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3patogenos3 No Normados PDF
3patogenos3 No Normados PDF
OBJETIVOS:
Desarrollar y/o implementar una tcnica para la deteccin del Bacillus cereus.
Desarrollar el mtodo de enumeracin en placa de Bacillus cereus.
FUNDAMENTO:
Los medios de cultivo recomendados para su determinacin son, el agar selectivo para
Bacillus cereus segn MOSSEL, agar yema de huevo-polimixina-rojo de fenol, agar yema de
huevo piruvato, agar selectivo segn REUTER y agar sangre de caballo en el cual se puede
observar la hemlisis provocar por cepas de B cereus.
Y es aplicable a cualquier alimento en el cual
Este procedimiento analtico especifica el mtodo de enumeracin en placa de B. cereus y es
aplicable a cualquier alimento en el cual B cereus est viable y presente.
5 placas ( 10 placas si se desea efectuar las siembras por duplicado) de agar MYP estril
su equivalente segn fabricante (p. ejemplo selectivo para B cereus de OXID) a.
1 matraz de 500 mL con450 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estril a.
4 matraces de 250 mL con 90 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estril 4 tubos de 16x150
mm con 9 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estril b.
2 tubos de 13x100 mm con 3.5 mL de agar nutritivo c
2 tiras API 50 CH para Bacillus * (o bioqumicas tradicionales en tubo) c.
2 tiras API 20E, * (o bioqumicas tradicionales en tubo) c.
*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de caldo glucosa ms rojo de fenol c.
*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de caldo nitratos c.
*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de RMVP c.
*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de agar tirosina inclinado c.
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*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de medio SIM c.
2 placas de agar soya tripticasena-sangre d.
2 placas de agar tirosina d.
2 placas de agar nutritivo completamente secas d.
Reactivos para tincin de Gram b, c, d, e
Reactivos para deteccin de nitratos A (cido sulfnico) y B (N-(1, naftil) etilndiamina) e.
Reactivo para la pruebe de Voges Proskauere.
Creatinina.
MATERIAL
NOTAS:
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 24 horas de iniciada la prctica.
c
Material necesario a las 48 horas de iniciada la prctica.
d
Material necesario a las 72 horas de iniciada la prctica.
e
Material necesario a las 96 horas de iniciada la prctica.
PROCEDIMIENTO
A) Preparacin de la muestra.
En condiciones aspticas, pesar 50g de muestra y depositarla en 450mL de buffer de
fosfatos (dilucin1:10) y licuar durante 2 minutos.
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Transferir 10 mL de la dilucin 1:10 a 90mL de diluyente, mezclar bien y continuar hasta
llegar a la dilucin 10-4. Inocular por duplicado placas de agar MYP (o de medios de cultivo
equivalentes) con 0.1mL de cada una de las diluciones de la muestra y extender con varilla
estril. Incubar las placas a 30C/24 horas.
Observar si existe la presencia de colonias rodeadas por zonas claras que indican la
presencia de la lecitinasa. Las colonias de B. cereus en agar MYP generalmente son de color
rosa, el cual se intensifica conforme continua la incubacin.
En agar selectivo para B. cereus (OXOID), las colonias presentes presentan un tamao
aproximado de 5mm de dimetro con precipitacin en su entorno, debido a la hidrlisis de la
lecitina. Al no utilizar manitol, las colonias se presentan de color azul turquesa rodeadas por
un precipitado, debido a la yema de huevo.
Si la reaccin no es clara, incubar las placas 24 horas ms antes de efectuar el cmputo.
Seleccionar placas que tengan en promedio de 15-150 colonias productoras de lecitinasa y
de coloracin rosa (MYP) o azules (agar selectivo para B. cereus, OXOID); esta ser la
cuenta presuntiva de B. cereus en placa.
Nota: el factor de dilucin es 10 veces mayor, debido a que solamente se inocul 0.1 mL de
cada dilucin, en lugar de 1mL.
C) Confirmacin de B. cereus
Tomar 5 o ms colonias sospechosas provenientes de agar MYP (o su equivalente) y
transferir a tubos con agar nutritivo. Incubar 24 horas a 30C. Preparar una tincin de Gram y
observar microscpicamente. El B. cereus, en el microscopio se presenta como bacilo Gram-
positivo corto, forma cadenas, las esporas pueden ser elipsoidales, centrales o
subterminales.
Transferir 3 asa as de cada tubo de agar nutritivo a 0.5mL de buffer de fosfatos y mezclar en
el vrtex. Utilizar esta suspensin e inocular los siguientes medios confirmatorios, (tambin
se puede utilizar el inculo del tubo de agar nutritivo sin diluir en buffer).
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C. 3. Medio VP
Inocular 5 mL del medio VP con una asada de cultivo descrito en el inciso C. incubar 48+ 2
horas a
35C. A cada mL de cultivo aadir 0.6 mL de -naftol y 0.2 mL de KOH. Agitar y observar el
resultado despus de 1 hora a temperatura ambiente. La prueba es positiva de produccin
de acetil metil carbinol, si se desarrolla un color rosa o violeta.
D. pruebas para diferenciar a tres miembros del grupo B. cereus, incluyendo B. cereus
variedad mycoides, B thuringiensis, B. anthracis.
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D.3. Actividad hemoltica
Inocular palcas de agar soya tripticasena con sangre. Incubar 24 horas a 35C.
Posteriormente se observa que B. cereus, es fuertemente hemoltico, la mayora de los
biotipos de B. thuringiensis y B. cereus variedad mycoides son -hemolticos, en contraste
con B anthracis generalmente no presenta hemlisis despus de 24 horas.
Nota: se puede utilizar API 50CHB Y API 20E en la caracterizacin bioqumica de los
cultivos sospechosos.
F. Informe de resultados
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Determinacin de Clostridium perfringens en alimentos
OBJETIVOS:
FUNDAMENTO:
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10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de sacarosa c d
MATERIAL
-Pipetas de 1.5 y 10 mLa
-cuenta coloniasb, c
-licuadora con vaso o Stomacher con bolsas estriles.a
-jarras de anaerobiosisd
-incubadora de 35+ 1 C a, b, c, d
-cajas petri estrilesa, b, c
-asa microbiolgicab, c , d
-bao de agua a 45 + 1 Cd
-gradillas a, b, c, d
NOTAS:
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 24 horas de iniciada la prctica.
c
Material necesario a las 48 horas de iniciada la prctica.
d
Material necesario a las 72 horas de iniciada la prctica.
e
Material necesario a las 96 horas de iniciada la prctica.
PROCEDIMIENTO
A.-PREPARACIN DE LA MUESTRA
Pesar en condiciones de asepsia , 25 g del alimento y aadir 225mL de diluyente, en este
caso de agua peptonada al 0.1% dilucin 1:10
Homogeneizar durante 1-2 minutos a velocidad baja y efectuar diluciones decimales hasta
10-4 con la menor aireacin posible, en caso de no tener colonias sospechosas en agar TSC,
guardar en refrigeracin especficamente la dilucin 1:10-
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perfectamente y dejar que se basorba por completo la muestra.
Despus de que el inculo se ha absorbido, aadir una sobrecapa de 8mL de agar TSC sin
emulsin con yema de huevo. Dejar solidificar.
Colocar las placas sin invertir dentro de una jarra para anaerobios con generador y
catalizador para incubar de 20-24 h a 35 C
D.-PROCEDIMIENTO COMPLEMENTO
ste inciso no se realiza cuando existan colonias sospechosas en el agar TSC. En caso
contrario:
Preparar caldo hgado o bien medio carne, previamente calentado durante 10 minutos en
agua hirviente y enfriado rpidamente. Inocular en los medios antes mencionados , 3 tubos
con 2mL de la dilucin 1:10, e incubar los tubos durante 24-48 horas a 35 + 2 C
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desarrolladas.
La colonias sobre la superficie del agar TSC , son de color amarillo grisceo, con zonas
opacas de 2-4mm de dimetro , por la actividad de la lecitinasa. Este procedimiento
tambin es usado para aislar C. perfringens de los tubos de cakdo hgado cocido o medio de
carne.
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Inocular caldo para esporulacin, 1 mL de caldo tioglicolato fluido. Incubar 24 horas a 35 +
2 C al trmino establecido preparar una tincin de Gram , en el caso de existir desarrollo
microbiano y observar microscpicamente las esporas.
Refrigerar los cultivos esporulados por si se requieren pruebas adicionales.
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Fementacin de la lactosa +
Fermentacin tormentosa de la leche +
Hidrlisis dela esculina _
G.-INFORME DE RESULTADOS
Calcular el nmero de clulas C. perfringens en la muestra sobre la base del porcentaje de
colonias probadas y confirmadas.
EJEMPLO:
En el caso de haber inoculado 0.1mL de cada una de las diluciones:
El cmputo promedio de la placa para la dilucin 10-4 es de 85 colonias y 8 de 10 colonias
se confirmaron para C. perfringens, el nmero de microorganismo por g de alimento es:
Nota:
El factor de dilucin en las placas que contienen yema de huevo y que solamente se sembr
0.1mL de las siluciones, es diez veces mayor como se observa en el ejemplo previamente
descrito.
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Determinacin de Campylobacter jejuni en alimentos.
OBJETIVOS:
FUNDAMENTO:
MATERIAL
1 bolsa para Stomacher o vaso de licuadora estril.a
Mechero Bunsen.a
1 balanza granataraa
1 jarra de anaerobiosisa
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Propipeta.a
Microscopiob
Incubadora a 42C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1 Ca
NOTAS:
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 24 horas de iniciada la prctica.
c
Material necesario a las 48 horas de iniciada la prctica.
d
Material necesario a las 72 horas de iniciada la prctica.
e
Material necesario a las 96 horas de iniciada la prctica.
PROCEDIMIENTO.
Aislamiento selectivo.
1.- Para el caso de muestras solidas colocar 25 g de la muestra, para muestras liquidas 25
mL de la muestra
2.- Transferir la muestra pesada o medida a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora
estril.
3.- Adicionar 90.0 mL de diluyente estril al 0.1% a la licuadora o bolsa Stomacher.
4.- Homogenizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora
o velocidad mnima.
5.-Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el numero de diluciones est en funcin de la
procedencia de la muestra) en tubos de 16 X 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del
mismo diluyente.
6.- Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1,10-2, 10-3 y 10-4 a cajas petri con agar selectivo
para Campylobacter.
7.- Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio
estril, en forma de L, iniciando a partir de la mayor dilucin (Mtodo de inoculacin por
extensin en superficie).
8.- Mantener las placas en su posicin hasta que el inoculo sea absorbido por el agar, entre 5
y 10 minutos aproximadamente.
9.- Invertir las placas e incubar en condiciones microaeroflicas 42-43C, durante 24 a 48
horas.
10.- Despus de incubar observar las colonias caractersticas de este microorganismo en el
agar selectivo para Campylobacter. Estas se presentan como gotas de agua extendidas a lo
largo de la estra.
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Pruebas bioqumicas
Realizar la confirmacin bioqumica del microorganismo, haciendo las pruebas de presencia
de las enzimas citocromo oxidasa, catalasa, produccin de H2S, reduccin de nitratos a
nitritos, e hidrlisis de purato.
Prueba de oxidasa.
1.- Colocar un crculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas
de reactivo de oxidasa. Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial.
2.- Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en agar Skirrow y depositarlo en
el papel filtro anterior.
NOTA
Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se torna prpura oscuro o azul en
pocos segundos.
Prueba catalasa.
1.- Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solucin de perxido al 3%.
2.- la formacin inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva.
3.- Precauciones, la emulsin debe realizarse con un asada platico o palillo de madera
estril evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base
con sangre, cualquier contaminacin con eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas.
Reduccin de nitratos.
1.- Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35C por 5 das. Para la lectura se
debe agregar 0.2 mL de reactivo A y 0.2 mL de reactivo B, un color rojo indica una prueba
positiva (presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar zinc en polvo. El
desarrollo de color rojo despus de una hora confirma una prueba negativa (presencia de
nitratos).
2.- en forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0.2 mL del reactivo B y 0.2 mL
del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva ( presencia de nitritos). Si esta
coloracin no se observa, adicionar 0.2 mL del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color
naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo
elimina el uso del alfa-naftilamina, que es carcinognica.
Movilidad en agar.
1.- Inocular en medio SIM, incubar por 48 horas a una temperatura de 37 C. Observar si el
microorganismo inoculado es mvil.
Produccin de H2S
1.- Inocular en medio SIM, incubar por 48 horas a una temperatura de 37C. Observar si el
microorganismo es productos de un precipitado negro.
NOTA
Para los microorganismos catalasa positivos en el medio se observa un burbujeo al rededor
de la estra.
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CUADRO 2. Caractersticas mnimas para la identificacin de Campylobacter jejuni
Resultados.
Interpretacin de resultados.
Consultar los resultados obtenidos en el cuadro de identificacin de Campylobacter jejuni y
concluir acerca del tipo de microorganismos que se aisl.
USO
Para el aislamiento primario y cultivo de Campylobacter, a partir de muestras clnicas,
alimentos, aguas, etc.
PRINCIPIO
La base y la sangre de carnero junto con la atmsfera deficiente en oxgeno producen un
buen crecimiento de Campylobacter. El suplemento con agentes antimicrobianos inhibe
marcadamente el crecimiento de las bacterias acompaantes y facilita la recuperacin de
Campylobacter.
Sembrar la muestra de prueba en la superficie del medio de cultivo por estra cruzada.
Incubar 24 48 h en atmsfera de CO2. De acuerdo a la temperatura de incubacin, es
posible hacer diferenciacin de especies:
TEMPERATURA DE INCUBACION
MICROORGANISMO 25C 35C 42C
Campylobacter fetus ssp fetus + + -
Campylobacter jejuni - + +
Campylobacter coli - + -
Campylobacter fetus ssp venerealis + + -
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FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA BASE
Agar 15.0
Extracto de levadura 2.0
Bisulfito de sodio 0.1
Dextrosa 1.0
Cloruro de sodio 5.0
Polipeptona 20.0
SUPLEMENTO
Anfotericina B 0.002
Vancomicina 0.010
Cefalotina 0.015
Polimixina B 2500 Unidades
Trimetoprim 0.005
Sangre de carnero estril desfibrinada 100 mL
PH 7.2 0.2
PREPARACION
Rehidratar 43.1 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por
completo. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. Enfriar
aproximadamente a 45C. Adicionar la sangre de carnero estril desfibrinada, homogeneizar
perfectamente. Agregar los suplementos previamente hidratados, segn las especificaciones
del fabricante en condiciones de esterilidad, mezclar sin producir burbujas. Vaciar en cajas
de Petri estriles. Conservar en refrigeracin de 2 a 8C.
CONTROL DE ACTIVIDAD
MICROORGANISMO CEPA CRECIMIENTO
Campylobacter jejuni ATCC 33291 Bueno
Escherichia coli ATCC 25922 Parcial a completa inhibicin
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Parcial a completa inhibicin
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Determinacin de Shigella spp. en alimentos.
OBJETIVOS:
FUNDAMENTO:
MEDIOS DE CULTIVO
1 matraz Erlenmeyer con 225 mL de caldo para Gram-negativos con 0.5 mg y/o 3 mg de
novobiocina cuyo pH final sea 7.0 (caldo GN+novobiocina)a
2 cajas Petri con 20mL de agar Mac Conkey (MC)b
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar Kligler (KIA) inclinadosc
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar hierro lisina (LIA) inclinadosc
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo rojo de metilo Voges Proskauer (RMVP)e
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de medio sulfuro indol movilidad (SIM)e
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo glucosa ms rojo de fenol y conteniendo campana
de Durhame
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo surraco o caldo ureae
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo malonatoe
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar citrato de Simmonse
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2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo KCN
2 tubos con caldo sacarosa ms rojo de fenole
2 tubos con caldo adonitol ms rojo de fenole
2 tubos con caldo inositol ms rojo de fenole
2 tubos con caldo salicina ms rojo de fenole
2 tubos con caldo mucato (slo en el aislamiento de otras especies diferentesa S. sonnei )e
2 tubos con agar acetato de sodio (slo en el aislamiento de otras especies diferentesa S.
sonnei )e
BIOLGICOS
Antisuero polivalente somtico O
MATERIAL Y EQUIPO.
Balanza granatariaa.
1 caja de Petri de vidrio estrila.
1 bolasa de Stomacher o un vaso de licuadora estrila.
Utensilios necesarios para la manipulacin de la muestra: cucharas, cuchillos, tenedores,
estrilesa.
Stomacher o motor para licuadoraa.
Pipetas de vidrio de 1.0 y 5 mL, estriles con filtro de algodnd.
Pipetas Pasteur estrilesc.
Asa microbiolgica b.
Mechero de Bunsena, b, c,d,e
Portaobjetosc.
Microscpio pticod,e.
Jarra para anaerobiosis a
Incubadora a 35C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a +/-0.1C a,b,c,
Incubadora a 42 y 44C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a +/-0.1C a.
NOTAS.
a Material necesario al inicio de la prctica.
b Material necesario a las 24 h. de iniciada la prctica.
c Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica.
d Material necesario a las 72 h. de iniciada la prctica.
e Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica.
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PROCEDIMIENTO:
D) Caracterizacin fisiolgica.
Realizar tincin de Gram e inocular los cultivos sospechosos en diferentes pruebas
bioqumicas, en tiras de API 20 E. Las caractersticas de Shigella se resumen en: bacilos
Gram-negativos, negativos para H2S, ureasa, glucosa (gas), mitilidad, descarboxilacin lisina,
sacarosa, adnitol, inositol, lactosa (2 das), KCN (Caldo cianuro de potasio), malonato, citrato,
salicina y acetato. Es positivo para rojo de metilo en RM/VP. Utiliar antisuero para identificar
el serotipo. Las especies de Shigella tieneden a dar negativas las reacciones de acetato de
sodio, citrato y mucato, mientras que la E. coli , anaergena tiende a dar positiva al menos
una de estas 3 ltimas reacciones.
E) Pruebas bioqumicas
1.Agar triple azcar hierro o agar Kligler hierro.
Registrar las caractersticas del medio TSI o KIA antes de la inoculacin (color del medio).
Por duplicado tomar suavemente una porcin del centro de la colonia con asa bacteriolgica
recta y estril e inocular por picadura y estra en un tubo con agar triple azcar hierro (TSI) o
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agar Kligler (KIA) inclinado.
Incubar el medio TSI o KIA a 35+/-2C durante 24 h.
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reaccin se lleve a cabo en presencia de oxgeno.
F) Identificacin serolgica:
1. Colocar con un asa bacteriolgica, 2 gotas separadas de solicin salina estril (NaCl
0.85%) sobre un portaobjetos; en donde una gota ser el control.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porcin de cultivo desarrollado en agar Kliger.
3. Agragar a una de ellas, una gota de antisuro polivalente somatico O y mezclar
perfectamente bien.
4. Inclinar la lmina hacia atrs u hacia delante, durante aproximadamente un minuto para
posteriormente observar bajo buena iluminacin y fondo obscuro los resultados de esta
prueba.
5. Considerar el grado de aglutacin de acuerdo a:
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0 = no aglutinacin
1+ = aglutinacin escasa
2+ = aglutinacin con un 50% de claridad
3+ = aglutinacin con 75% de claridad
4+ = aglutinacin total
Notas:
a) Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el
subgrupo, empleando antisueros especificos como son el A, B, C y D
b) Si la aglutinacin con el antisuero O es negativa, calentar a ebullicin a bao Mara
durante 30 min. para hidrolizar el antigeno capsular que interfiere en la reaccin.
Despus repetir la prueba con el antisuero polivanete O.
G) Informe de resultados
Reportar presencia o ausencia de Shigella spp. (identificacin de especie) en 25 gramos de
alimento.
Bibliografa:
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