Muestras: se utilizaron 5 clones (tipos) de cacao para obtener 10 muestras.

5 fueron fermentadas
durante 6 das. Las 10 se secaron al sol durante 5 das.

Extraccin metanlica: se homogenizaron 10 g de muestra macerada de granos decacao en 100 mL de

metanol. La mezcla se almacen en un shaker 150 rpm, 30 C durante 48 h y, finalmente, se filtr. El
extracto obtenido se utiliz para la determinacin de la capacidad antioxidante y el contenido de
metabolitos secundarios.

Extraccin de metabolitos secundarios para el analisis de HPLC: Se extrajo 1 g de muestra macerada de

granos de cacao en 10 mL de metanol en un tubo de polipropileno de 50 mL, mediante ultrasonido
durante 15 min en un sonicador . El tubo se centrifug a 4 000 rpm durante 10 min en una centrifuga y el
sobrenadante se decant a un tubo limpio de 50 mL. La muestra se extrajo con otros 10 mL de metanol.
Los extractos de metanol se combinaron y fueron filtrados a travs de un filtro Sartorius de 0,45 m
antes de la inyeccin en el equipo.

Determinacin de fenoles totales: se determin por el mtodo de Folin-Ciocalteu. En un tubo de

reaccin se adicionaron 50 L del extracto metanlico, 425 L de agua destilada y 125 L del reactivo
Folin-Ciocalteu. Se agit y luego se dej en reposo por 6 min. Posteriormente se adicionaron 400 L de
Na2CO3 a 7,1 %. Despus de 1 h en la oscuridad se ley la absorbancia a 760 nm. Se usaron soluciones
de cido glico entre 50 y 500 g/mL para construir la curva de calibracin. Los resultados se expresaron
como mg de cido glico/g de cacao.

Determinacin de taninos condensados: se utiliz una tcnica para estimacin espectrofotomtrica de

taninos condensados. En un tubo de reaccin se adicionaron 230 L del extracto metnolico y 670 L de
una solucin de vainillina 10 000 ppm (en cido sulfrico 70 %). Se agit y se incub en un bao de agua
a 20 C durante 15 min.

Luego se registr la absorbancia a 500 nm. El contenido de taninos se expres como mg de catequina/g
de cacao.

Determinacin del contenido total de antocianinas: el contenido de antocianinas totales en los extractos
se determin por el mtodo diferencial de pH. Las lecturas se realizaron a 530 y a 700 nm para la
eliminacin de interferencias.

Determinacin de teobromina y cafena: se analiz por HPLC. Se utiliz un cromatgrafo lquido calibrado
a 280 nm. La separacin de teobromina y cafena se llev a cabo en una columna C-18 ultra acuosa.
Como fase mvil se utiliz metanol 100 % trabajando en modo isocrtico a un flujo de 1,0 mL/min. La
identificacin de los picos se hizo comparando con estndares de teobromina y cafena.

Actividad atrapadora del radical libre DPPH: la actividad antioxidante de las muestras se evalu mediante
la capacidad captadora del radical DPPH. En un tubo de ensayo se adicionaron 10 L de extracto
metnolico o del estndar y 990 L de una solucin de DPPH (20 mg/L) que se prepar con anterioridad
en metanol. Como referencia se us la misma cantidad de DPPH y 10 L del solvente de la muestra
(metanol). Las mezclas se agitaron vigorosamente y se almacenaron a temperatura ambiente y en
oscuridad durante 30 min. La absorbancia se registr a 517 nm. Los resultados se expresaron como
valores TEAC (mol de trolox/g de cacao) mediante la construccin de una curva patrn usando varias
concentraciones del antioxidante Trolox.

Medida de la capacidad reductora con el ensayo FRAP: el mtodo consiste en evaluar la capacidad
antioxidante de una muestra de acuerdo con su capacidad para reducir el complejo tripiridiltriazina
(TPTZ) - Fe3+ hasta su forma ferrosa (Fe2+).

Mtodo ORAC: Se prepararon 3 mL de la siguiente solucin: 21 L de una solucin de fluorescena 10

M, 2 899 L de buffer fosfato 75 mM (pH 7,4), 50 L de AAPH 600 mM y 30 L de extracto de cacao o
Trolox 500 M (estndar). La fluorescencia se registr cada 60 s a 37 C, usando un espectrofluormetro
con una multicelda termostatizada. Las lecturas se realizaron a una de excitacin de 493 nm y una de
emisin de 515 nm. El valor ORAC se calcul utilizando la ecuacin)

Evaluacin de la capacidad atrapadora de radicales superxido: en este ensayo se evala la capacidad de

los antioxidantes para atrapar el radical superxido, los cuales son generados por el sistema NADH/PMS.

Anlisis estadstico: los datos se procesaron con un anlisis de varianza (ANOVA) y mnima diferencia
significante (LDS), con el paquete estadstico SAS.