TALLER DE GENTICA 3

PRUEBAS DE DIAGNSTICO
MOLECULAR

Gua de actividades 2017

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 Taller de Gentica III: Pruebas de diagnstico molecular

Para resolver los problemas de este Taller se recomienda estudiar previamente los
fundamentos moleculares de la electroforesis de cidos nucleicos y su uso en las tcnicas de
Southern blot, PCR y secuenciacin.

Los objetivos del Taller III son los siguientes:

1- Identificar en qu casos son aplicables las tcnicas de diagnstico molecular

2- Interpretar la informacin que surge de la aplicacin de esas pruebas

Ejercicio 1

Introduccin. La anemia de clulas falciformes es una enfermedad sangunea caracterizada

por la presencia de glbulos rojos con forma anormal (de hoz). La forma de hoz est asociada
a una prdida de flexibilidad celular y resulta en movimientos restringidos de los glbulos rojos
a travs de los capilares ms pequeos, provocando disminuciones en la disponibilidad de
oxgeno de los tejidos por ellos irrigados. La enfermedad es crnica: los individuos se
encuentran en buen estado la mayor parte del tiempo, pero sufren peridicamente de dolorosos
ataques y su esperanza de vida est disminuida.
La anemia de clulas falciformes es una enfermedad monognica con un patrn de herencia
autosmico recesivo. La causa es una sustitucin puntual (A por T) en el gen de la globina
que provoca un cambio de sentido en la cadena polipeptdica en dnde cido glutmico es
globina reemplazado por valina. La globina resultante (globina mutante) se denomina
hemoglobina S. La hemoglobina S es soluble cuando est completamente oxigenada, pero
cuando las tensiones de oxgeno disminuyen sufre un marcado cambio conformacional que
conduce a la deformacin del glbulo rojo y a la hemlisis.
El diagnstico molecular para la mutacin descripta consiste en amplificar mediante PCR una
regin de ADN de 233 pb que abarca el sitio de la mutacin y luego tratar al producto
amplificado con la enzima de restriccin Dde I. Esta enzima produce dos fragmentos de 178 y
55 pb, respectivamente. La discriminacin de esta prueba se debe a que la mutacin produce
la prdida del sitio de restriccin para esta enzima. De esta manera, la resolucin
electrofortica puede revelar la presencia o ausencia de la mutacin.

Problema. Una pareja ha tenido dos hijos: una nia de diez aos sana y un nio de cuatro
aos con anemia de clulas falciformes. La mujer est esperando un nuevo hijo y se ha
realizado un muestreo de vellosidades corinicas para determinar si su nuevo hijo (el
probando), heredar la enfermedad.
Se muestra el resultado de la prueba de diagnstico tal como se describi previamente:

M: marcadores de peso molecular

1: control
2: padre
3: madre
4: probando
5: hija de 10 aos
6: hijo de 4 aos

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 A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de
cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cmo interpreta
el patrn de bandas en cada caso.
B- Con los datos obtenidos, dibuje el rbol genealgico de la familia

Ejercicio 2

Introduccin. En funcin de la tasa de mutacin que en el genoma humano es muy variable

se pueden distinguir dos tipos de mutaciones: mutaciones estticas y mutaciones dinmicas.
En las primeras, la tasa de mutacin es la misma tanto para la secuencia originada tras la
mutacin como para la secuencia predecesora. Sin embargo, las mutaciones dinmicas que
ocurren en secuencias de ADN repetitivo, se caracterizan por un tipo muy particular de
mutacin: la expansin de tripletes. En este caso, la tasa de mutacin depende del nmero de
copias, por lo que la mutabilidad de una nueva secuencia originada por mutacin es diferente
de la de la secuencia de la que proviene.
Se ha demostrado que las mutaciones dinmicas que originan un aumento en el nmero de
repeticiones en secuencias polimrficas de tripletes repetidos constituyen un nuevo mecanismo
de mutacin que conduce finalmente a diversas enfermedades neurolgicas hereditarias, un
ejemplo d estas es la distrofia miotnica (DM)
La DM es una enfermedad neuromuscular de herencia autosmica dominante con una
incidencia estimada de 1/7.500, siendo la forma ms comn de distrofia muscular en adultos. El
cuadro clnico de los pacientes afectados de DM es muy variable, y aunque son caractersticas
la miotona y la progresiva debilidad consecuente, tambin se ven afectado otros sistemas,
producindose defectos en la conduccin cardaca, cataratas, hipersomnia, atrofia testicular y
calvicie prematura en los varones. Esta extraordinaria variacin fenotpica, que tiene lugar tanto
entre las distintas familias afectadas como entre los individuos de una misma familia, es una de
las caractersticas ms notables de la DM. El fenmeno de la anticipacin (la enfermedad se
manifiesta en edades cada vez ms tempranas en generaciones sucesivas, presentando
adems sntomas ms severos) junto con el grado variable de penetrancia, son otras
caractersticas destacables de la DM. Desde el punto de vista clnico, los pacientes se
clasifican en tres categoras principales de acuerdo con la edad de manifestacin de la
enfermedad y la expresin fenotpica de la misma:
1. De manifestacin tarda. En muchos casos es difcil de diagnosticar por el ligero grado de
afectacin que muestran los pacientes.
2. De manifestacin en adultos
3. De manifestacin temprana, que es la forma ms severa de la enfermedad y se ve
frecuentemente asociada con un profundo retraso mental neonatal.

El defecto molecular subyacente a la DM se ha identificado como un fragmento de ADN

inestable que contiene repeticiones de triplete (CTG)n y que sufre expansin en los pacientes
afectados por la enfermedad. El nmero de repeticiones del triplete (CTG)n es muy variable en
la poblacin normal, oscilando entre 5 y 27 repeticiones; los pacientes mnimamente afectados
tienen al menos 50 repeticiones, mientras que los individuos ms severamente afectados
portan expansiones de dicha secuencia con cientos e incluso miles de repeticiones. El triplete
CTG se localiza en el extremo 3 no traducido (3UTR) del ARNm de la protena quinasa de la
miotonina (MDPK), es decir, por fuera de la regin codificante. El gen MDPK est ubicado en el
cromosoma 19 y contiene 15 exones que se extienden aproximadamente 13 kb, produciendo
finalmente un polipptido de 524 aminocidos.

Una vez identificada la amplificacin en el nmero de repeticiones CTG como la base gentica
de la DM, se ha realizado un gran esfuerzo para desentraar cmo la expansin podra
producir la enfermedad.
Algunos grupos de investigacin han demostrado que en clulas en cultivo, la expansin del
nmero de tripletes conduce a la ausencia del ARNm de la protena MDPK i.
El mecanismo molecular responsable de este hecho se desconoce, aunque se cree que un

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elevado nmero de repeticiones CTG en el extremo 3 del gen podra de algn modo producir
una disminucin en la tasa de sntesis o de procesamiento del ARNm correspondiente.

Problema. Un nio es diagnosticado clnicamente con la forma temprana de la DM. Las

entrevistas y el estudio clnico de los familiares determinan que su madre posee una forma leve
de la enfermedad, y permiten la construccin del siguiente rbol genealgico 1:

Para realizar un estudio detallado de los portadores, a los individuos que figuran en el rbol
genealgico se les realiz una prueba de diagnstico molecular. Partiendo de sangre perifrica,
la prueba consiste en realizar un Southern blot, digiriendo al ADN con la enzima de restriccin
NcoI y usando como sonda especfica una secuencia que hibrida con una regin del gen MDPK
muy cercana a la ubicacin de los tripletes CTG.
El resultado se muestra a continuacin. Los nmeros corresponden con los individuos del rbol
genealgico. M: marcador de peso molecular

A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de

cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cmo interpreta
el patrn de bandas en cada caso.
B- Explique las diferencias en el patrn de bandas de los individuos 2, 3 y 6.
Relacione con la expresin fenotpica

C- Encuentra discordancias entre los resultados de la prueba molecular y el

diagnstico clnico? En caso afirmativo, indique a qu pueden deberse.
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Los nmeros que figuran en el rbol genealgico hacen referencia al estudio molecular posterior.
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Ejercicio 3

Introduccin. La Fibrosis qustica es la enfermedad autosmica recesiva ms comn en la poblacin de

origen caucsico, y se presenta en uno de cada 2000 a 2500 nacidos vivos y tiene una frecuencia de
portadores de uno cada 20 a 25 nacidos vivos. Los pacientes con fibrosis qustica tienen una conduccin
anormal de cloruros a travs de la membrana apical de las clulas epiteliales, causando secreciones
espesas en las vas areas, pncreas, intestinos, y vas deferens. La enfermedad es causada por mutaciones
en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la Fibrosis Qustica (CFTR) que est ubicado
en el cromosoma 7q31-32., el cual codifica una protena de 1480 aminocidos que funciona como un
canal de cloruro regulado por AMP cclico.
Se han descripto ms de 1000 mutaciones en este gen, muchas de las cuales son muy poco frecuentes.
Pero una mutacin se destaca por ser la ms frecuente. Est presente en cerca del 57% de los cromosomas
fibroqusticos en Argentina y se denomina F508, y consiste en una delecin de tres pares de bases
(CTT) en el exn 10 que resulta en la prdida del aminocido fenilalanina en la posicin 508 de la
protena.

Problema. Una nia recin nacida presenta signos compatibles con la fibrosis qustica, pero el
diagnstico es controversial. Se decide realizar una prueba de diagnstico molecular para
determinar la presencia de la mutacin F508. La prueba consiste en amplificar mediante PCR una
regin del gen que contiene el triplete CTT del exn 10. Los productos de amplificacin se resuelven
luego en un gel de poliacrilamida.

A continuacin se muestra el resultado de la prueba molecular de los miembros de la familia (ver

correspondencia numrica)

C1, C2: controles (individuos de genotipo conocido)

A- Explique el patrn de bandas para cada individuo. Pude explicarse el

diagnstico clnico del probando con esta prueba?

Posteriormente, se realiz la bsqueda de la segunda mutacin ms frecuente, llamada

G551D, que es una mutacin de sustitucin con cambio de sentido que provoca un cambio de
un aminocido de glicina (G) por un cido asprtico (D) en la posicin 551 de la cadena
polipeptdica.

B- Determine si la siguiente estrategia experimental es adecuada para detectar la

mutacin G551D. Justifique su respuesta:

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 Se utilizan primers adecuados para amplificar una regin que contenga a la
zona de la sustitucin. Los productos de amplificacin se resuelven en un gel de
poliacrilamida

Para realizar la bsqueda de la mutacin G551D se utiliz PCR alelo especfica. En este
abordaje experimental uno de los primers del par utilizado slo puede hibridar con la secuencia
si est presente la mutacin buscada. De modo tal que slo habr amplificacin en ese caso, y
de all viene el nombre de esta variante de la tcnica de PCR.
El siguiente es el resultado de la PCR alelo especfica (los nmeros hacen referencia los
individuos analizados):

M: marcadores de peso molecular

CA, CB: controles (individuos de genotipo conocido)

C- Por qu es especialmente importante en esta tcnica usar controles? Expliqu

cul es el genotipo de los controles utilizados (CA,CB)en funcin de su patrn
de bandas
D- Qu conclusin puede sacar de esta prueba para la familia analizada?

Se realizaron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes, que en conjunto permiten

explicar el 84% de los casos. No se pudo encontrar una de estas mutaciones en la
familia estudiada.
Por esta razn se decidi pasar a otra estrategia experimental: secuenciar el gen de
secuencia normal secuencia mutada
CFTR de los miembros de la familia y compararlo con la secuencia normal. Se utiliz el
mtodo de los dideoxi automatizado, en donde cada dideoxi (A,T,C,G) est marcado
con un fluorforo diferente, y la secuencia aparece como una sucesin de picos de
fluorescencia de diferentes colores.
Durante la secuenciacin del exn 3, en la posicin 113, apareci una mutacin que
estaba presente en los individuos 2 y 4, pero no en los individuos 1 y 3.
A continuacin se muestra el fragmento de la secuenciacin que compara la secuencia
normal y la mutada:

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 E- Por qu hay un doble pico en la posicin mutada?
F- Puede concluirse que la mutacin hallada explica el diagnstico clnico de
fibrosis qustica? Discuta

Ejercicio 4

Introduccin. A excepcin de los gemelos idnticos, el material gentico de cada individuo es

nico. Se ha estimado que dos genomas humanos, escogidos al azar, difieren
aproximadamente en uno cada 500 nucletidos. Si el genoma humano contiene 3 109 bases, _

existen entonces, 6 109 bases diferentes entre dos personas ii . Esa variabilidad interindividual
_ 2

puede ser estudiada a nivel fenotpico, es decir, a travs del producto gnico, o a nivel
genotpico mediante el anlisis directo del ADN. Uno de los objetivos del estudio de la
variabilidad humana de inters cada vez mayor con el curso de los aos, es su aplicacin en
pruebas de paternidad y otras relaciones genticas y para la identificacin de seres humanos
involucrados en hechos delictivos, ya sea como vctimas o criminales. Con esos objetivos, la
identificacin se realizaba inicialmente con anlisis morfolgicos, bioqumicos e inmunolgicos,
correspondientes stos ltimos a productos de genes ubicados en una fraccin del genoma
menor del 10%. Quedaba as un 90% de ADN, no codificante, cuyo potencial para el estudio de
la variabilidad humana empez a ser descubierto a partir de los aos 80, cuando se reconoci
que estaba repleto de polimorfismos de secuencia que fueron puestos en evidencia con el uso
de las enzimas de restriccin y los fragmentos de longitud variable que stas generaban
(RFLP)iii.
El genoma humano nuclear extragnico est constituido por secuencias nicas y repetidas. Un
subgrupo de secuencias repetidas que representan aproximadamente el 60% de ellas, son las
secuencias repetidas en tndem, que constituyen un ADN altamente polimrfico y que abrieron
nuevas posibilidades, inimaginables para la identificacin de marcadores con elevado poder de
discriminaciniv
;
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El ADN repetitivo en tndem est constituido por

secuencias que no incluyen genes funcionales y
que se disponen en arreglos de repeticiones, una
al lado de la otra y cada una de ellas contiene
una secuencia central bsica Se clasifican de
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acuerdo al tamao promedio del arreglo en: ADN

satlite, ADN minisatlite y ADN microsatlite
(Figura 1). De estos tipos de ADN, el minisatlite
y el microsatlite son los que mayor importancia
tienen hoy da para resolver problemas en
identificacin humana y pruebas de paternidad.
Los loci ms variables descubiertos en el
genoma humano son las secuencias

Figura 1. Repeticiones en tndem de nmero variable:

mini y microsatlites
minisatlites, conocidas como regiones hipervariables y posteriormente, como repeticiones en
tandem de nmero variable (VNTR). Su hipervariabilidad es debida a la diversidad en el
nmero de reiteraciones de determinadas secuencias de nucletidos las cuales para estos loci,
oscilan entre 7 y unos 30 nucletidos. Existen grandes similitudes en las secuencias de la
unidad central que se repite en un gran nmero de minisatlites. Esta similaridad le sugiri a
Alec Jeffreys, en Inglaterra, que si se empleaban sondas que contuvieran repeticiones de esa
unidad central se podran detectar fragmentos de ADN de longitud variable a travs del mtodo
de transferencia de Southern y producir, para cada individuo un patrn especfico de bandas de
ADN al cual denomin "DNA fingerprinting" o huella digital de ADN 1v 5

Metodologa. Este proceso involucra la digestin del ADN por una enzima de restriccin,
seguida por la separacin de los fragmentos mediante una electroforesis, transferencia del ADN
y la hibridacin con una sonda marcada que reconoce la unidad repetitiva (Southern
propiamente dicho).
La identificacin de individuos, mediante el anlisis de ADN, se basa en el alto nivel de
polimorfismo existente en los loci analizados, que generan un nmero muy alto de genotipos
posibles, a diferencia de los sistemas biolgicos de identificacin clsicos proteicos, tales como
enzimas, grupos sanguneos, etc, permitiendo distinguir un individuo de otro, prcticamente en
cada caso Otra ventaja del anlisis del ADN con respecto a los marcadores protecos, es su
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ubicuidad, ya que puede aplicarse en cualquier clula nucleada y es muy resistente a la

degradacin Con las sondas multilocus o con una batera de 5 a 6 sondas unilocus, con
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heterocigosis de alrededor del 90%, el poder de exclusin puede llegar a 99,99%.

Problema. Los casos 1 y 2, que se muestran ms abajo, intentan determinar si un individuo

que alega ser el padre de un nio es su padre biolgico. A tal fin se ha analizado los VNTR de
un locus de minisatlite con la metodologa descripta previamente.

A- Explique por qu el patrn de bandas de cada individuo consta de dos bandas

B- Teniendo en cuenta los patrones de bandas Qu conclusiones puede sacar en
cada uno de los casos acerca del lazo biolgico entre el padre** y el nio?

C- Las conclusiones obtenidas con esta prueba Son un 100% certeras? Discutir

Ejercicio 5

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Determine para cada uno de los siguientes casos si hara alguna prueba molecular para realizar el
diagnstico. En caso afirmativo, diga cul es la prueba que considera ms adecuada, y describa
brevemente como discrimina un diagnstico positivo de uno negativo.

1- Enfermedad monognica con gen identificado. La mutacin ms frecuente es una sustitucin (A

por T) en una posicin puntual.
2- Enfermedad monognica con patrn de herencia ligado al X recesivo y gen no descripto.

3- Enfermedad autosmica dominante con gen identificado. Una de las mutaciones ms frecuentes
es una insercin de un par de bases en una posicin particular.

4- Enfermedad autosmica dominante con gen conocido. El mecanismo mutacional implica

expansin de tripletes.

5- Enfermedad multifactorial. Algunos de los genes involucrados se conocen

6- Enfermedad cromosmica. Translocacin robertsoniana entre el cromosoma 14 y el 21

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i
Carango P, et al. Absence of myotonic dystrophy protein kinase (MDPK) mRNA as a result of a triplet repeat expansion in myotonic
dystrophy. Genomics 1993; 18: 340-348.

ii
Pena, S.D.J, et al. DNA diagnosis of human genetic individuality. J. Mol. Med. 73: 555-564, 1995.

iii
Bohm, I, et al. Oligonucleotide DNA fingerprinting: Results of a multicenter study on realiability and validity. In: DNA fingerprinting:
State of Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basilia, Birkhuser Verlag, 1993, pp. 257-260.

iv
Stratan, T. The human genome BIOS Scientific publishers,1972, p. 160.

v
Jeffreys, A.J., et al. The efficiency of multilocus DNA fingerprint probes for individualization and establishment of family relationship,
determined from extensive casework. Am. J. Hum. Genet. 48: 824-840,1991.