Introduccin a la Biologa Celular y Molecular

TP3: Electroforesis en gel de poliacrilamida

Objetivos

Comparar los perfiles proteicos obtenidos mediante SDS-PAGE.

Calcular la movilidad electrofortica de diferentes bandas proteicas.

Introduccin

La tcnica de electroforesis en gel es un mtodo para separar, identificar y purificar

DNA, RNA o protenas, entre las matrices ms utilizadas se encuentra la de agarosa y la
de poliacrilamida. La localizacin de la biomolcula en el gel puede ser determinada
mediante la utilizacin de distintos colorantes que tienen afinidad especfica por la
biomolcula a resolver.

El fenmeno denominado electroforesis sucede cuando una molcula con una

carga neta en solucin se desplaza por accin de una campo elctrico; de esta manera la
molcula migra hacia uno u otro electrodo segn su carga: los aniones (-) irn hacia el
nodo (+) y los cationes (+) hacia el ctodo (-). En estas condiciones las molculas
disueltas migran a una velocidad proporcional a la relacin carga:masa. Por lo tanto la
velocidad de migracin en estas condiciones a travs del campo elctrico depender de:
carga neta, tamao y forma de la molcula, fuerza del campo elctrico, fuerza inica,
viscosidad y temperatura del medio

v: velocidad de migracin de la molcula v= Ez

E: inte nsidad del campo elctrico f
z: carga neta de la molcula
f: coeficiente de friccin (depende tanto de masa como de la forma de la molcula)

Las separaciones electroforticas generalmente se realizan sobre matrices que

sirven de tamices moleculares que potencian la separacin. Las molculas ms pequeas
que los poros se desplazan fcilmente a travs de l, mientras que las de mayor tamao
quedan retenidas y las intermedias se desplazan con distinto grado de dificultad
dependiendo de su tamao.
La forma, tamao, porosidad y tipo de matriz del gel puede variar dependiendo del
tamao y la biomolcula a ser analizada. Independientemente del tipo de matriz elegida,
la misma debe ser elctricamente neutra, tal que no se produzca un flujo de solvente
hacia uno u otro electrodo debido a la presencia de grupos cargados inmovilizados en la
matriz (electro endsmosis) que disminuye la resolucin de la muestra.
Los geles de poliacrilamida son utilizados para separar la mayora de las protenas
o pequeos oligonucletidos. A los fines de este prctico se explicara nicamente la
aplicabilidad de estos geles para la separacin de protenas.
En presencia de radicales libres, que son proporcionados por el persulfato de
amonio (APS) y estabilizados por el TEMED, se genera una reaccin en cadena que es
iniciada con monmeros de acrilamida que polimeriza en largas cadenas que son
entrecruzadas con la bis-acrilamida para formar la matriz del gel.

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Para la electroforesis en gel de poliacrilamida de muestras proteicas se puede

utilizar un sistema de buffers continuo o discontinuo. El sistema continuo tiene una nica
clase de gel, el separador (separating) y usa el mismo buffer que el de corrida. El
discontinuo esta formado por dos geles distintos. En la parte de arriba se coloca un gel
separador con un tamao de poro mayor (stacking) que sirve para concentrar las
muestras antes de que entren al gel separador. Cada uno esta compuesto de un buffer
que son distintos entre si y a su vez distinto que el de corrida. El sistema discontinuo
otorga una mayor resolucin ya que las protenas ingresan como una banda discreta al
gel de separacin.

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)

La mayora de las electroforesis analticas de protenas se llevan a cabo bajo

condiciones que aseguren la disociacin de las protenas en sus subunidades
individuales y que minimicen la agregacin, para ello se utiliza la combinacin de un
detergente aninico como el SDS (dodecilsulfato de sodio), un agente reductor (? -
mercaptoetanol o DTT) y calor para disociar las protenas. Los polipptidos
desnaturalizados unidos al SDS obtienen una carga neta (-), las molculas de
detergente se unen a razn de un SDS por cada 2 aminocidos lo que otorga una carga
proporcional a la masa de la protena.
El tratamiento conjunto de SDS ms el agente reductor eliminan los efectos de las
diferentes conformaciones de las protenas tal que la longitud de la cadena, que refleja la
masa, es la nica que determina la velocidad de migracin en una SDS-PAGE. Las
protenas de menor tamao se resuelven en la parte inferior del gel, y las de mayor
tamao van quedando retrasadas, observndose en la parte superior. En la siguiente
tabla se muestra el rango de linealidad teniendo en cue nta el porcentaje de archilamida:

Rango efectivo de separacin en geles de SDS-PAGE

acrilamida-bisacrilamida* (%) Rango lineal de separacin (kDa)

15,0 12 - 43
10,0 16 - 68
7,5 36 - 94
5,0 57 - 212

* La relacin molar entre acrilamida y bisacrilamida es de 1:29

El desplazamiento de las cadenas polipeptdicas es proporcional al logaritmo de la

masa, esto nos permite estimar el peso molecular de una protena comparndola con la
distancia de migracin de un patrn de protenas de peso molecular conocido (Markers).
Para ello se construye una curva de calibracin donde se grfica los log (PM) vs. el Rf ;
donde el Rf es la relacin entre la distancia de migracin de la banda proteica (d) y la
longitud de corrida total del gel (I) o sea la distancia desde el borde superior del gel hasta
el frente de corrida. Luego se calcula el Rf de la protena incgnita y se extrapola en la
curva el log (PM).

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Ejemplo:

Fig. 1. SDS-PAGE de extracto de protenas

totales de tres bacterias lcticas teido con
coomasie blue en separating gel 12%T 2.67%C. 205
La primera u la ltima calle es el marcador de 116
peso molecular (Sigma Marker Wide range, 97,4
84,0
Sigma; las bandas son 205,0; 116,0; 97,4; 84,0; 66,0
66,0; 55,0; 46,0; 36,0; 29,0; 24,0; 20,1 y 14,2
kDa). Las calles 1, 2, 3 fueron sembradas con tres 55,0
diferentes extracctos de Enterococcus faecium 46,0
ATCC14434; las calles 4, 5, 6 con tres extractos
diferentes de Lactobacillus paracasei subsp. 36,0
paracasei DSM4905; 7, 8 y 9 se sembraron tres
29,0
extractos de Lactococcus lactis subsp. lactis 24,0
DSM20481
20,1

PM (kDa) Rf
205 0,2
116 0,3
Rf vs PM 97,4 0,35
84 0,4
250 66 0,45
200 55 0,58
Pm (KDa)

150 46 0,65
36 0,7
100
29 0,9
50
24 0,95
0
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Rf Curva de calibracin

2,5 Log (PM) = -0,2239 Rf + 2,4045

R2 = 0,9525
2
Log(PM)

1,5

0,5

0
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Rf

Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Biologa Molecular de la Clula
(1996) Omega.
Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Damell J. Molecular Cell Biology
(1995) Scientific American Books. .
Old R.W., Primrose S. B. Principios de manipulacin gentica (1987) Editorial Acribia S.A..
Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. Molecular cloning, A Laboratory Manual (1982) Cold
Spring Harbor Laboratory.

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Procedimiento

1) Armar el equipo segn las indicaciones de las instructoras

PARA PREPARAR Y MANIPULAR LOS GELES DEBEN UTILIZARSE GUANTES. LA

ACRILAMIDA ES NEUROTXICA.

2) SEPARATING GEL (7.5%): para un gel preparar aprox. 5 ml totales agregando los
volmenes indicados de cada componente en el orden dado, EXCEPTO EL APS Y EL
TEMED que se agregan inmediatamente antes de sembrar:

H20 desionizada 2.4 ml

Buffer Tris 1,5 M DH 8.8 1.25 ml
10% SDS 50 l
30% Acrilamida/Bis (29:1) 1.25 ml
10% APS 35 l
TEMED 5 l

3) STACKING GEL (4%): preparar aprox. 5ml para cada gel, agregando los volmenes
indicados de cada componente en el orden dado EXCEPTO EL APS Y EL TEMED
que se agregan inmediatamente antes de sembrar:

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H20 desionizada 3 ml
Buffer Tris 0,5 M pH 6.8 1.25 ml
10% SDS 50 ul
30% Acrilamida/Bis (29:1) 0.7 ml
10% APS 35 ul
TEMED 5 ul

El APS y el TEMED se agregan inmediatamente antes de sembrar; agitar

rpidamente y sembrar 3.7 ml entre los vidrios, puede hacerse pegado a uno de los
separadores.

4) Agregar el APS y el TEMED al Separating gel, agitar rpidamente y sembrar 3.7 ml

entre los vidrios (puede hacerse pegado a uno de los separadores)
5) Agregar inmediatamente H20 desionizada con una pipeta Pasteur hasta el borde del
vidrio ms chico. Cerrar el tubo en el cual se prepar el gel para dejarlo como testigo
de la polimerizacin. Se pueden incubar a 37C para acelerar la polimerizacin
6) Despus de que haya gelificado, remover cuidadosamente el agua y terminar de secar
con trozos de papel de filtro.
7) Agregar APS y el TEMED al tubo del stacking gel y sembrarlo, dejando rebalsar
apenas por el borde del vidrio.
8) Colocar enseguida el peine previamente humedecido con running buffer (buffer de
corrida donde se sumerge el gel durante la electroforesis) para facilitar s remocin.
Cerrar el tubo en el que se prepar para usarlo como testigo. Dejar polimerizar.
9) Mientras ocurre la polimerizacin, preparar las muestras para sembrar, teniendo en
cuenta que el volumen final es 20 l, que el sample buffer est 5X y que deben
contener 10-20 g de protenas.
10) Sacar los peines y enjuagar con running buffer eliminando los restos de gel, si
quedaran.
11) Colocar en el soporte que porta los electrodos e introducirlo en la cuba.
12) Agregar running buffer en ambos compartimentos; asegurarse que los mismos no
estn en contacto.
13) Sembrar 7 l del marcador de peso molecular (MWM) y 20 l de cada una de las
muestras, preparadas en sample buffer
14) Conectar a la fuente. Correr a 100 voltios hasta que el colorante del frente de corrida
llegue al borde inferior del gel (aproximadamente 1 hora).
15) Una vez finalizada la corrida, apagar la fuente y desarmar cuidadosamente
depositando el gel en un recipiente para efectuar los siguientes lavados (con
agitacin): uno con H20 destilada (5 minutos) y uno rpido con Solucin de destincin.
16) Agregar Coomassie blue y teir en agitacin.
17) Enjuagar con solucin de destincin hasta que, al observar en un transiluminador, se
distingan las bandas de protenas y se vean azules contra un fondo claro.
18) Agregar H20 destilada para frenar la destincin.
19) Obtener los valores necesarios para calcular los Rf

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