2 Bacterias Lacticas NOfermentos Calidad Quesos

Bacterias lcticas no fermento y
calidad de quesos
Jornadas
5 y 6 de junio de 2014
Dra. Erica Hynes
Bacterias lcticas no fermento y calidad de quesos
Las bacterias lcticas no fermento se desarrollan en todos

los quesos madurados
Predominan en los productos de maduracin media y
prolongada
Pueden crecer en las condiciones ambientales del queso:
Humedad 30 - 60 %
pH 5,0-5,4 10
10
10
9
no fermento
% de NaCl en la humedad entre 2-6
UFC g-1
8
10
7
10
Bajo potencial redox (Eh 150 mV) 10
6
Ausencia o cantidades muy bajas de 10

5
fermento
4
azcares fermentables 10
3
10
Bajas temperaturas de maduracin 10 2
(7- 12 C) 10
0 50 100 150 200
Das de maduracin
Lactobacilos heterofermentativos facultativos del grupo II
Lactobacillus casei /paracasei Lactobacillus plantarum -

Lactobacillus pentosus - Lactobacillus rahmnosus, etc.
Tambin se pueden considerar NSLAB:
Lactobacilos heterofermentativos del grupo III

Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis
Bacterias lcticas termfilas no agregadas con el fermento
(Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus)
Leuconostoc spp., pediococos y enterococos
Origen de las bacterias lcticas no fermento en el queso

Leche cruda
Fuente mayoritaria de NSLAB en el queso
La elaboracin de queso en condiciones aspticas o extra higinicas
reduce slo levemente la contaminacin con NSLAB (McSweeney, 1994)
Se han encontrado cepas NSLAB que se recuperan luego de 72C -
90 seg al ser incubadas en leche estril (De Angelis et al., 2004)
4
3,5
3
Recuperacin de clulas de
L. plantarum DPC2739 2,5
Log UFC / ml
(ca. 7,0 log UFC/ml) 2
calentadas 72 C 90 seg, 1,5
en leche estril a 7 C por 20 das 1
0,5
0
0 5 10 15 20 25
Tiem po (das)

La leche cruda
Es la fuente mayoritaria de NSLAB en el queso
Varias cepas de NSLAB sobreviven a tratamientos de pasteurizacin

73C 15 seg - y termizacin 60 C 5 min) (Christiansen et al., 2006)
La flora NSLAB de quesos elaborados con la misma leche en dos

plantas distintas comparte gran parte de las cepas
(Poznanski et al., 2004)
Las leches con muy baja contaminacin inicial desarrollan NSLAB

mucho ms lentamente o alcanzan menores nmeros, al igual que
leche de quesera microfiltrada (Crow et al., 2001)
La contaminacin post pasteurizacin

Tambin contribuye al desarrollo de las NSLAB en el queso
A partir de bioflims que se hallan en plantas sanitizadas, en el silo de

leche cruda, en la unidad de ultrafiltracin, el fondo de la tina, la cinta
de cheddaring y la torre formadora de bloques (2-4 log UFC/ml)
(Sommers et al., 2001; Agarwarl et al., 2006)
La tecnologa
y el medioambiente que sta define
Influyen en la flora NSLAB y su desarrollo
Tratamiento trmico de la leche
Fermento primario
Temperatura de maduracin
Protelisis primaria por coagulante y plasmina

La tecnologa
tratamiento trmico
termizacin, pasteurizacin y coccin
La pasteurizacin introduce una 11
accin de seleccin sobre la 10
biota inicial de la leche de
g-1
9
10CFU
quesera. 8
log
7
En los quesos de leche cruda el
nmero inicial de NSLAB es ms 6
7 22 37 52 67
alto (Bude Ugarte et al., 2006) Ripening time (days)
Fermento y NSLAB para quesos Pategrs

() y semiduro de leche cruda ()
La tecnologa
tratamiento trmico
termizacin, pasteurizacin y coccin
Tanto los quesos de leche cruda como los de leche pasteurizada se han
encontrado comunidades bacterianas diversas (Babini et al., 2010).
En los quesos duros donde existe coccin, esta etapa tambin puede
tener un impacto en la composicin de la flora no fermento, aunque la
temperatura no influye en el recuento promedio (Sheehan et al., 2007)
La tecnologa
fermento primario
Si existe galactosa disponible, el crecimiento de las NSLAB correlaciona
con la disminucin de galactosa en el queso
Lactobacillus
rahmnosus Exp
9 30
NSLAB control
8
recuento de lactobacilos (Log
25 Galactosa E
Galactosa (mmoles/Kg)
7
Galactosa C
6 20
cfu/g)
5
15
4
3 10
2
5
1
0 0
0 1 2 3 4 5 6
tiempo de maduracin (meses)
Crecimiento de NSLAB adventicias en quesos Cheddar elaborados con S. thermophilus

adems de L. lactis
La tecnologa
temperatura de maduracin
Tiene un fuerte impacto en la velocidad de crecimiento
Cheddar 1 C 8 C 12 C
6 meses 8 * 104 UFC g-1 1 * 107 UFC g-1 1 * 108 UFC g-1
9 Leche cruda
8 1C
7
6 Leche
log UFC g-1
5 pasteurizada
1C
4
Leche cruda
3
8C
2
1
Leche
0 pasteurizada
0 30 60 90 120 150 180
8C
Tiempo (das)
Shakeel-Ur-Rehman et al., 2000

La distribucin temporal y espacial
Fitzimons, 2001
El impacto de las NSLAB en la calidad de quesos
En quesera industrial generalmente se las asocia a los defectos
Formacin de gas
Cristales de de lactato de calcio
Off flavours
Inconstancia de la calidad
La calidad
Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no

deben presentar ojos o aberturas
Quiberoni et al., 2004

La calidad
Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben
presentar ojos o aberturas
Causas
Contaminacin elevada en la leche cruda
Leuconostoc sp
Lactobacilos heterofermentantes obligatorios
Lb. brevis y Lb. fermentum
Problemas asociados al funcionamiento del pasteurizador

perodos de trabajo muy largos, contaminacin del equipo con S.
thermophilus
Fermento poco activo, consumo lento de la lactosa
No se han informado fallos asociados a lactobacilos

heterofermentantes facultativos, como Lb. paracasei y Lb.
plantarum.
La calidad

Este defecto es diferente del causado por bacterias coliformes

o levaduras que se produce muy tempranamente en la
maduracin y del defecto de hinchazn tarda en quesos
duros.
La calidad

No afecta negativamente el aroma o

sabor de los productos nota
intensa a manteca
No trae problemas de inocuidad
Deprecia el producto por su aspecto
y caractersticas fsicas: aceptacin
por parte del consumidor y
operaciones como corte y
empacado.
La calidad

Los sustratos para la produccin de gas por NSLAB
Lactosa residual
Galactosa residual
Citrato
Aminocidos
Lactato (?)
La calidad

la fermentacin proceso biolgico
puede ser afectado de distinta forma por la actividad de

los microorganismos presentes y la tecnologa de
elaboracin,
distintas velocidades de desaparicin de lactosa y sus

componentes, glucosa y galactosa
La calidad
Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Sample descriptions Lactose determination by D-galactose

enzyme kit determination by
(mg 100 g-1) enzyme kit
Jarlsberg (Norwegian) <10 <10
Tesco Continental Gouda 140 <10
Sainsburys Dutch Gouda 30 <10
Asda Edam Wedge 20 <10
Sainsburys Mature West Country 30 <10
Farmhouse Cheddar
Tesco Continental Jarlsberg <10 <10
Asda West Country Farmhouse Cheddar 30 <10
Asda Gouda Wedge 100 20

Sainsburys Extra Mature West Country 60 <10
Farmhouse Cheddar
Tesco Fresh Italian Parmesan 30 <10
Sainsburys Mature Gouda 40 <10
Portnoi & McDonald, 2009

La calidad
Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Cheddar
Portnoi & McDonald, 2009

La calidad
Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o

aberturas
capacidad de las NSLAB para degradar el citrato y

formar CO2
especie y cepa dependiente
vinculada a la presencia de azcares en el medio y al

estado fisiolgico de las clulas
La produccin no deseada de CO2 debera

controlarse a travs de:
la microbiota
la composicin
la temperatura de enfriado del queso y de

maduracin
Metabolismo del lactato

La calidad
Cristales de lactato de calcio
Pequeos cristales visibles en superficies de corte

son inocuos pero pueden ser confundidos con hongos por el
consumidor lo que provoca rechazo
en general se consideran un defecto, aparecen en quesos
duros
las bacterias lcticas del fermento producen L-lactato pero
muchas NSLAB producen directamente D-lactato, menos
soluble, o lo forman a partir del L- lactato
este defecto se ve favorecido por enfriado lento de bloques
grandes de queso, bajo pH y alta temperatura de
maduracin, as como el ahumado natural.
La calidad
Cristales de lactato de calcio
Pyruvate
Oxidation of L-lactate Reduction to D-lactate by

to pyruvate by L-lactate dehydrogenase D-LDH (NSLAB)
H H
C C
HO OH
COOH HOOC
H3C CH3
L(+)-Lactic acid D(-)-Lactic acid
McSweeney, 2003
La calidad
En quesera artesanal o productos de alto valor agregado (con

denominacin de origen o productos probiticos, por ejemplo)
el rol de las NSLAB se revaloriza
Metabolismo de aminocidos y formacin de flavour

Aceleracin de la maduracin
Degradacin de pptidos amargos
Diversificacin de notas de aroma
Potencial probitico
AROMA Y SABOR DEL QUESO
McSweeney & Sousa, 2000

AROMA Y SABOR DEL QUESO
Slo starter
Starter +
NSLAB1
Starter + Starter +
NSLAB2 NSLAB3
James Steele, 2012

desarrollo de flavour durante la maduracin de quesos
Las bacterias lcticas inician la transformacin de aminocidos
principalmente a travs de una reaccin de transaminacin, catalizada por
aminotransferasas
GDH
Amino acids (Glutamate deshidrogenase)
-ketoglutarate Glutamate
AT
(Aminotransferase) Glutamate
-keto acid
Benzaldehyde (Phe)
Methylthioacetaldehyde (Met)
-keto acid
dehydrogenase -ketoacid
Hydroxyacid decarboxylase
Acyl-CoA Aldehyde Methanethiol (Met)

P-Cresol (Tyr)
Skatole (Trp) alcohol
dehydrogenase Dimethyldisulphide
Carboxylic Dimethyltrisulphide
Acid Alcohol
Tanous et al. (2002)
Antonie van Leeuwenhoek
82: 271278, 2002.
desarrollo de flavour durante la maduracin de quesos
Las bacterias lcticas inician la transformacin de aminocidos
principalmente a travs de una reaccin de transaminacin, catalizada por
aminotransferasas
Aspartate GDH
-ketoglutarate Glutamate
Asp-AT
Glutamate
Oxaloacetate
Oxaloacetate
descarboxilase
CO2 CO2
Acetaldehyde TPP Piruvate

Diacetyl
Acetolactate NADH
synthase CO2
Diacetyl reductase
O2 NAD
2-acetolactate
Acetolactate
descarboxylase Acetoin Butanediol
CO2
NADH NAD
Le Bars and Yvon (2008)

J Appl Microbiol 104 ,171177
Alcoholes isohexanal steres metileno bis(metilsulfuro)
1,2-butanodiol 2-metilbutanal acetato de etilo Compuestos nitrogenados
2-butanol 3-metilbutanal benzoato de etilo 2-acetil-1-pirrolina
AROMA Y SABOR etanol
2-etilbutanol
2-metilpropanal
Nonanal
butirato de etilo
hexanoato de etilo
Pirazinas
2,3-dietil-5-metilpirazina
DE QUESOS 2-etilhexanol (E,E)-2,4 nonadienal isobutanoato de etilo 2-etil,3-5-dimetil-pirazina
2-heptanol (Z)-2-nonenal octanoato de etilo 2-metoxi-3-
isopropilpirazina
hexanol (E)-2-nonenal 2-metilbutanoato de etilo Furanos
isobutanol octanal butanoato de isobutilo 2-etil-4-hidroxi-5-metil-
3(2H)furanona
3-hidroxi-4,5-dimetil-
2(5H)furanona
4-hidroxi-2,5-dimetil-3-
Compuestos aislados 2-metilbutanol pentanal acetato de 3-metilbutilo
(2H)furanona
Compuestos fenlicos
como componentes 3-metilbutanol propanal metil-2-metilbutanoato p-cresol
2-metilpropanol propenal 3-octil acetato cidos grasos
de flavour en varios 2-nonanol thripfen-2-aldehdo acetato de pentilo acetato
(Z)-1,5- Cetonas acetato de fenetilo butirato
tipos de quesos octadien-3-ol
(Marilley & Casey, 2003) 2-octanol Acetona butirato de propilo caproato
1-octen-3-ol Acetona Lactonas decanoato
2-pentanol 2,3- butanodiona -lactona isobutirato
(diacetilo)
feniletanol 2-butanona -lactona metilacetato
2- feniletanol h-damaescenona -dodecalanctona c. 2-metilbutrico
1-prropanol 2-heptanona -octalactona c. 3-metilbutrico
2-propanol 2-hexanona (Z)-6-dodecen--lactona octanoato
Aldehdos 3-metil-2-butanona Compuestos azufrados fenilacetato
acetaldehdo 2-nonanona dimetil disulfuro propionato
decanal 3-octanona dimetil sulfuro valerato
heptanal 1-octen-3-ona trimetil disulfuro
(Z)-4-heptenal 2-pentanona metanotiol
hexanal 2-tridecanona metional
2-hexenal 2-undecanona hexanotiol
Se conocen los compuestos que se necesitan para formar el
flavour del queso, pero no cmo combinarlos de manera
adecuada para conseguir la percepcin global deseada en una
determinada matriz
La sinfona del flavour:
stimuli such as flavour compounds, notes of music, or

colours in a picture do not generate the same response when
they act singly, as when they act together in a rapid sequence
(e.g., an arpeggio) or even simultaneously (e.g., in a chord,
which can be harmonious or not). In each case, the whole matrix or
environment must be considered
Bosset, J. O. & Gauch, R. (1993) International Dairy Journal, 3, 359
377
We have our flavour orchestra:
Chamber cheese structure
Flavour instruments processes to
create flavour notes
Flavour notes cheese flavour compounds
The challenge is to conduct the orchestra to

deliver the symphony of cheese flavour
Holland & Coolbear, 2012

La calidad
Si se agrega -cetoglutarato al queso, el aroma general

aumenta significativamente.
Si se utilizan cepas de lactococos donde se inhibi la sntesis
de aminotransferasas, el aroma y sabor del queso disminuye.
Si la sntesis de aminotranferasas, por el contrario, se
aumenta, el sabor y aroma del queso se incrementan
Controlar el catabolismo de los aminocidos por los

microorganismos del queso promete ser una manera
eficaz de controlar la formacin de aroma y sabor en
el queso
Yvon & Rijnen, 2001

La calidad

En quesos madurados nicamente con bacterias lcticas, la
mitad de los componentes clave en el flavour provienen del
catabolismo de los aminocidos.
Patentes:
FR 97 05133, PCT/FR98/00828 2000 - M. Yvon y J-C Gripon.
Utilizacin de cetocidos para incrementar el flavour de productos a base
de queso
WO2003056025 - 2003 - M. Yvon, E. Chambellon, A. Gori. Seleccin y
utilizacin de cepas de bacterias lcticas capaces de producir a-
cetoglutarato a partir de citrato y de glutamato a lo largo de la maduracin
de quesos para la transformacin de aminocidos en molculas de
aroma.
EP1789542 - 2006 - M. Yvon, C. Tanous, E. Chambellon, M. Nardi .
Gene que codifica una glutamato dehidrogenasa, plsmido conteniendo
dicho gene y sus utilizaciones.
La calidad
La calidad
r e a ( u n id a d e s a r b it ra ria s )
2000
Diacetilo
1500 Acetona
1000
Peralta et al., 2010
500
0
C1-60 das E1-60 das C2-60 das E2-60 das
Tipo de queso
Wolf et al., 2009

La calidad
Adjunto de Lb. paracasei I90
En queso cremoso mini

La calidad
Adjunto de Lb. paracasei I90
En modelo de queso Reggianito

La calidad
Potencial probitico
Algunas cepas de origen NSLAB han demostrado potencial

probitico in vitro y se han probado exitosamente en matrices
alimentarias
500
450
N IgA+ cells/10 fields

400
350
300
250
200
Control Control cheese Cheese + Lp I90 Cheese + Lp I91
Burns et al., 2012

La estrategia de los fermentos adjuntos
Busca reunir las ventajas de la presencia de las NSLAB

en quesos, incrementando el control sobre la maduracin
Cepas de bacterias lcticas aisladas de quesos de buena

calidad, identificadas y caracterizadas.
Se agregan a la leche de elaboracin adems del fermento
primario (starter)
Fermentos adjuntos
Requisitos de un adjunto
Obligatorios
No contribuir a la acidificacin
Proliferar rpidamente en la cuajada y mantener la
viabilidad durante la maduracin del queso
No producir ningn defecto
Facultativos
Aumentar la protelisis secundaria
Disminuir el gusto amargo
Incrementar la bioformacin de flavour
Tener potencial como probitico
Fermentos adjuntos
Gracias a un mejor conocimiento, a travs de la investigacin en

todo el mundo, la industria quesera tiene hoy acceso a una serie de
herramientas para obtener quesos de calidad y mejores ingredientes
de flavour para quesos. Una aplicacin exitosa es la mejora en la
constancia del flavour mediante el agregado de fermentos adjuntos
de origen NSLAB, con propiedades de formacin de flavour
comprobadas, a quesos con una mnima cantidad de NSLAB
adventicias; esto quiere decir: quesos limpios
Johnston et al., 2010, Fonterra

Materia prima adecuada + fermentos primarios y

adjuntos adecuados + manejo de la temperatura
+ bajo contenido inicial de
lactosa/galactosa/citrato
Mayor control de la maduracin

Troubleshooting
Problema Causa Solucin
Produccin de CO2 con ojos y Altos recuentos de bacterias lcticas Mejora de la calidad microbiolgica
aberturas no deseadas en leche cruda de la leche cruda (Buenas prcticas
provocado por bacterias lcticas Funcionamiento prolongado del de ordeo, Microfiltracin)
no fermento pasteurizador Ciclos adecuados de trabajo y
Fermento primario lento limpieza
Agregado de polvos o retentados para Fermento primario adecuado
aumentar rendimiento Fermento adjunto
Enfriado lento de las hormas, cortes en Lavado de la cuajada
cadena de fro, altas temperaturas de Adecuada capacidad de
maduracin salado/enfriado
Mantenimiento de la temperatura
consigna
Produccin de cristales de Altos recuentos de bacterias lcticas Mejora de la calidad microbiolgica
lactato de calcio en leche cruda de la leche cruda (BPO, MF)
Valores de pH bajos Mantenimiento de pH y temperatura
Altas temperaturas de maduracin de maduracin adecuados
Produccin de off flavors Altos recuentos de bacterias lcticas Mejora de la calidad microbiolgica
en leche cruda de la leche cruda (BPO, MF)
Predominio de cepas que producen Fermento adjunto
notas de flavour no buscadas
Sabor poco intenso (mild/flat) Bajos recuentos de bacterias lcticas Fermento adjunto
en leche cruda
Predominio de cepas que no producen
flavour
Control de las NSLAB: las tres K
Las tres K Causa

Keep them out Minimizar la contaminacin:
Mantenerlas fuera Calidad de la materia prima
Sanitizacin de la planta
Kill them Pasteurizar

Matarlas
Keep them from growing Temperatura

Mantenerlas en bajo nmero Condiciones ambientales
Nutrientes
Bacteriocinas
James Steele, 2012

Muchas gracias!

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Bacterias lcticas no fermento y

Las bacterias lcticas no fermento se desarrollan en todos

Ausencia o cantidades muy bajas de 10

Lactobacilos heterofermentativos facultativos del grupo II

Lactobacillus casei /paracasei Lactobacillus plantarum -

Tambin se pueden considerar NSLAB:

Lactobacilos heterofermentativos del grupo III

Origen de las bacterias lcticas no fermento en el queso

(ca. 7,0 log UFC/ml) 2

calentadas 72 C 90 seg, 1,5

en leche estril a 7 C por 20 das 1

Origen de las bacterias lcticas no fermento en el queso

Varias cepas de NSLAB sobreviven a tratamientos de pasteurizacin

La flora NSLAB de quesos elaborados con la misma leche en dos

Las leches con muy baja contaminacin inicial desarrollan NSLAB

Origen de las bacterias lcticas no fermento en el queso

La contaminacin post pasteurizacin

A partir de bioflims que se hallan en plantas sanitizadas, en el silo de

Influyen en la flora NSLAB y su desarrollo

Tratamiento trmico de la leche

Protelisis primaria por coagulante y plasmina

La pasteurizacin introduce una 11

accin de seleccin sobre la 10

biota inicial de la leche de

Fermento y NSLAB para quesos Pategrs

Crecimiento de NSLAB adventicias en quesos Cheddar elaborados con S. thermophilus

Shakeel-Ur-Rehman et al., 2000

La distribucin temporal y espacial

El impacto de las NSLAB en la calidad de quesos

En quesera industrial generalmente se las asocia a los defectos

Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no

Quiberoni et al., 2004

Problemas asociados al funcionamiento del pasteurizador

No se han informado fallos asociados a lactobacilos

Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben

Este defecto es diferente del causado por bacterias coliformes

Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben

No afecta negativamente el aroma o

Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben

Los sustratos para la produccin de gas por NSLAB

Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben

la fermentacin proceso biolgico

puede ser afectado de distinta forma por la actividad de

distintas velocidades de desaparicin de lactosa y sus

Sample descriptions Lactose determination by D-galactose

Asda Gouda Wedge 100 20

Portnoi & McDonald, 2009

Portnoi & McDonald, 2009

Produccin no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o

capacidad de las NSLAB para degradar el citrato y

especie y cepa dependiente

vinculada a la presencia de azcares en el medio y al

La produccin no deseada de CO2 debera

la temperatura de enfriado del queso y de

Metabolismo del lactato

Pequeos cristales visibles en superficies de corte

Oxidation of L-lactate Reduction to D-lactate by

L(+)-Lactic acid D(-)-Lactic acid

En quesera artesanal o productos de alto valor agregado (con

Metabolismo de aminocidos y formacin de flavour

McSweeney & Sousa, 2000

James Steele, 2012

Acyl-CoA Aldehyde Methanethiol (Met)