Los resultados son consistentes
con los obtenidos en estudios previos describiendo la produccin de cido lctico
por Lactobacillus.
Hubo diferencias notables entre el mutante B. subtilis MUR1 y el gen B. subtilis
1A304 (U105MU331) en biomasa, produccin de L-LA y productividad. B. subtilis
MUR1 produjo 183,2 g / l de cido lctico despus de 52 h de fermentacin, un 2
veces en comparacin con su matriz (Cuadro 2). El mximo se obtuvo una
productividad de 16,1 g / l / h a las 5 h durante la exponencial con una tasa mxima
de crecimiento especfico de 0,48 h ^ {1} (Tabla 2). B. subtilis MUR1 produjo 99,3 g
/ l de L-LA (la mitad de la concentracin final) dentro de 12 h con una productividad
de 8,0 g / l / marido. Al mismo tiempo, B. subtilis MUR1 mostr un mayor
crecimiento celular velocidad de 2,97 g / l / h en las 12 h iniciales, y disminuida a
0,48 g / l / h en el resto de la fermentacin. Al final de la fermentacin, la biomasa
fue de 59,1 g / l, un aumento de 2 veces en comparacin con el parent B. subtilis
1A304 (U105MU331). Esto sugiere que la mejora de la tasa de crecimiento celular y
la biomasa podra ser importante durante la optimizacin de la produccin de LA
por B. subtilis. Hay algunos informes sobre la produccin de LA por B. subtilis.
informaron que los cultivos aerbicos de B. subtilis JCM 2152 produjo 3,7 g / l de LA
con un rendimiento de conversin de glucosa del 49%. mostraron que B. subtilis
CH1ssS produjeron 105 g / l de L-LA despus de 216 h de fermentacin. La
concentracin final de L-LA de 183,2 g / l producida por B. subtilis MUR1 en este
estudio, con el valor de productividad total de 3,52 g / l / h, se compararon
favorablemente con los de Lactobacillus. coagulans y otras especies de B. subtilis y
en muchos casos superan el desempeo de los procesos informados anteriores.

3.4. SUSTITUCIN DE PARTE DEL EXTRACTO DE LEVADURA EN EL MEDIO CON

MAZ PICADO ESPRITU
El extracto de levadura es la principal fuente de nitrgeno en la produccin medio
en este estudio; Tambin es una importante fuente de nitrgeno el crecimiento y la
produccin de LA por la bacteria Lactobacillus. Sin embargo, para la produccin de
productos qumicos bsicos como LA, utilizando alta concentracin de extracto de
levadura no es rentable, ya que se estima que contribuye a ms del 30% de la
produccin total costo de LA. Por lo tanto, el efecto de reemplazar parte o extracto
de levadura con licor de maz. Se utilizaron cultivos de lotes alimentados con glucosa
inicial de 30 g / l en este experimento. Las condiciones de fermentacin fueron 37C,
pH controlado a 7,5, velocidad de agitacin de 50 rpm y flujo de aire de 3 vvm. el
medio YE50CSL25 contena 25 g / l de licor de maz y 50 g / l extracto de levadura.
En 52 h de fermentacin, la produccin de L-LA el medio YE50CSL25 era 156,4 g / l,
15,0% menor que el YE75 medio pero un 17% mayor que el medio YE50 (50 g / l de
extracto de levadura). Con el medio YE25CSL50, que reemplaz 50 g / l extracto de
levadura en medio YE75 con 50 g / l de licor de maz, se obtuvieron 144,8 g / l de L-
LA despus de 52 h de fermentacin, 21,0% inferior a la del medio YE75. Adems, la
biomasa del medio CSL fue aproximadamente 35% menor que la de la YE75 medio.
Con el medio CSL75, el extracto de levadura fue completamente reemplazado por 75
g / l de licor de maz. Sin levadura en el medio, la tasa de crecimiento especfico
mximo de las clulas fue mucho ms bajos (Tabla 3]. 113,9 g / l de L-LA se produjo
en 52 h y slo se obtuvo 11,5 g / l de biomasa. Estos resultados que cantidades
similares de extracto de levadura soportado ms clulas crecimiento que el licor de
maz, lo que mejora la produccin de LA. Sin embargo, las productividades mximas
de L-LA en los cuatro conteniendo levadura fueron similares, aunque las
productividades de L-LA fueron menores con menor concentracin de levadura
extraer en los medios de comunicacin. El medio CSL75 (sin extracto de levadura)
la menor productividad general de L-LA y la productividad mxima de L-LA. Kadam
et al. (2006) tambin informaron que el licor de maz una alternativa al extracto de
levadura, pero se requiere en cantidades ms altas.
4. CONCLUSIONES

B. subtilis MUR1 es un mutante que puede producir 99,3 y 183,2 g / l de cido L-

lctico en 12 y 52 h respectivamente con un sustrato al 98,5% rendimiento de
conversin. En comparacin con el cultivo discontinuo, el lote alimentado cultivo de
B. subtilis con 30 g / l de glucosa inicial mostr 41,1% mejora en el peso seco celular
y mejora del 41,1% en L-LA productividad, y tambin hubo un aumento de 2,5 veces
en la productividad de L-LA.

EFECTOS DEL LICOR DE MAZ SOBRE LA PRODUCCIN DE 2,3-BUTANODIOL Y

ACETONA POR BACILLUS SUBTILIS

La concentracin inicial de licor de maz (CSL) tiene notables efectos sobre la

produccin de 2,3-butanodiol (2,3-BD) y acetona (precursor metablico), pero
tambin sobre la proporcin de 2,3-BD a acetoin. Cuando se suplement la
concentracin elevada de CSL, se mejor el crecimiento celular, se estimul la
acetoin reductasa (ACR), la concentracin de 2,3-BD aument en un 78,6%, la
acetoin disminuy en un 61,9% y se increment la relacin de 2,3-BD a acetoin Por
3,69 veces. El gen acr, que codifica ACR, se sobreexpres en Bacillussubtilis. En
comparacin con el control (cepa parental), los bajos niveles de CSL en la cepa
modificada incrementaron la concentracin de 2,3-BD y la relacin de 2,3-BD a
acetoin en un 13,9% y 39,5%, respectivamente, y disminuyeron el ttulo de acetona
en un 18,3%. La acetoin se convirti en un producto principal bajo niveles bajos de
CSL. Adems, se construy una cepa knockout que porta una mutacin de insercin
acr :: cat. Como era de esperar, la prdida de actividad de ACR condujo a una
acumulacin de acetoin en los sobrenadantes de cultivos mutantes acr :: cat.
Adicionalmente, la productividad de acetoin fue mejorada por alta concentracin de
CSL. Los resultados anteriores demuestran la viabilidad de utilizar B. subtilis para la
produccin no slo de 2,3-BD sino tambin de acetoin como producto principal.

1. INTRODUCCIN
El 2,3-butanodiol (2,3-BD), que es una sustancia qumica importante y un
combustible lquido, puede derivarse de la biotransformacin de recursos naturales.
Debido al gran nmero de aplicaciones industriales y al potencial de disminuir
nuestra dependencia del suministro de petrleo para la produccin de plataformas
qumicas, ha aumentado el inters por el proceso de produccin de 2,3-BD [3,4]. Una
de las aplicaciones ms importantes de 2,3-BD es su deshidratacin para formar
metiletil cetona, que se utiliza como un aditivo de combustible lquido. Adems, el
producto de la deshidrogenacin 2,3-BD, el diacetilo, puede servir como un agente
aromatizante altamente valorado en los productos alimenticios, dando un
butterytaste. El 2,3-BD es tambin un aditivo de combustible potencialmente valioso
con un valor de calentamiento de 27,198 Jg-1, que se compara favorablemente con
otros combustibles lquidos (por ejemplo metanol 22,081 Jg-1, etanol 29,055 Jg-1).
Variedades de especies como Bacillus polymyxa, Serratia marcescens, Klebsiella
oxytoca y Klebsiella pneumoniae produce altos ttulos de 2,3-BD a partir de un
amplio espectro de sustratos.
Sin embargo, el principal inconveniente para el uso de estos microbios
fermentadores de 2,3-BD eficientes es su naturaleza patognica. Debido a las
regulaciones de seguridad, el uso de estos microorganismos no es aceptable para la
fermentacin a escala industrial.
Bacillus subtilis es una bacteria Gram-positiva que ha sido asignada GRAS
(generalmente reconocido como seguro) por la Administracin de Alimentos y
Medicamentos de los Estados Unidos. La bacteria est bien caracterizada y se
dispone de informacin gentica sustancial para diversas manipulaciones genticas.
El 2,3-BD se produce a partir de piruvato en un proceso de fermentacin cida amiga
que implica varios compuestos intermedios, tales como acetato y acetona.
Catalizado por acetolactate sintasa, el acetolactato se forma in vivo por
acoplamiento de dos molculas de piruvato con la liberacin concomitante de
dixido de carbono. Descarboxilacin por acetolactato descarboxilasa produce ace-
toin, que puede ser reducido por acetoin reductasa (ACR, codificado por el gen acr)
para crear 2,3-BD. B. subtilis es un fermentador mixto cido, convirtiendo as el
piruvato en lactato, acetato, succinato, acetoin, y 2,3-BD, como los productos finales
fermentativos.
En nuestro estudio actual, B. subtilis 168 se emple para la produccin de 2,3-BD.
La concentracin inicial de licor de maceracin de maz (CSL) tiene efectos notables
no slo en la produccin de 2,3-BD y acetoin (precursor metablico), sino tambin
en la relacin de 2,3-BD a acetoin. La cetona fue un ingrediente principal en el caldo
y la proporcin de 2,3-BDto acetoin (BD / AC) fue de slo 0,45 bajo niveles bajos de
CSL. En esto estudio, se discuti la relacin entre el CSL y la relacin de 2,3-BD a
acetoin en detalle.
Fig. 1. Va metablica de la produccin de 2,3-butanodiol a partir de glucosa

2. MATERIALES Y MTODOS
2.1. CEPAS BACTERIANAS Y PLSMIDOS
Todas las cepas bacterianas y plsmidos utilizados y construidos en este estudio se
describen en la Tabla 1. El gen acr que codifica acetoinductasa fue clonado de B.
subtilis 168. Se us Escherichia coli JM109 como husped de clonacin para los
derivados recombinantes del E. Coli / B. Subtilis vector plsmido vector pMA5-
HapII. Este vector de lanzadera se us para introducir el casete de hiper-expresin
para acrinto B. subtilis 168, que era la cepa parental de reproduccin en este estudio.
2.2. CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO BACTERIANOS

Se desarrollaron trenes de B. subtilis en medio lquido que contena triptona al 1%,

extracto de levadura al 0,5% y NaCl al 1%. El antibitico utilizado para la seleccin
y el crecimiento de los transformantes de B. subtilis fue kanamicina, con una
concentracin de 50 g / ml. Los cultivos de E. coli se cultivaron en medio Luria-
Bertani (LB). Los transformantes de E. coli se seleccionaron en placas de agar LB que
contenan 100 g / ml de ampicilina.

2.3. CONSTRUCCIN DEL PLSMIDO

Se utilizaron procedimientos estndar o instrucciones del fabricante para los
experimentos de clonacin molecular. Los reactivos de PCR, restriccin de enzimas
y fosfatasa alcalina intestinal de becerro fueron adquiridos a TaKaRa Biotechnology
Co., Ltd. El kit Miniprep y el kit GelExtraction se adquirieron en Promega. La Tabla 1
enumera los cebadores usados para la clonacin gnica. El gen acr se amplific a
partir de los cebadores P1 y P2 del DNA genmico de B. subtilis 168. El gen acr se
clon entonces en el gen BamHI / NdeI de pMA5-HapII para construir pACR (Figura
S1). El gato gentico se amplific mediante PCR utilizando los cebadores P3 y P4 del
plsmido pACYCDuet. El fragmento de ADN purificado se clon en el vector pMD18-
T para crear T-cat. La inactivacin de la insercin del gen acr se llev a cabo como
se describe por Nicholson, y la transformacin de B. subtilis se realiz como se
describe por Anagnostopoulos y Spizizen.
2.4. CONDICIONES DE CULTIVO

El medio de precultivo fue un caldo nutriente que contena 40 g / l de glucosa, 10 g

/ l de peptona, 5 g / l de extracto de levadura, 10 g / L de NaCl. El caldo se esteriliz
a 121 C durante 15 min. La produccin de 2,3-BD requiri la siguiente composicin
de medio: 100 g / L de glucosa, 0-50 g / L de licor de maz, 5 g / l de citrato de amonio,
3 g / L de K2HPO4, 0,3 g / L de MgSO4.7H2O, 0,05 g / L de FeSO _ {4} \ cdot 7H _ {2}
O, 0,6 g / l de cido succnico, pH 6,5. Los componentes principales del licor de
maceracin de maz se enumeran en la Tabla 2. El cultivo de siembra se cultiv en
un matraz de agitacin de 250 ml durante 10 h, con agitacin (160 rpm, agitador
recproco) a 37C. Para los experimentos de flase, se utilizaron 2 ml del cultivo de
siembra para inocular 50 ml de medio de fermentacin (en frascos de 250 ml). Los
matraces se incubaron a 37C en un agitador recproco a 180 rpm. Las
fermentaciones discontinuas se llevaron a cabo en un biorreactor de 5 litros, con un
medio inicial de 2,6 L. El cultivo se llev a cabo a 37C, agitando a 350 rpm, con Un
flujo de aire de 0,66 vvm. Se recogieron muestras peridicamente para determinar
las concentraciones de biomasa, glucosa y diol.

2.5. ENSAYO DE REDUCTASA DE ACETONA

Para ensayar cuantitativamente la actividad de ACR, se cultivaron cultivos

triplicados de cepas de B. subtilis 168 (ACR y acr :: cat) durante 48 ha 37C en medio
LB que contena 5% de glucosa. La preparacin de ACR y su ensayo de actividad se
realizaron de acuerdo con los mtodos previamente reportados.

2.6. DETERMINACIN DE LAS CONCENTRACIONES DE NAD + Y NADH

Las concentraciones intracelulares de NAD + y NADH se determinaron mediante

procedimientos descritos en estudios previos. Los piridinenucletidos (NAD (H)) se
ensayaron en diferentes extractos debido a que la extraccin de cido (pH 1,1)
destruy la forma reducida (NADH) y la extraccin alcalina (pH 12,4) de la forma
oxidada (NAD +) de los nucletidos de piridina. Debido a la posible interferencia de
los componentes reductores en los extractos alcalinos y la menor estabilidad del
NADH, se redujo la muestra de nucletidos de piridina (2 ml) convertida a la forma
oxidada por la accin de 5 ml de glutamato deshidrogenasa (2 mg / ml) en presencia
de 50 ml de 2-oxoglutarato (0,1 M, solubilizado en NH4Cl 0,2 M). Las reacciones se
prolongaron durante 20 min a 25C y se terminaron con 100 mL de HCl 1 M a 50C
durante 5 min. Despus de enfriar a 0C, los extractos de nucletidos se
neutralizaron a pH 7,2-7,4 con KOH 5M. La concentracin de NADH o NAD + en el
sobrenadante se determin por el mtodo de ensayo de ciclo enzimtico. La mezcla
de ensayo contena 2 ml de tampn (0,15 mol / L de glicilglicina / cido nicotnico,
pH 7,4), 400 L de etil sulfato de fenaninio (PES, 4 mg / ml), 400 L de tiazolil azul
(MTT, 5 mg / ml ), Etanol 70 l, y 40 Lalcohol deshidrogenasa (80 U / ml). La reaccin
se inici por adicin de 50 ml de cido o extractante alcalino. La absorcin a 570 nm
se sigui durante 8 min. Comparando la pendiente de absorcin con el tiempo de
reaccin con curvas estndar, se determinaron los ttulos de NADH y NAD + en el
sobrenadante y se calcul el contenido intracelular de los mismos. Los ensayos se
realizaron por triplicado.
2.7. MTODOS ANALTICOS

La concentracin de masa celular se determin midiendo el OD a 600 nm en un

sistema de espectroscopia UV-vis (UV-2000, UNICO). El peso seco celular (DCW) se
calcul a partir de la densidad ptica utilizando la curva de calibracin para la cepa.
La composicin del caldo de fermentacin se analiz en un sistema de cromatografa
lquida de alto rendimiento (HPLC) Agilent 1200 (Agilent Corp., EE.UU.) con un
detector de ndice de refraccin RID-10A. Las fases estacionaria y mvil fueron
Waters SugarPak1 (6,5 mmid x 300 mm, Waters, EE.UU.) y ddH2O (caudal de 0,5 ml
/ min), respectivamente. La temperatura de la columna se control a 30C. Todos
los experimentos fueron repetidos al menos tres veces.

3. RESULTADOS
3.1. EFECTOS DE LAS FUENTES DE NITRGENO ORGNICO SOBRE LA
PRODUCCIN DE 2,3-BD POR B. SUBTILIS 168

Las influencias de las fuentes de nitrgeno orgnico (extracto de levadura,

beefextract, peptona de soja y licor de maz) en el crecimiento celular, ace-toin y 2,
3-BD, fueron observados. Como se muestra en la Tabla 3, entre las fuentes de
nitrgeno orgnico investigadas, el extracto de levadura (YE) y el licor de
maceracin de maz (CSL) afectaron significativamente la masa celular, la
produccin de 2,3-BD y la relacin de 2,3- BD a acetoin (BD / C.A). Con un aumento
de la concentracin de YE o CSL, la concentracin de ace-toin (precursor de 2,3-BD)
disminuy, y la concentracin de 2,3-BD, as como la relacin BD / AC, aument. Esto
demostr que YE y CSL podran promover la conversin de acetoin a 2,3-BD. En
contraste con las pruebas realizadas con niveles bajos de YE (5 g / L) o CSL, niveles
altos de YE o CSL (25 g / L) causaron una disminucin en la concentracin de acetoin
en 33,5% y 34,8%, respectivamente. Al mismo tiempo, el BD / ACratio aument en
2,01 veces y 1,96 veces, respectivamente. As, se observ un rendimiento y una
productividad mejorados de 2,3-BD. Tanto YE como CSL presentan ventajas
econmicas obvias sobre otras fuentes de nitrgeno orgnico, tales como extracto
de carne y sopeptone. Sin embargo, el licor esmerilado de maz ofrece un
componente de medios estimulantes y de bajo costo para la produccin de 2,3-BD.
Por lo tanto, en este estudio, el licor de maceracin de maz se seleccion como la
fuente de nitrgeno buena para la produccin a gran escala de 2,3-BD.

3.2. LOS EFECTOS DE LA CONCENTRACIN DE CSL SOBRE LA PRODUCCIN DE 2,3-

BD POR B. SUBTILIS 168

se observaron en detalle variando las concentraciones iniciales de CSL de 0 a 50 g

/l. Como se muestra en la Tabla 4, la produccin de 2,3-BD se mejor notablemente
en presencia de CSL. A medida que aumentaba la concentracin de CSL, el
rendimiento de 2,3-BD y la relacin BD / AC aumentaron significativamente. En
comparacin con los ensayos libres de CSL, una concentracin inicial de CSL de 50 g
/ L dio lugar a una duracin acortada (96-54 h), un aumento de 2,69 veces en la
concentracin de 2,3-BD, un 61,8% de disminucin de inacetoin y un 8,7 veces ms
en la relacin BD / AC. Se realizaron pruebas de produccin de 2,3-BD, con CSL de 0
y 50 g / L, y sus cinticas se muestran en la Fig. 2a yb, respectivamente. En ambas
condiciones, los perfiles de tiempo de la formacin de 2,3-BD eran similares a los del
crecimiento celular. En ausencia de CSL (Fig. 2a), las primeras 32 h mostraron un
lento aumento tanto en la produccin de biomasa como de 2,3-BD, mientras que la
acetona se acumulaba a una velocidad mayor que la 2,3-BD. Posteriormente, una
clula rpida El crecimiento se observ junto con un rpido aumento en los ttulos
de 2,3-BD y acetoin. Sin embargo, la concentracin de 2,3-BD fue mucho menor que
la de acetoin a lo largo de todo el proceso. Por lo tanto, la relacin BD / AC fue de
slo 0,84 al final de la fermentacin. Cuando la concentracin de CSL era de hasta 50
g / l (Figura 2b), la concentracin de 2,3-BD era consistentemente mayor que la de
acetona, y la concentracin de acetoin se mantuvo en niveles bajos durante todo el
proceso. Significativamente, la proporcin BD / AC se elev hasta 2,53 al final de la
fermentacin. Acetoin reductasa (ACR) cataliza la conversin de acetoin a 2,3-BD
[19], y se observ que la actividad de ACR fue estimulada por altos niveles de licor
cornsteep. In vivo ACR actividad, a 50 g / L CSL, fue 6,57 veces superior a la
observada en ausencia de CSL (Tabla 5]. Los resultados indicaron que altos niveles
de CSL estimularon la actividad de la ACR, lo que condujo al metabolismo mejorado
de acetoin a 2,3-BD.

3.3. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LICOR DE MAZ EN LAS

CONCENTRACIONES INTRACELULARES DE NADH Y NAD +

Un mol de acetoin se convierte en un 2,3-BD equimolar en presencia de ACR con la

oxidacin concomitante de NADH a NAD + [22]. Como se muestra en la Fig. 3, las
concentraciones intracelulares de NADH y NAD + en B. subtilis fueron afectadas
significativamente por las concentraciones iniciales CSL. Durante las diversas etapas
de la fermentacin discontinua, los niveles intracelulares de NADH y NAD + fueron
menores cuando se suplementaron los niveles elevados de CSL (Figuras 3a yb).
Correspondientemente, se observ un aumento en la concentracin de CSL para
disminuir la relacin de NADH / NAD + y estimular la actividad de ACR (Figura 3c y
Tabla 5). Los resultados anteriores indican que los altos niveles de CSL estimularon
la actividad de la ACR, lo que condujo al metabolismo mejorado del NADH
intracelular al NAD +. Las concentraciones intracelulares de NADH y NAD +
fluctuaron durante varias etapas de la fermentacin discontinua (Fig. 3a yb), y los
niveles de NADH y NAD + disminuyeron durante las fases de crecimiento y
permanecieron constantes durante las fases sin crecimiento.

3.4. EFECTOS DEL LICOR DE MAZ SOBRE LAS REDISTRIBUCIONES

Del flujo metablico en el metabolismo de la glucosa, el 2,3-bd juega un papel

importante en la oxidacin del nadh. 2,3-bd compite con los productos finales de
piruvato derivados de las vas (como el cido lctico, cido succnico y etanol) para
nadh [3]. como se ha descrito anteriormente, se observaron altos niveles de csl para
estimular la actividad de acr. a su vez, la actividad de acr estimulada potenci el
metabolismo del nadh intracelular a nad +. para caracterizar las flexibilidades
metablicas de b. subtilis en respuesta a la introduccin de csl (utilizado como
fuente de nutrientes), las concentraciones de los principales metabolitos (2,3-bd,
acetoin, lactato, acetato y succinato) se determinaron en ausencia y presencia de 50
g / l de csl. como se muestra en la tabla 6, altos niveles de csl (50 g / l) produjeron
ms 2,3-bd y menos acetoin en b. subtilis. esto result de un aumento en la actividad
de la acr, que fue estimulada por mayores niveles de csl. la produccin de acetato en
cualquier condicin fue comparable. sin embargo, las concentraciones de lactato y
succinado disminuyeron cuando se usaron altos niveles de csl. las concentraciones
de lactato y succinato fueron 16,7% y 29,6% inferiores a los resultados obtenidos
en ausencia de csl.

3.5. PRODUCCIN MEJORADA DE 2,3-BD POR INGENIERA B. SUBTILISSTRAIN ACR

El gen que codifica ACR, acr, de B. subtilis 168 se identific, se clon e insert en el
vector de expresin pMA5-HapII de alta copia. El plsmido pACR, que alberga el gen
acr, se transform en B. subtilis 168, generando la cepa mutante, B. subtilis ACR
(Tabla 1). Debido a la sobreexpresin exitosa de ACR, se observaron mejoras en 2,3-
BD Formacin e inhibicin de la acumulacin de acetona en la cepa de ACR diseada
(Tabla 7). La concentracin de CSL tambin afect la produccin de ACR, 2,3-BD y el
crecimiento celular del ACRstrain. Cuando se suplementaron 30 g / L de CSL, la
concentracin de 2,3-BD y la relacin BD / AC casi alcanzaron sus valores mximos.
Se compararon los resultados obtenidos de la cepa WT y mutante, ambos
suplementados con 30 g / L de CSL . En la cepa mutante, observamos un 27,8% y un
aumento de 1,54 veces (de los resultados de WT) en la concentracin de 2,3-BD y la
relacin BD / AC, respectivamente. Tambin se observ un descenso del 49,6% en
el ttulo de acetoin. Adems, los mejores cultivos de la cepa ACR (Tabla 7)
presentaron mejores resultados que los obtenidos del cultivo WT suplementado con
50 g / L CSL (Tabla 4). Los perfiles de tiempo que ilustran el crecimiento celular de
las cepas ACR y 168, ambos suplementados con 30 g / l de CSL, eran comparables
(Figura 4a). Como se muestra en la Fig. 4b, se observ que 2,3-BD y acetoin se
acumularon lentamente y no se observ diferencia entre las cepas manipuladas y
parentales antes de las 24 h. Despus de 24 h, ambas cepas comenzaron a crecer
rpidamente otra vez; Y una produccin ms rpida de 2,3-BD, una acumulacin de
acetoin ms lenta, y un mayor aumento en la relacin BD / AC, se observ en la cepa
ACR.

3.6. LOS EFECTOS DE LA CONCENTRACIN DE LICOR DE ESPUTO DE MAZ EN LA

PRODUCCIN DE ACETOIN POR LA CEPA ACR :: CAT

Fragmentos internos a las secuencias codificantes de acr se amplificaron mediante

PCR, se clonaron en el plsmido de integracin pMD-18T y se transformaron en el
cromosoma de la cepa de tipo salvaje B. Subtilis168. Este procedimiento gener la
cepa mutante B. subtilis acr :: cat (Tabla 1). Como se muestra en la Tabla 5, se
encontr que la actividad de ACR era mucho menor en la cepa mutante (acr :: cat)
que en la cepa WT (168 ). Invivo, se prev que la prdida de actividad de ACR
conduzca a una acumulacin del precursor metablico, acetoin. Los resultados
mostraron claramente que la cepa WT produjo principalmente 2,3-BD (Tabla 4),
mientras que la cepa mutante produjo principalmente acetoin (Tabla 8). Se observ
que las concentraciones de ace-toina eran mucho mayores en el sobrenadante de
cultivos mutantes que en los cultivos de la cepa de tipo salvaje. Se detect una
pequea cantidad de 2,3-BD en cultivos fase-estacionaria del mutante acr :: cat. Esto
sugiere una menor actividad de ACR, que a su vez, indica la existencia de un segundo
gen que codifica ACR. Adems, la actividad ACR menor tambin se estimul que se
suplementaron altos niveles de CSL; Y esto tambin condujo a una mejora en la
produccin de 2,3-BD. Al mismo tiempo, el crecimiento celular mejorado, la tasa de
consumo de glucosa y la productividad de ace-toin se observaron cuando se
observaron niveles altos de CSL para la cepa mutante acr :: cat.

4. DISCUSIN

En fermentaciones microbianas, los costos de produccin dependen principalmente

del costo de la fuente de nitrgeno y carbono. Por lo tanto, una fuente de nitrgeno
apropiada es crucial para mejorar la eficiencia, la productividad y la reduccin de
costos en el proceso de fermentacin. Esto se debe a la fuerte influencia que
mediaholdholds contenido en la concentracin del producto, el rendimiento, y las
condiciones de crecimiento celular. El licor de esputo de maz (CSL) es un
subproducto importante de la industria de molienda de maz y es una fuente de
nutrientes de bajo costo disponible en gran escala. La composicin depende del
mtodo de preparacin, pero generalmente es una rica fuente de nitrgeno,
vitaminas solubles en agua, aminocidos, minerales y otros estimulantes del
crecimiento. Un desglose del costo medio sugiere que CSL es un medio rentable para
la fermentacin. CSL se ha utilizado como una fuente adicional de nutrientes
microbianos esenciales para una variedad de propsitos, incluyendo la produccin
de etanol por Zymomonasmobilis o Pichia stipitis, y el cido succnico por
Anaerobiospir-illum succiniciproducens. CSL tiene un efecto significativo No slo en
la produccin de 2,3-BD y acetona, sino tambin en la proporcin de 2,3-BD a
acetoin (BD / AC) en B. subtilis. Aunque CSL se ha utilizado para mejorar la
fermentacin 2,3-BD por K. pneumoniae, se conoce poca informacin sobre la
relacin entre CSL y la relacin BD / AC. La aplicacin ms importante de CSL en
microbiologa hasta el momento, fue descubierta por Moyer y Coghill, que not que
la adicin de CSL a una solucin modificada Czapek-Dox de sales minerales aument
en gran medida los rendimientos de penicilina. Este descubrimiento estimul
muchos esfuerzos para aislar el componente activo, lo que da a CSL la notable
capacidad de estimular la biosntesis de penicilina en organismos del grupo
Penicillium notatumchrysogenum. De acuerdo con estudios sobre el metabolismo
de estos organismos, la funcin biolgica del licor no puede atribuirse a un solo
factor, sino a un grupo de factores. Como resultado, tales intentos no tuvieron xito.
Este efecto estimulante fue probablemente causado por nutrientes microbianos
esenciales presente en CSL. Tales nutrientes aumentaron la concentracin celular y
estimularon la produccin de 2,3-BD, debido a que la produccin de 2,3-BD est
parcialmente asociada al crecimiento. Cuando el medio contena altos niveles de
CSL, era rico en ciertos nutrientes microbianos esenciales, lo que haca que las
clulas crecieran ms rpidamente que en concentraciones bajas de CSL. Sin
embargo, para obtener una tasa de conversin de 2,3-BD de azcar ms alta y una
relacin BD / AC ms alta, se necesit un nivel ms alto de CSL en el medio de
fermentacin (Tabla 4). Esto desafortunadamente aumenta los costos de
produccin de 2,3-BD. Las concentraciones intracelulares de NADH y NAD +
cambiaron durante los procesos de cultivo. En las fases de crecimiento, el NADH se
gener y regener durante el crecimiento celular. Si las tasas de formacin de NADH
y NAD + fueran inferiores a la tasa de crecimiento, el efecto de dilucin (debido al
nmero de clulas significativamente incrementado) conducira a una disminucin
de las concentraciones intracelulares tanto de NADH como de NAD +. Cuando las
clulas entraron en fase estacionaria, la tasa de regeneracin de NADH fue igual a su
tasa de consumo. Por lo tanto, los niveles de NADH intracelular y NAD +
permanecieron constantes. Adems, altos niveles de CSL produjeron una mayor tasa
de consumo de NADH y NAD +. El razonamiento principal puede ser que se observan
tasas de crecimiento celular ms elevadas cuando se complementan altos niveles de
CSL. Sin embargo, la relacin NADH / NAD + fue menor a niveles altos de CSL. Una
funcin principal de la va 2,3-BD es la regeneracin del exceso de potencia
reductora asociada con el gluclisis. As, la va 2,3-BD, al igual que otros procesos
fermentativos, participa en la regulacin de la relacin NADH / NAD + en la clula
[3]. Comparado con el BD / ACratio obtenido en niveles bajos de CSL, la relacin BD
/ AC fue mucho mayor cuando los niveles de CSL eran altos. Esto indica que la rama
oxidante NADH de acetoin a 2,3-BD se increment, resultando en la disminucin de
la relacin NADH / NAD +. Adems, cuando la rama oxidante de NADH de 2,3-BD se
aumenta a niveles altos de CSL, las ramas metablicas que compiten por NADH (tales
como lactato y succinato) se debilitan. Los flujos de NADH o NAD + dependen de las
vas de acceso se determinan por la disponibilidad de NADH (o NAD +), que podra
ser mejorada por el debilitamiento de las ramas metablicas competencias de NADH
(o NAD +) o viceversa.
Acetoin reductasa (ACR, codificado por el gen acr) cataliza la con-versin de acetoin
a 2,3-BD. En este estudio, tambin informamos de que los altos niveles de CSL
estimul la actividad ACR mayor. Heterologouseexpresin de los genes para
producir 2,3-BD en ingeniera de E. coli se report en condiciones fermentativas. El
constructo tena los genes alsSand alSD de B. subtilis y el gen acr de K. pneumoniae.
El acetulbital ATCC 824 de Clostridium genera acetona, pero dada la ausencia de
una enzima ACR, no produce 2,3-BD. Cuando el gen que codifica un anACR de C.
beijerinckii NCIMB 8052 se expres funcionalmente en C. acetobutylicum, el 90% de
la actina producida de forma nativa se convirti en 2,3-BD. La produccin de 2,3-BD
en B.subtilis se produce a travs de la reduccin de acetoin por acetoin reductasa
(ACR) enzima. Para desarrollar una cepa de B. subtilis para la produccin
aumentada de 2,3-BD en la fase log temprana del ciclo de crecimiento, el acrgene se
expres bajo el control del promotor PalsSD del opern AlsSD para la fermentacin
con acetoin y la produccin de 2, BD mejor hasta 6,1 g / L y la productividad general
aument de 6,7 veces a 0,4 g / L h en la cepa de ingeniera en comparacin con la del
control parental. La interrupcin insercional del gen acr en B. Subtilis limit la
produccin de 2,3-BD y aument la acumulacin de acetona en el medio. Estas
observaciones estaban de acuerdo con los resultados reportados obtenidos por
Nicholson. Sin embargo, tambin se encontr que CSL tena un efecto notablemente
estimulante sobre el crecimiento celular y la productividad de acetoin para la cepa
mutante acr :: cat (Tabla 8). Esto podra sugerir que CSL no slo tuvo un efecto
estimulante en la produccin de 2,3-BD y acetoin, sino tambin en el crecimiento
celular. Los resultados anteriores sugirieron que una mayor proporcin de BD / AC
podra ser alcanzada por sobreexpresin del gen acr en B. Subtilis suplementado con
niveles ms bajos de CSL. Por lo tanto, tratamos de hiper-expresar acr inengineered
B. subtilis para favorecer la biosntesis de 2,3-BD. Como era de esperar, la
produccin de 2,3-BD aument y se inhibi la acumulacin de acetoin. Esto condujo
a un aumento en la relacin BD / AC, lo que indicaba que el ACR se sobreexpres
exitosamente en B. subtilis. Hemos obtenido una concentracin de 2,3-BD de 40,9 g
/ L y una productividad de 0,68 g / L h. Estos resultados fueron mucho ms altos que
los obtenidos por Biswas et al [13]. Dado que se obtuvo una mayor produccin de
2,3-BD y una relacin BD / AC en niveles inferiores de CSL, los costos de produccin
podran ser considerablemente reducidos.

5. CONCLUSIONES

Los resultados anteriores demuestran la viabilidad de utilizar B. subtilis168 para la

produccin no slo de 2,3-BD sino tambin de acetoin como producto principal. La
acetoin fue un producto importante bajo niveles bajos de CSL. Mientras que para
obtener un alto ttulo de 2,3-BD y una proporcin ms alta de BD / AC, se requeran
altos niveles de CSL en el medio de fermentacin. Cuando el gen de theacr estaba
hiper-expresado en B. subtilis modificado, se obtuvo un mayor valor de 2,3-BD y una
relacin BD / AC ms alta en condiciones inferiores de CSL. Esto redujo
significativamente los costos de produccin y resolvi nuestros problemas
econmicos para el proceso.