I) Biomolculas 1) Mtodos de estudio de la clula

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MTODOS DE ESTUDIO DE LA CLULA

CLASIFICACIN

Clasificaremos los mtodos que se utilizan para el estudio de la clula en dos grandes
grupos:

I) Tcnicas para el estudio fisicoqumico: sirven para conocer la composicin y relacionar esta
composicin con las estructuras celulares. Estos mtodos son:

a) Centrifugacin

b) Cromatografa

c) Electroforesis

d) Cultivos "in vitro"

II) Tcnicas para el estudio morfolgico de la clula. Nos permiten conocer cmo es su forma,
su tamao y su estructura. Son, fundamentalmente:

a) Microscopa ptica

b) Microscopa electrnica

1) Microscopio electrnico de Trasmisin (MET)

2) Microscopio electrnico de barrido (MEB)

I) TCNICAS PARA EL ESTUDIO FISICOQUMICO DE LA CLULA

Este tipo de mtodos se utilizan para el aislamiento, localizacin e identificacin de las

sustancias que constituyen la materia viva.

Presentan dos problemas principalmente:

a) Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas.

b) La mayora de las sustancias que encontramos en los seres vivos son, a su vez, de una
gran complejidad.

Pensemos,por ejemplo, que una sola de los varios miles de protenas que contiene una clula
puede estar formada por ms 5000 aminocidos.

Pasemos a continuacin al estudio de cada uno de estos mtodos.

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A) CENTRIFUGACIN

Consiste en la separacin de los componentes

de una mezcla en funcin de las diferencias entre
las velocidades que presentan al someterlos a
elevadas aceleraciones (g). Esto se consigue
haciendo girar la mezcla en un rotor a un gran
nmero de vueltas por minuto. Los aparatos
empleados con este fin se denominan
ultracentrfugas.

Esta tcnica requiere los siguientes pasos:

Fig. 1 Homogeneizador.
1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEI-
ZACIN: El material biolgico, por ejemplo: un
fragmento de tejido del hgado, es triturado para
disgregarlo y romper las membranas celulares.

La rotura de las membranas deja en libertad los

orgnulos celulares y el contenido del
hialoplasma. Si la homogeneizacin se realiza
suavemente, los orgnulos permanecern
intactos. Obtendremos as una "papilla" que
estar compuesta de restos de membranas,
orgnulos celulares, ncleos, molculas libres y
agua.
Fig. 2 Centrfuga.
2) CENTRIFUGACIN: Las ultracentrfugas son
mquinas que consiguen velocidades de rotacin
muy elevadas, hasta 500.000 v/mn. En el interior
de estos aparatos se alcanzan grandes
aceleraciones que se miden en g (1g=9,8 m/s2).
En una ultracentrfuga pueden alcanzarse hasta
100.000 g. Los materiales biolgicos sometidos a
estas aceleraciones se desplazan hacia el fondo
de los recipientes que los contienen con
velocidades que dependen de su masa, de su
forma y volumen, y de la naturaleza del medio en
el que se realice la centrifugacin.
Fig. 3 Cromatografa de papel.
B) CROMATOGRAFA

Se fundamenta en la separacin de los

componentes de una mezcla por sus diferencias
de absorcin. stas diferencias van a ser debidas
a las fuerzas de Van der Wals que se establecen
entre los componentes de la mezcla y una
sustancia que acta de fase estacionaria. Segn
la naturaleza de la fase estacionaria, tendremos
los siguientes tipos de cromatografa:

1) CROMATOGRAFA SOBRE PAPEL: Se

emplea para la separacin de sustancias
qumicas que presenten propiedades muy
parecidas. Se opera de la siguiente manera. Una Fig. 4 Cromatografa de gases.
pequea cantidad de la mezcla a separar se
deposita sobre un fragmento de papel poroso en el que quedar embebida. A continuacin se

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introduce el borde del papel en una sustancia en la que sean solubles los componentes de la
mezcla que queremos separar. El disolvente se desplazar por capilaridad y los ir
arrastrando. Los componentes de la mezcla viajarn ms o menos rpido segn establezcan
fuerzas ms o menos grandes con las molculas del papel. Para observar los componentes
ya separados se emplean reacciones coloreadas especficas.

2) CROMATOGRAFA DE GASES: El aparato consiste en un serpentn largo y delgado cuyas

paredes estn impregnadas de un lquido (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza
y atraviesa el serpentn transportada por un gas. La fase estacionaria retiene ms o menos los
diferentes componentes de la mezcla. stos se detectan cuando al atravesar una llama entran
en combustin, lo que aumenta la conductividad elctrica del detector. Este mtodo tiene la
ventaja de necesitar pequesimas cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias
muy parecidas qumicamente; por ejemplo: cidos grasos,azcares u hormonas.

C) ELECTROFORESIS

En este mtodo, la mezcla a separar se

deposita en una cubeta sobre un soporte de tipo
poroso (acetato de celulosa o tambin gel de
almidn). A continuacin se establece una
diferencia de potencial entre los extremos del
soporte. Las sustancias que componen la mezcla
se desplazarn en funcin de su carga elctrica.

Naturalmente este mtodo se emplear con

sustancias que presenten cargas elctricas
(protenas y cidos nuclicos)
Fig. 5 Cubeta para electroforesis.
D) CULTIVOS IN VITRO

Estos mtodos nos van a permitir mantener

lneas celulares en el exterior de un organismo en
condiciones favorables a su multiplicacin. La
gran ventaja va a ser la facilidad para el
tratamiento del material biolgico y su
estandarizacin.

Las clulas extradas deben mantenerse para

su cultivo en un medio con las condiciones fsicas
y qumicas adecuadas y suministrarles aquellas
sustancias que ellas no son capaces de
sintetizar. En la actualidad se venden medios de
cultivo concretos para cada tipo celular y que Fig. 6 Cultivo de bacterias en
cpsula de petri.
permiten mantener los cultivos durante largos
perodos de tiempo.

II) MTODOS MORFOLGICOS

Los mtodos morfolgicos nos van a permitir la observacin directa de la estructura celular.

El ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre s 0,2 mm. ste es el
poder separador o poder de resolucin del ojo. Las clulas de mamfero suelen tener unos
0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellas
detalles estructurales. El microscopio va a permitir su observacin al aumentar el poder de
resolucin del ojo.

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CLASES DE MICROSCOPIOS

A) MICROSCOPIO PTICO O FOTNICO

1) FUNDAMENTO: Funciona de la siguiente

manera: Una fuente luminosa enva rayos de luz ocular
a una primera lente, llamada condensador, que
concentra los rayos de luz sobre el objeto a
observar. Estos rayos atraviesan el objeto y una revolver
lente denominada objetivo da una imagen
objetivo
aumentada de ste. Una segunda lente, el pinzas
ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por el
objetivo. Esta ltima imagen es la que ser macromtrico platina

recibida por el observador. micromtrico Fuente de

iluminacin

2) PREPARACIN DEL MATERIAL: En el

microscopio ptico la luz atraviesa el objeto a
observar. Si ste es muy grueso, la luz no lo
atravesar y el objeto aparecer demasiado Fig. 7 Partes del miccroscopio
oscuro; adems se superpondrn los diferentes ptico.
planos dando una imagen borrosa. Si el objeto es
demasiado delgado o muy transparente, no se
observarn sus estructuras. En cualquier caso, 16 ocular
deberemos realizar una preparacin.

En general, una preparacin requiere las

siguientes etapas
revolver

1- CORTE. Los objetos demasiado 10 objetivos

gruesos son cortados mediante aparatos
denominados microtomos. stos permiten macromtrico
platina

realizar cortes de apenas unas micras de diafragma

micromtrico lmpara
grosor, corrientemente entre 3 y 20 .
El tejido destinado al corte debe
congelarse o incluirse en parafina para Fig. 8 Partes del miccroscopio
darle una mayor consistencia y que se ptico.
pueda cortar con facilidad.

2- FIJACIN. Su fin es matar a las clulas con la menor alteracin de las estructuras
posible, para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el
metabolismo celular o por la descomposicin. Como fijadores se emplean
determinadas sustancias qumicas (por ejemplo: formaldehdo y tetrxido de osmio).

3- DESHIDRATACIN. La extraccin del agua del interior de las clulas permitir

tambin una mejor conservacin y la penetracin de los colorantes. Para deshidratar el
material a observar se le sumerge en alcoholes de cada vez mayor graduacin que por
dilucin irn extrayendo el agua.4- TINCIN. Es la coloracin de las clulas o de partes
de stas para que resalten y posibilitar as su observacin. Algunos colorantes son
selectivos pues tien partes concretas de la clula.

Existen dos clases de colorantes:

a) Los colorantes vitales. Que tien las estructuras celulares pero sin matar a las
clulas (por ejemplo: el verde jano, el rojo neutro, el azul tripn, el azul de metileno).

b) Los colorantes no vitales. Que matan a las clulas (eosina, hematoxilina).

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5- MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre
un porta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre
"porta" y "cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duracin
limitada y slo sirven para la observacin momentnea o a lo sumo de unos das. Si se
desea una mayor duracin debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina o en
euparal.

B) EL MICROSCOPIO ELECTRNICO

Existen dos clases de microscopios electrnicos:

B1) Microscopio electrnico de trasmisin (MET).

B2) Microscopio electrnico de barrido (MEB).

Fig. 9 Fundamento del microscopio ptico. Fig. 10 Fundamento del microscopio

electrnico de trasmisin (MET).

B1) EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN (MET)

1) FUNDAMENTO:

El microscopio electrnico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos tericos de De
Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partculas. Como ondas
pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al ser partculas
negativas pueden ser desviadas por campos elctricos que actan como lentes.

En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio ptico. Un ctodo emite un haz

de electrones que son acelerados por la aplicacin de una diferencia de potencial entre el
ctodo y el nodo. El flujo de electrones es concentrado sobre el objeto por una primera lente
magntica que hace las veces de condensador. Los electrones atraviesan la muestra. Una
segunda lente magntica, el objetivo, da una imagen aumentada del objeto. Una tercera lente,
el ocular, aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. La imagen final es proyectada
sobre una pantalla o fotografiada.

Los microscopios electrnicos permiten aumentos tiles que van de 2000 a 100.000 pudiendo
llegar hasta 600.000. Los microscopios electrnicos son aparatos de hasta 2 m de alto y
llegan a pesar 500 kg.

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2) PREPARACIN del MATERIAL

Los electrones necesitan desplazarse en el vaco, esta es la razn por la que no es posible la
observacin de clulas vivas al microscopio electrnico.

2-1) FIJACIN. Las clulas son fijadas mediante fijadores no coagulantes. Los ms
corrientes son el tetrxido de osmio (OsO4), el formaldehdo (HCHO) y el
permanganato potsico (MnO4K). Los metales pesados que algunos contienen se fijan
selectivamente a las diferentes estructuras celulares. Aquellas que retengan ms los
metales aparecern ms oscuras. Es por esto que la imagen depende mucho del tipo
de fijador utilizado.

2-2) DESHIDRATACIN e INCLUSIN. La pieza es deshidratada e infiltrada mediante

una resina o plstico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte.

2-3) CORTE. Los cortes se realizan mediante ultramicrotomos de cuchilla de vidrio o de

diamante. Los cortes ms finos (0,03) son depositados sobre un tamiz y dispuestos
para su observacin al microscopio.

B2) MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB)

Este tipo de microscopio permite obtener imgenes tridimensionales del objeto a estudiar.
Primero se efecta un sombreado metlico de la superficie de la muestra, y la rplica obtenida
es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se forman son captados y
convertidos en imgenes sobre una pantalla de televisin. Estos microscopio son muy tiles
para revelar estructuras anatmicas submicroscpicas, sin embargo su aumento no suele
pasar de 20.000.

Microscopio ptico Microscopio electrnico

Fuente de iluminacin: La luz Fuente de iluminacin: electrones

Se pueden ver seres vivos No se pueden ver los seres vivos

Poco aumento (X1000) Mucho aumento (X300 000)

Se observa la estructura Se observa la ultraestructura

Preparaciones sencillas Preparaciones complejas

Aparato relativamente barato Instrumento muy caro

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