Tecnicas de Extracción Bueno PDF

Javier Seorns
Tema 2.
La preparacin de la muestra
F. Javier Seorns Rodrguez
Seccin Departamental de Ciencias de la Alimentacin
M - 08 despacho 502
E-mail: javier.senorans@uam.es
Pgina web: www.uam.es/javier.senorans
Asignatura de Anlisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Grado en Nutricin Humana y Diettica
Tema 2. La preparacin de la muestra

Aislamiento y concentracin de compuestos en
alimentos.
Tcnicas de muestreo de la fase vapor: el anlisis del
espacio de cabeza (mtodo esttico y mtodo dinmico).
Tcnicas actuales de concentracin del espacio de
cabeza.
La microextraccin en fase slida (SPME).
La extraccin en fase slida (SPE).
La extraccin supercrtica analtica (SFE).
La extraccin acelerada con disolventes (ASE).
La extraccin asistida por microondas (MAE).
Aplicaciones al anlisis del aroma de alimentos y al
anlisis de residuos.
Anlisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Grado en Nutricin Humana y Diettica 1
Javier Seorns
Nuevas tcnicas de preparacin de la muestra
La mayora de las muestras de alimentos que se

analizan por mtodos instrumentales de separacin
son demasiado complejas, estn demasiado diluidas
o son incompatibles con el sistema cromatogrfico,
lo que impide su introduccin directa
Consecuencia: se necesita preparar la muestra antes

de su introduccin en el sistema,
mediante fraccionamiento, extraccin
o pre-separacin.
Nuevas tcnicas de preparacin de la muestra
CROMATOGRAFA DE GASES ALTA

CON COLUMNAS CAPILARES RESOLUCIN
PROBLEMA PREPARACIN
DE MUESTRA
MUESTRA GC
PREPARACIN
MUESTRA GC
DE MUESTRA

Javier Seorns
Necesidad de nuevas tcnicas de preparacin de

muestras de alimentos
lentitud y laboriosidad
Problemas actuales de
empleo de grandes cantidades
mtodos oficiales y de disolventes txicos
tradicionales: poca selectividad
poco rendimiento
Mtodos tradicionales de preparacin de la muestra:

-ms de 2/3 del tiempo del analista
-responsable de al menos 1/3 del error en el anlisis
-enorme volumen de disolventes
Necesidad de nuevas tcnicas de preparacin de

muestras de alimentos
Creciente demanda de :
mayor productividad en los laboratorios

anlisis ms rpidos
mtodos ms automatizados
posibilidad de automatizacin
tcnicas limpias y selectivas
Metas
mayor rapidez y eficacia
fiabilidad
Idealmente, adems, baratas, sencillas, sin

disolventes txicos

Javier Seorns
Tcnicas instrumentales de preparacin de muestras

de alimentos
Posibilidades clsicas:
Cristalizacin
Destilacin
Precipitacin
Extraccin con disolventes
LLE, Soxhlet, etc.
Otras:
Dilisis y microdilisis
Filtracin
Ultrafiltracin
Separaciones con membranas

de alimentos
Tcnicas basadas en la cromatografa:
Cromatografa en capa fina (TLC)

Cromatografa en columnas abiertas (flash)
LC prep. cromatografa preparativa
Acoplamiento LC-GC
SFC preparativa

Javier Seorns

de alimentos
Tcnicas basadas en la extraccin
Extraccin Slido-liquido
Extraccin Lquido-lquido
Extracciones modernas (ASE, MAE, SFE, etc.)
SPE, SPME, etc.
Fundamentos de la Cromatografa en capa fina

(TLC, Thin Layer Chromatography)
Fundamento
La cromatografa en capa fina al igual que otras tcnicas

cromatogrficas se basa en la retencin y elucin debido
a la diferente interaccin del analito entre una fase slida
y otra lquida.
La placa se introduce en un recipiente que contiene la

fase mvil y alineada con una tira de papel adsorbente. El
disolvente asciende por capilaridad y la separacin se
basa en la diferente velocidad a la que los distintos
analitos presentes en la muestra ascienden por la placa.

Javier Seorns
Fundamentos de la Cromatografa en capa fina
Clculo de los Factores de Retencin (RF) DA

RF =
Para ello se emplea la siguiente formula DS
Frente del disolvente

Posicin del analito
tras la cromatografa
origen
siendo DA la distancia recorrida por el analito y DS la distancia

recorrida por el disolvente o frente del disolvente.
Cromatografa en columna
Fundamento
La cromatografa en columna al igual que otras tcnicas cromatogrficas se basa en la

retencin y elucin debido a la diferente interaccin del analito entre una fase slida que
rellena una columna abierta y otra lquida (normalmente un disolvente orgnico o una mezcla
de disolventes).

Javier Seorns
Esquema Tema 2. La preparacin de la muestra
Introduccin a las tcnicas de preparacin de muestra

Extraccin slido-lquido
Extraccin lquido-lquido
Cromatografa en capa fina y cromatografa en columna
Micro-Extraccin en Fase Slida (SPME, Solid Phase

Micro-Extraction)
Extraccin Asistida por Microondas (MAE, Microwave

Assisted Extraction)
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE, Accelerated

Solvent Extraction)
Extraccin en Fase Slida (SPE, Solid Phase Extraction)
Diferentes tcnicas para problemas distintos
Aroma y compuestos voltiles Espacio de cabeza

de alimentos y bebidas cuyo
aroma o sabor es importante:
vinos, quesos, aceites esenciales, etc SPME
Componentes naturales o Extraccin en

contaminantes de alimentos
lquidos: fase slida
zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Muestras slidas de alimentos: MAE

Componentes mayoritarios y minoritarios ASE
de todo tipo de alimentos
(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)
SFE
Residuos y contaminantes en alimentos

Javier Seorns
Determinacin de compuestos
voltiles en muestras de
alimentos
Cromatografa de gases
Problemas:
trazas
Tcnicas de aislamiento y aislamiento compuestos voltiles del
concentracin de compuestos alimento o del producto a analizar
voltiles de la matriz
se requieren grandes cantidades de
producto para obtener la adecuada
cantidad para anlisis por CG o CG-EM
Tcnicas de aislamiento y concentracin de compuestos

voltiles de la matriz
Nuevas tcnicas basadas en el

anlisis del espacio de cabeza
- se basan en la preconcentracin, para

posterior anlisis y determinacin, de los
compuestos voltiles que se desprenden del
alimento slido o lquido
Objetivos:
extraer analitos de inters lo ms concentrados posible

elevada recuperacin cuantitativa
mnimas interferencias

Javier Seorns
Micro-extraccin en fase slida (SPME)
Principios de la Tcnica
Se basa en la adsorcin de los compuestos orgnicos del
alimento por una fase slida inmovilizada sobre una fibra de
slice fundida.
Una vez alcanzado el equilibrio, los compuestos adsorbidos se

desorben trmicamente en el inyector de un cromatgrafo de
gases
La matriz puede ser aire, agua, muestras lquidas, etc.
Alternativamente, tambin se puede disolver el extracto en un

disolvente orgnico para analizarlo por HPLC.
Microextraccin en fase slida (SPME)
SPME es una nueva tcnica de extraccin para compuestos
orgnicos, que se basa en la adsorcin de los analitos de la matriz
(aire, agua, muestras lquidas, etc.) por una fase slida inmovilizada
sobre una fibra de slice fundida.
Si se emplea un recubrimiento polimrico, la cantidad de analito

adsorbida por el recubrimiento en equilibrio est relacionada
directamente con la concentracin en la muestra.

Javier Seorns
Esquema del sistema

para SPME y detalle de
la fibra adsorbente.
La fibra es de slice fundida

recubierta de un polmero
adsorbente selectivo.

Principio Terico
KfhVfVsCo
n=
KfhVf+Vs
n: masa de analito adsorbida por el recubrimiento
Vf,Vs: Volumen de recubrimiento y de muestra
K: coeficiente de reparto del analito entre el
recubrimiento y la muestra; [K = f ( T, fibra)]
Co: concentracin inicial del analito en la muestra

Javier Seorns
En relacin al reparto de los analitos.......
Principales variables que influyen en el proceso de reparto:
constante de distribucin
temperatura de la muestra y tipo de calentamiento
25 C
130 C
200 C
Ventajas y desventajas de la Microextraccin en fase

slida
Es una tcnica rpida y relativamente sencilla
Existen diferentes fibras adsorbentes disponibles en el

mercado que permiten cierta selectividad
Se puede acoplar fcilmente a otras tcnicas de separacin

(GC y HPLC)
No requiere ningn disolvente
SPME es una tcnica econmica (reutilizable)
Est limitada a muestras lquidas o compuestos voltiles

(espacio de cabeza)
No permite conservar el extracto para otros anlisis

Javier Seorns
Aplicaciones:
Deteccin de enranciamiento de aceites por SPME de
aldehdos y otros subproductos de la oxidacin
Anlisis de aromas naturales y extraos de alimentos
Aromas de vinos, bebidas espirituosas, zumos y otras

bebidas
Diferenciacin de tipos de caf, origen, tueste, etc.
Compuestos azufrados en cerveza y otras bebidas

alcohlicas
Caracterizacin y control de calidad de alimentos de alto

valor: jamones, trufas, pats, etc.
Micro-Extraccin en Fase Slida (SPME)
Ejemplo de anlisis de compuestos voltiles en un zumo de fruta

sin usar ningn disolvente txico

Javier Seorns


lquidos: fase slida

SFE
Tcnicas de Purga y Trampa y Desorcin Trmica
Procedimiento
arrastre continuo de la muestra por medio de un flujo de gas
inerte (He o N2)
captura o adsorcin de los compuestos voltiles en una trampa
adsorbente
desorcin, mediante calentamiento, de los compuestos
retenidos

Javier Seorns
Tcnica de Purga y Trampa
Arrastre y captura:
Gas inerte: para no alterar componentes de la muestra

Temperatura ambiente
2 5
P&T MS GC
Tcnica de Purga y Trampa
Ventajas y desventajas P&T:
Realiza, de forma automtica, las etapas de arrastre, captura y

desorcin
Elevada reproducibilidad
Evita manipulacin de muestra
No requiere ningn disolvente
Elevada sensibilidad
No existen interferencias de compuestos no voltiles de la matriz
Optimizacin de todas las variables en conjunto

Javier Seorns


lquidos: fase slida

SFE
Esquema Tema 2. AISA


Micro-Extraction)


Solvent Extraction)

Javier Seorns

SFE


lquidos: fase slida
Extraccin slido-lquido: Extraccin de alimentos

slidos con disolventes
Mtodo tradicional de extraccin

Disolvente
+ extracto
disolvente orgnico (lquido) caliente,
en ebullicin, en contacto con
muestra de alimento (slido)
(ej. Soxhlet)
Temperatura mxima del Disolvente=

= Punto de ebullicin (60-80C)
Disolvente

Javier Seorns
Necesidad de nuevas tcnicas de extraccin de

alimentos slidos
Mtodos tradicionales de extraccin slido-lquido :

lquido en ebullicin en contacto con muestra slida
difusividad del disolvente lenta

intercambio de energa poco eficaz
procesos estticos o semi-estticos
Extraccin lenta y poco eficaz
disolventes convencionales
calor como nica energa
Extraccin lenta y poco selectiva

de alimentos
Pasos previos:
Homogeneizar la muestra
Reducir su tamao
Evitar cambios en la muestra:
Inactivacin enzimtica
Proteccin de lpidos
Inhibicin del crecimiento microbiano
Cambios fsicos, agua, estructura, etc.
Congelacin, secado, tratamiento trmico, conservantes

qumicos (o una combinacin de varios de ellos)

Javier Seorns
Extractor Soxhlet
Mtodo tradicional, muy aceptado y

extendido
Lento
Esquema Tema 2. La preparacin de la muestra


Micro-Extraction)


Solvent Extraction)

Javier Seorns
Tcnicas instrumentales de extraccin de muestras

slidas de alimentos
Principios comunes a las nuevas tcnicas de
extraccin:
Extraccin asistida por microondas (MAE).
Extraccin acelerada con disolventes (ASE).
Extraccin supercrtica analtica (SFE).
Se emplean disolventes de alta difusividad elevando la temperatura

y controlando la presin
Debido a los mayores coeficientes de difusin, las extracciones se

aceleran considerablemente
Tcnicas avanzadas de preparacin de muestras

de alimentos slidos
Extracciones de slidos
con mayor rapidez y eficacia
selectividad rendimiento
Lquidos a alta T
Fluidos
Supercrticos Energa Presin
localizada elevada
SFE MAE ASE

Javier Seorns
Principios de la Extraccin Asistida por

Microondas (MAE)
Se extrae la muestra aplicando energa de microondas en un

disolvente adecuado.
Energa de microondas:
calienta selectivamente unas especies qumicas frente a otras
produce extracciones rpidas y con cierta selectividad.
El calentamiento producido depende de la naturaleza qumica de la

matriz y del disolvente
Cuanto mayor es la constante dielctrica, mayor es la absorcin de

energa.
Extraccin Asistida por Microondas (MAE)

Procedimiento habitual
Cuando el disolvente absorbe energa microondas:
La muestra se coloca en un recipiente cerrado

se calienta a temperaturas mayores que su punto de
ebullicin durante un tiempo muy corto (aumenta la presin)
despus se enfra y se despresuriza
se separa o filtra el extracto

Javier Seorns
Equipo necesario:
Microondas
Celdas apropiadas
Caractersticas de las celdas

no absorber microondas,
ser inertes,
fciles de abrir y cerrar
reutilizables
resistentes a altas P y temperaturas
Esquema de una celda comercial

con control de presin y de
temperatura para MAE
Principales variables:
Relativas a la muestra
Disolvente:
composicin y propiedades
constante dielctrica
Potencia de irradiacin
Caudal de disolvente (en procesos continuos)
Tiempo de irradiacin y extraccin

Javier Seorns
Ventajas
MAE es ms rpida (30 seg.-10 min) y emplea menos
disolvente (1-15 mL) que la extraccin lquida tradicional
La energa esta localizada y se aprovecha mejor (menor
consumo)
El tamao de muestra puede ser muy variado
MAE es una tcnica robusta y fcil de usar
Se pueden extraer varias muestras a la vez
No hace falta deshidratar o procesar la muestra

Desventajas
MAE depende de la matriz y limita los disolventes que se

pueden utilizar
MAE plantea problemas de seguridad
El extracto queda en contacto con la muestra al acabar la
extraccin y necesita una posterior filtracin o separacin
MAE es difcil de automatizar o acoplar a tcnicas de
anlisis
Degradacin de compuestos trmicamente lbiles
Poca selectividad en la extraccin

Javier Seorns
Ejemplos de Aplicaciones:
Extraccin de grasa de carne,
huevo y slidos lcteos
Extraccin de oleorresina de
pimentn
Extraccin de monoterpenoles de
mostos para anlisis por GC
Extraccin de esencias de vainilla,

menta, ginseng, ctricos, etc.
Esquema de un extractor
asistido por microondas Extraccin de contaminantes
(residuos de pesticidas, PAHs,
PCBs, etc.)
Ejemplo de Extraccin Asistida por Microondas (MAE)
Extraccin de grasa de carne, huevo y slidos lcteos

Homogeneizacin de la muestra
La muestra se coloca en un recipiente abierto adecuado
Se aade el disolvente: ter de petrleo o hexano
Se irradia a 300 W durante 60 + 90 segundos
El extracto se filtra a vaco para separar la muestra del

disolvente
Se concentra el extracto, evaporando el disolvente en

rotavapor

Javier Seorns

de alimentos slidos
Lquidos a alta T
Fluidos
localizada elevada
SFE MAE ASE
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)
nueva tcnica de extraccin
disolventes habituales
presiones y temperaturas elevadas
extracciones rpidas y efectivas de
muestras slidas
Temperaturas: 30 - 200 C
Presiones: 100 - 140 atm
Disolventes: orgnicos, agua, mezclas, etc.

Muestras: slidas

Javier Seorns
nueva tcnica de extraccin

disolventes habituales
presiones y temperaturas elevadas
extracciones rpidas y efectivas de muestras slidas
Efectos interesantes que se producen a temperaturas

elevadas:
mejores solubilidades de los analitos en lquidos
aumento de las cinticas de desorcin de los compuestos
de la matriz
Procedimiento
La muestra slida se coloca en un recipiente que se sella
Se llena con disolvente y se calienta a temperatura mayor
que el punto de ebullicin del disolvente, provocando un
gran aumento de la presin en la celda.
Durante el tiempo de extraccin parte del lquido es

liberado y recogido en un vial.
Al final de la extraccin, el extracto se expulsa de la celda
con nitrgeno y se transfiere automticamente a un vial.

Javier Seorns

Principales variables:
Relativas a la muestra
Disolvente o mezcla de disolventes
Tiempo de extraccin
Temperatura de extraccin
Nmero de ciclos
Celda de
Extraccin
Vlvula de
purga Vlvula de Horno
presin
Bomba
Vlvula Esttica
Salida Vial de
Disolvente Nitrgeno aire Vial colector
desecho

Javier Seorns
Extraccin de grasa de carne,
huevo y slidos lcteos
Pesticidas en harinas, piensos,
etc.
Micotoxinas en cereales y frutos
secos
Imagen de un extractor Extraccin de productos naturales

con disolventes
presurizados (ASE)
Extraccin de contaminantes
(residuos de pesticidas, dioxinas,
PCBs, etc.)

de alimentos
Ventajas
ASETM es ms rpida que los procedimientos de extraccin
lquida tradicionales <15 min frente a 2-24 h
ASE emplea menos disolvente

<15 mL para 10 g de muestra vs. 50-500 mL
ASE es ms eficaz independientemente de la matriz
ASE es automatizable y puede extraer muestras

secuencialmente
El desarrollo de mtodos es mucho ms sencillo

Javier Seorns

de alimentos
Desventajas
Las extracciones son ms completas, pero menos

selectivas
ASE requiere el empleo de temperaturas ms altas

que en SFE
El equipo tiene un precio elevado

de alimentos slidos
Lquidos a alta T
Fluidos
localizada elevada
SFE MAE ASE

Javier Seorns
Extraccin Analtica con Fluidos Supercrticos (SFE)
Se extrae con un fluido a presiones y temperaturas
mayores que las de su punto crtico
extrae rpida y selectivamente algunos compuestos
Variando la presin (la densidad del fluido) se controla

la solubilidad de los analitos en dicho fluido.
Qu es un Fluido Supercrtico?
Diagrama de fases
Fluido
Supercrtico
Presin Lquido
Slido
Punto
Crtico
Gas (Para CO2 es
31.3C y
72.9 atm)
Temperatura

Javier Seorns
Extraccin Analtica con Fluidos Supercrticos (SFE)
El fluido supercrtico ms utilizado es el dixido de

carbono (CO2)
Propiedades del dixido de carbono

Moderadas presin (72.9 atm) y temperatura (31.3C)
crticas
Gas a temperatura ambiente, no deja residuos
No es txico ni inflamable
Precio moderado y sin problemas de eliminacin
Baja polaridad, se pueden aadir modificadores en
pequea proporcin para extraer compuestos polares

lquidos: fase slida

flavor es importante:

SFE

Javier Seorns
Fundamentos de la Extraccin Lquido-Lquido
Particin de los componentes

de una mezcla
entre dos lquidos inmiscibles
de diferente densidad
Extraccin en fase slida (SPE)
SPE es una tcnica de extraccin que se basa en la
retencin sobre un adsorbente slido de los compuestos
deseados disueltos en una muestra lquida.
La adicin de un eluyente permite eliminar los componentes
de la matriz que interfieren, para despus eluir y concentrar
los analitos de inters.
La extraccin en fase slida sustituye a la extraccin
lquido-lquido clsica.

Javier Seorns
Procedimiento de la Extraccin en Fase Slida (SPE)
Muestra Acondicio- Adicin de Lavado Elucin del

namiento muestra analito
Extraccin en Fase Slida (SPE)
Eliminacin de pigmentos de
vegetales y hortalizas
Retencin de antocianinas y otras
interferencias en anlisis de
pesticidas en vinos
Vitaminas en zumos
Residuos de antibiticos en leches

Javier Seorns
Extraccin en Fase Slida (SPE)
Imagen de un colector
mltiple para SPE con
aspiracin a vaco.
Permite la extraccin
simultnea de 20 tubos con
muestra.
Equipo automtico para SPE con

microplacas de 96 / 384
Ventajas y desventajas de SPE
Es una tcnica muy sencilla y rpida

Existen numerosos adsorbentes disponibles en el
mercado para SPE
Se puede acoplar a otras tcnicas de separacin
Emplea poco o ningn disolvente
SPE es muy efectiva para extraer compuestos
polares o apolares de muestras lquidas
Se puede automatizar
Est limitada a muestras lquidas

Javier Seorns
Sumario de propiedades de nuevas tcnicas de

extraccin
Eficaces y selectivas
Rpidas: tiempos de extraccin de 1 - 30 minutos
Posibilidad de automatizacin
Ninguna tcnica es ideal para todos los analitos
de todas las matrices
Las nuevas tcnicas son cada vez ms comunes y
van a continuar su expansin debido a sus
numerosas ventajas
Bibliografa recomendada
Libros sobre Anlisis Instrumental incluyendo

preparacin de muestra:
Rubinson K.A., Rubinson J.F. (2001). Anlisis Instrumental.
Prentice Hall-Pearson. Madrid.
Matissek R., Schnepel F.M., Steiner G. (1998). Anlisis de los

Alimentos. Fundamentos, Mtodos, Aplicaciones. Acribia.
Zaragoza.
Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. (2001). Principios de Anlisis

Instrumental. [Quinta Edicin] McGraw-Hill. Madrid.


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Asignatura de Anlisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Tema 2. La preparacin de la muestra

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Nuevas tcnicas de preparacin de la muestra

La mayora de las muestras de alimentos que se

Consecuencia: se necesita preparar la muestra antes

Nuevas tcnicas de preparacin de la muestra

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Necesidad de nuevas tcnicas de preparacin de

Mtodos tradicionales de preparacin de la muestra:

Necesidad de nuevas tcnicas de preparacin de

mayor productividad en los laboratorios

Idealmente, adems, baratas, sencillas, sin

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Tcnicas basadas en la cromatografa:

Cromatografa en capa fina (TLC)

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Tcnicas instrumentales de preparacin de muestras

Tcnicas basadas en la extraccin

Fundamentos de la Cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina al igual que otras tcnicas

La placa se introduce en un recipiente que contiene la

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Fundamentos de la Cromatografa en capa fina

Clculo de los Factores de Retencin (RF) DA

Frente del disolvente

siendo DA la distancia recorrida por el analito y DS la distancia

La cromatografa en columna al igual que otras tcnicas cromatogrficas se basa en la

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Esquema Tema 2. La preparacin de la muestra

Introduccin a las tcnicas de preparacin de muestra

Micro-Extraccin en Fase Slida (SPME, Solid Phase

Extraccin Asistida por Microondas (MAE, Microwave

Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE, Accelerated

Extraccin en Fase Slida (SPE, Solid Phase Extraction)

Diferentes tcnicas para problemas distintos

Aroma y compuestos voltiles Espacio de cabeza

Componentes naturales o Extraccin en

Muestras slidas de alimentos: MAE

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Tcnicas de aislamiento y concentracin de compuestos

Nuevas tcnicas basadas en el

- se basan en la preconcentracin, para

extraer analitos de inters lo ms concentrados posible

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Micro-extraccin en fase slida (SPME)

Una vez alcanzado el equilibrio, los compuestos adsorbidos se

La matriz puede ser aire, agua, muestras lquidas, etc.

Alternativamente, tambin se puede disolver el extracto en un

Microextraccin en fase slida (SPME)

Si se emplea un recubrimiento polimrico, la cantidad de analito

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Microextraccin en fase slida (SPME)

Esquema del sistema

La fibra es de slice fundida

Microextraccin en fase slida (SPME)

Co: concentracin inicial del analito en la muestra

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