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Dialnet EspectroscopiaDeResonanciaMagneticaNuclearDeAltaRe 3433985
Dialnet EspectroscopiaDeResonanciaMagneticaNuclearDeAltaRe 3433985
Resumen: Se realiza un recorrido histrico sobre los principales desarrollos de la espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear de alta
resolucin, a lo largo de sus ms de 60 aos de existencia, subrayndose sus aplicaciones en Qumica y Biologa, en sus aspectos estructurales
y dinmicos. Se presta especial atencin a los desarrollos ms recientes y a sus perspectivas futuras.
Palabras clave: Espectroscopa de RMN, hitos histricos, aplicaciones en Qumica, aplicaciones en Biologa Estructural.
Abstract: A historical survey on the main developments in NMR spectroscopy along its more than 60 years of existence is carried out, underli-
ning its structural and dynamic applications in Chemistry and Structural Biology. Especial attention is given to the most recent developments
and future perspectives.
Keywords: NMR spectroscopy, historical milestones, applications in Chemistry, applications in Structural Biology, recent developments.
Introduccin
Efectivamente, acababan de descubrirse los desplaza-
Es un hecho ya universalmente reconocido en el mundo mientos qumicos, y ah daban comienzo las aplicaciones
cientfico que la espectroscopa de Resonancia Magntica en Qumica de la espectroscopa de RMN.
Nuclear (RMN) de alta resolucin constituye una de las tc-
nicas de mayor utilidad de las empleadas en Qumica para
la determinacin de estructuras moleculares. Las primeras
Parmetros magnticos
observaciones de transiciones debidas a spines nucleares Desplazamientos qumicos
iban ms bien dirigidas al conocimiento del ncleo atmico Los desplazamientos qumicos son una medida de cmo
y, en concreto, a la determinacin de propiedades nuclea- la frecuencia de resonancia de los spines nucleares se ve
res, tales como la relacin giromagntica, una propiedad afectada por el campo magntico inducido en las posiciones
caracterstica de cada ncleo con spin distinto de cero, que nucleares por su entorno electrnico local. Segn la ecuacin
relaciona el momento angular con el momento magntico. de Larmor, la frecuencia de resonancia de un ncleo aislado,
Merece la pena recordar el comentario de Flix Bloch (uno por ejemplo el protn, depende de su relacin giromagntica
de los cientficos galardonados, junto con Edward Purcell, y del campo magntico externo:
con el Premio Nobel de Fsica de 1952 por la observacin
de resonancias nucleares) cuando al medir el momento mag- ~H=cH B0
ntico del 14N utilizando NO3NH4 para doblar la intensidad
de la seal observaron dos seales distintas y descartaron un Para un protn i en una posicin dada dentro de una mol-
posible origen nuclear del fenmeno:1 cula, la ecuacin que se aplica es:
...we are probably dealing with some nasty chemi-
cal effect. We shall have to correct for it and get down to ~Hi=cH B0i
real physics...
con B0i=B0 (1-vi), en donde vi se conoce como apantalla-
miento nuclear, distinto para cada entorno qumicamente
distinto. Los desplazamientos qumicos, una medida de los
apantallamientos, constituyen uno de los parmetros mag-
nticos fundamentales para la obtencin de informacin
estructural y dinmica de las molculas en estudio. Son muy
especficos del entorno nuclear y extremadamente sensibles a
pequeas interacciones.
M. Rico
Acoplamientos spin-spin
Instituto de Qumica Fsica, CSIC Los spines nucleares pueden interaccionar entre s de dos
Serrano 119, Madrid 28006 formas principalmente: a travs de los electrones de los enla-
C-e: mrico@iqfr.csic.es ces, o bien, directamente a travs del espacio. En el primer
caso, se trata de los acoplamientos escalares cuya medida son
Recibido: 13/10/2010. Aceptado: 20/12/2010. las constantes de acoplamiento, nJ, donde n es el nmero de
enlaces a travs de los que se transmite la interaccin. Es bien
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conocida la relacin de estas constantes con determinados manentes (60-100 MHz para la frecuencia de resonancia
rasgos estructurales, principalmente la muy utilizada relacin del 1H, ~H=c B0). A lo largo de la dcada de los 70, se
de Karplus2 que vincula la constante de acoplamiento vecinal introdujeron los primeros imanes superconductores, que
con el ngulo de torsin de enlace. Como veremos ms ade- permitan alcanzar campos magnticos ms y ms altos
lante, las constantes de acoplamiento juegan un papel esencial (220-400 MHz).
en la transferencia de polarizacin entre spines en experimen-
tos multidimensionales. Espectroscopa RMN con Transformada de Fourier
En el segundo caso, se trata de los acoplamientos dipolares, Sin embargo, conceptualmente, el desarrollo ms impor-
cuyo valor depende de la orientacin del vector que une a los tante fue la introduccin de la excitacin por pulsos de radio-
dos ncleos con respecto a la direccin del campo magntico frecuencia (rf).3 La magnetizacin global de un determinado
principal. En medios isotrpicos, los acoplamientos dipolares tipo de spines (la suma de los momentos magnticos indivi-
se promedian a cero, ya que las molculas en disolucin pueden duales), que, en equilibrio, est alineada en la direccin del
adoptar todas las orientaciones posibles debido a las continuas campo magntico (M0z), se vuelca al plano perpendicular al
colisiones originadas por el movimiento browniano. El hecho mismo mediante un pulso de rf tal que el producto cB1t1, en
de que los acoplamientos dipolares se promedien a cero en donde t1 es la duracin del pulso y B1 la intensidad del campo
disolucin no impide que jueguen un importante papel en el magntico de rf, sea igual a r/2. La magnetizacin se deja
proceso de relajacin nuclear. evolucionar libremente hasta que se restablece la situacin de
equilibrio (Mz=M0z y Mxy=0). En su evolucin en el plano, la
Tiempos de relajacin de spin nuclear magnetizacin describe una oscilacin, denominada fid (cada
La relajacin nuclear es el proceso inverso a la excitacin. libre de la magnetizacin inducida en el receptor) que decae
Los ncleos se relajan por transferencia al bao trmico de la con el tiempo y que se detecta convenientemente. La transfor-
energa adquirida en la excitacin, que se produce por un meca- mada de Fourier (FT) de la fid proporciona el espectro normal
nismo en el que intervienen principalmente los acoplamientos en el dominio de frecuencias. Con la utilizacin, prcticamen-
dipolares. Esta transferencia viene modulada por el movimiento te universal en esa dcada, de la espectroscopa RMN por FT
global de la molcula (su tiempo de correlacin o de difusin se poda incrementar la sensibilidad de la tcnica 10-15 veces
rotacional) o por movimientos de segmentos flexibles dentro
de la molcula, de ah su importancia en el estudio de procesos
dinmicos. A efectos operativos, se considera independiente-
mente la velocidad de relajacin de la componente longitudinal
de la magnetizacin (en la direccin del campo magntico, .
R1=1/T1, donde T1 es el tiempo de relajacin longitudinal)
y la de la componente transversal, en el plano perpendicular
al mismo (R2=1/T2, donde T2 es el tiempo de correlacin
sim.
transversal). El efecto Overhauser nuclear (NOE) mide la trans-
ferencia de magnetizacin entre spines nucleares cuando las
poblaciones de equilibrio de alguno de ellos son perturbadas. Al
producirse esta transferencia por mediacin de los acoplamien-
tos dipolares, su intensidad es una funcin de la distancia (con-
cretamente de rij6 donde rij es la distancia entre los dos spines).
obs.
La intensidad del efecto NOE ha constituido y constituye an la
base de la aplicacin de la espectroscopa de RMN a la determi- 4.7 4.5 4.3 4.1 ppm from TSP
nacin de estructuras tri-dimensionales de biomacromolculas.
Un poco de historia
10
13
La principal limitacin de la espectroscopa de RMN es su (+)
baja sensibilidad, lo que es debido a las pequeas diferencias 11 12
()
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para el 1H y hasta 40-60 veces para el 13C, para espectros en el perodo de evolucin. Una transformacin Fourier con
obtenidos en un mismo intervalo de tiempo. respecto a t1 define las frecuencias de modulacin y da como
En esa poca, el trabajo de asignacin de seales de reso- resultado el espectro 2D.
nancia a protones concretos de la molcula era un trabajo
Me
arduo y muy laborioso. Como una ilustracin, se presenta en la O HO
Figura1 (arriba) la asignacin de los protones Ha y Hb que apa- HO
O
O
O Me
O
O
recen en la zona comprendida entre d 3-5 ppm del fragmento Me OH
OH
Me O O
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En esa misma dcada, en nuestro laboratorio se asignaron cin de espectros de correlacin del 1H con algn hetero-
los protones de la enzima ribonuclesa (124 aa) a 360 MHz ncleo, por ejemplo 13C o 15N. El experimento ms corrien-
y se determin poco ms tarde su estructura con la ayuda de temente utilizado es el denominado HSQC (heteronuclear
espectros obtenidos a 600 MHz14,15 (Figura 4). single-quantum correlation),17 cuya secuencia de pulsos se
muestra en la Figura 5. Los perodos A y C son los denomi-
nados ecos de spin, en los que se aplican pulsos de 180
a ambos spines. Los desfases debidos a los desplazamientos
qumicos se re-enfocan al final del perodo, pero el acopla-
miento evoluciona durante el tiempo total, que se escoge
como 2D=1/(2JHX), siendo JHX la constante de acoplamiento
a travs del enlace que une al 1H con el heteroncleo. Con
ello, se crea la condicin necesaria (conversin de magne-
tizacin en-fase en anti-fase) para la transferencia de mag-
netizacin (ms correctamente transferencia de coherencia)
al ncleo X, lo que se lleva a cabo mediante pulsos de
90 simultneos a ambos spines. El conjunto de pulsos en
1H y X se conoce como experimento INEPT (Insensitive
105
D D D D
1H
115
120
180 90 90 180
125
t1
X
130
desacoplamiento
A B C
135
10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 ppm
Figura 5. Secuencia de pulsos para el experimento HSQC17 de corre-
lacin de 1H con un heteroncleo.
109
111
La utilizacin de la espectroscopa RMN-2D se universa- 113
liz, debido en gran parte a la explosin en el desarrollo de los 115
ordenadores, necesarios para el clculo de la transformacin
117
Fourier de la fid y obtener as el espectro convencional en el 15N
119
dominio de las frecuencias. (ppm)
En el aspecto terico, el modelo vectorial, muy ilustrativo 121
enorme utilidad en la explicacin de estos experimentos, a la Figura 6. Espectro HSQC 1H-15N de la protena Che Y (129 aa)19 eti-
vez que proporcionaba un marco terico para el desarrollo de quetada uniformemente con 15N. Arriba: la forma nativa. Abajo: la for-
un sinnmero de experimentos con aplicaciones especficas. ma desnaturalizada en 6M urea. Las escalas de los espectros, horizontal
Del mismo modo que se obtiene un espectro de correla- (1H), y vertical (15N) son aproximadamente equivalentes. Obsrvese
cin COSY-2D homonuclear, es posible plantear la obten- la gran diferencia en la dispersin de seales en ambas dimensiones.
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experimento (conversin de magnetizacin anti-fase en mtodos recombinantes en medios mnimos incluyendo sales
magnetizacin en-fase), que se detecta, mientras se des- de (15NH4)+ como nica fuente de nitrgeno. En la Figura 7 se
acopla el heteroncleo. Un ejemplo de espectro HSQC en ilustra un esquema de la secuencia de pulsos correspondiente
donde se correlacionan los desplazamientos qumicos de 1H al experimento 3D-15N-NOESY, que proporciona una serie de
y 15N se ilustra en laFigura 6. El espectro19 corresponde a la planos correspondientes a los efectos NOE 1H1H observados
forma nativa dela protena Che Y, un regulador de respuesta para los protones amdicos unidos a nitrgenos con un deter-
quimiotctica en bacterias. Nuestro inters estaba ms bien minado desplazamiento qumico.
centrado en su comportamiento respecto al plegamiento. En En la Figura 8, se ilustra la estructura de la ribonucleasa
la Figura 6 (abajo) se muestra el espectro correspondiente a-sarcina,22 determinada en nuestro laboratorio a partir del
a la forma desnaturalizada de la protena en 6M urea. Hay anlisis de los experimentos 2D convencionales, junto con
que hacer notar la gran diferencia en la dispersin de sea- experimentos 3D-15N-TOCSY y 3D-15N-NOESY, obtenidos
les entre los espectros de las formas nativa y desplegada. a partir de una muestra uniformemente etiquetada con 15N,
A pesar del gran solapamiento del espectro de sta ltima, obtenida en el Departamento de Bioqumica de la Universidad
fue posible la asignacin de cada seal a residuos concretos Complutense de Madrid. La a-sarcina es una ribonucleasa de
de la protena. Con ello pudo seguirse la evolucin de las 150 aa muy especfica que escinde un enlace bien determinado
seales NH individuales en funcin de la concentracin de del cido nucleico ribosmico, inactivando el ribosoma y con-
urea. Un anlisis termodinmico de esos datos proporcion duciendo a la muerte celular.
una descripcin detallada, a nivel de residuo, del proceso de El objetivo de extender la metodologa de RMN a la
plegamiento-desplegamiento, incluyendo la caracterizacin determinacin de la estructura y dinmica de protenas de
de un intermediario. mayor tamao se enfrentaba al grave problema del solapa-
El espectro HSQC es de esencial importancia en el pro- miento de seales, debido al gran aumento en el nmero de
ceso de diseo y descubrimiento de nuevos frmacos por la ellas a medida que crece el tamao de la biomacromolcula.
tcnica de RMN,20 debido fundamentalmente a la extrema A la solucin del problema contribuy la utilizacin de
sensibilidad de los desplazamientos qumicos respecto a muestras doblemente marcadas con 15N y 13C, cuya utiliza-
interacciones receptor-ligando, que pueden detectarse an en cin ya es rutinaria en todos los laboratorios, una vez que
el caso de que stas sean de muy pequea afinidad, lo que la los precios de la u-13C -glucosa empleada como nutriente, se
hace singularmente til con propsitos de detectarlas. han hecho accesibles. Con estas muestras es posible llevar a
cabo experimentos 3D que conducen la asignacin de sea-
Espectroscopa de RMN tri- y multi-dimensional les a ncleos concretos de la protena utilizando nicamente
En el anlisis estructural de protenas por RMN, pronto transferencias de coherencias escalares (a travs de enlaces).
se vio que, con slo experimentos homonucleares, no podra Dado el valor similar de la constante 1J15Ni13Cai (7-11 Hz) y
sobrepasarse un determinado tamao (120-140 aa), debido 2J
15Ni13C a(i1) (4-9 Hz) es posible transferir la magnetizacin
al gran solapamiento de seales que se produca, incluso en del 1H amdico al 15N y de ste, simultneamente, a los Ca
los experimentos RMN-2D. La extensin a espectroscopa de del propio residuo y del residuo precedente en la secuencia,
RMN tridimensional (3D)21 fue inmediata. Los experimentos con lo que se establece una conexin entre residuos esencial
ms usuales eran los correspondientes a un espectro homonu- para su asignacin. Este experimento 3D se conoce como
clear 2D (por ejemplo, NOESY-2D), al que se aade una ter- HNCA,23 siglas que incluyen a los tres ncleos (1H, 15N
cera dimensin, el desplazamiento qumico de un heteron- y 13C) implicados en la transferencia de coherencia. Del
cleo, normalmente 15N, lo que requiere el etiquetado uniforme mismo modo, es posible establecer otras relaciones entre
de la protena, que se lleva a cabo mediante la utilizacin de coherencias, tanto como para resolver ambigedades, caso
del HN(CO)CA, en el que se obtiene una correlacin del
1H y del 15N con slo el Ca del residuo anterior, como para
NOESY HSQC
asignar nuevos ncleos, como en el caso del HNCO, o los
90 90 90 180 90 180 180
HNCACB o similares.24 Con ello quedan asignados las
t1 xm D D D D t3 resonancias correspondientes a los ncleos del esqueleto de
la protena, incluyendo los de la posicin b.
1H
t2
15N
desacoplamiento
Gz
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Los ncleos de las cadenas laterales se asignan median- desfasan y, aparentemente, se pierden. Sin embargo, si se aplica
te los muy eficientes experimentos HCCH-TOCSY y . a continuacin un nuevo pulso de gradiente con la fase opuesta,
HCC-TOCSY.24 El anlisis de estos experimentos es suscepti- hace que las coherencias se re-enfoquen. Mediante una eleccin
ble de ser automatizado, con lo que puede llegarse a una asig- cuidadosa de los pulsos de gradiente, dentro de una secuencia
nacin de todas las resonancias implicadas, con una limitada multipulso, es posible asegurar que slo las coherencias deseadas
intervencin humana.25,26 Una vez concluida la asignacin, se re-enfoquen. Una vez superadas las dificultades tcnicas en su
resulta ya ms sencillo el anlisis y caracterizacin de los incorporacin a los espectrmetros comerciales, hoy se utilizan
espectros NOESY, de donde se derivan las restricciones de rutinariamente para la seleccin de coherencias (vase Figura 7).
distancia, en las que se apoya la determinacin de la estructura Una de sus obvias ventajas es su utilizacin en la eliminacin
3D de la protena. Conocida la asignacin de resonancias, la de la seal de H2O, disolvente empleado normalmente en las
asignacin de NOEs es tambin susceptible de ser automa- muestras de biomacromolculas.
tizada.27 Con protenas doblemente etiquetadas es posible la
determinacin de estructuras de protenas de hasta 30-40 kDa. Aplicaciones en Qumica Estructural
En la Figura 9 se ilustra la estructura de la protena estiocoli- En cuanto a lo que se refiere a la estructura de productos de
sina I (176 aa),28una toxina formadora de poros, producida por inters en Qumica, con carcter general, y ms en particular
una anmona de mar, determinada en nuestro laboratorio a par- en la qumica de productos naturales, con masas moleculares
tir de una muestra doblemente etiquetada con 15N y 13C, obteni- del orden de los 1000 Da o inferiores, poda ya pergear-
da en el Departamento de Bioqumica de la Universidad Com- se un protocolo para la determinacin de su estructura que
plutense de Madrid. El objetivo era determinar su interaccin . comprende las siguientes etapas: a) determinacin de la masa
con membranas y su papel en la formacin del poro. molecular por espectrometra de masas o cualquier otro medio;
b) espectros mono-dimensionales de 1H y 13C; c) espectro
COSY-2D para establecer conexiones 1H-1H geminales y
C
vecinales; d)espectro TOCSY-2D para determinar fragmentos
moleculares conteniendo protones acoplados entre s; e) espec-
tro de correlacin HSQC 1H-13C, en donde se correlaciona
cada carbono con los hidrgenos unidos a l; y f) espectro de
correlacin HMBC (heteronuclear multiple bond correlation)
N 1H-13C 30 para completar las conexiones estructurales. Las
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20
tos NOE) y de superar el mayor inconveniente de stos: su
corto alcance. As los RDCs son especialmente tiles, por
15
ejemplo, en la determinacin de la orientacin relativa de
4 dominios en protenas multidominio.
3
2
1
0
1H -10
Ca
-20
~1(15N)
15N
r
-30
Ancha Ancha Fina
0 20 40 60 80 100 120 140
Ancha
Ancha
+ C
secuencia
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Polarizacin Dinmica Nuclear (DNP) 1H-15N de 72 ng (0.7nm) de una pequea protena de 63 aa,
Un importante desarrollo es la denominada polarizacin utilizando una micro-criosonda conteniendo un tubo de1mm
dinmica nuclear (DNP), con la que es posible incrementar la de dimetro en 1,3 horas a 600 MHz.39
sensibilidad de la seal de RMN en slidos y lquidos. En un
experimento de DNP, la polarizacin de un electrn desapa- Muestreo parcial
reado, endgeno o exgeno, se transfiere al ncleo de intersI Tan importante como incrementar la sensibilidad es redu-
mediante irradiacin de la muestra con microondas. Con ello cir el tiempo de adquisicin de espectros, sobre todo en el
puede lograrse un gran incremento en la intensidad de la seal caso de los experimentos multidimensionales, necesarios en
del ncleo, cuyo mximo terico es el cociente de las relacio- la caracterizacin estructural y dinmica de bio-macromol-
nes giromagnticas del electrn y el ncleo ce/cI, que resulta ser culas. Si bien en una de las dimensiones, la evolucin de los
de 660 para el protn. spines nucleares se detecta mediante el procedimiento clsico
En uno de los instrumentos comerciales existentes,36 la de medir la corriente inducida en la bobina receptora, en las
muestra, situada en el polarizador, se disuelve en H2O-DMSO dems dimensiones es necesario el registro de un nmerode
junto con una sustancia con un radical libre, se lleva a una tem- espectros (que determina la resolucin deseada) con un incre-
peratura de 1,4 K y se irradia con microondas durante un tiempo mento dado en un tiempo de demora entre pulsos, que deter-
dado (15 minutos a 4 horas). Posteriormente, la muestra se mina la anchura de barrido. El tiempo experimental requerido
disuelve de nuevo en caliente, se transfiere de forma automtica para obtener un espectro nD se incrementa aproximadamente
al espectrmetro y se toma el espectro. Todo ello ha de hacerse en dos rdenes de magnitud por dimensin,40 con lo que un
rpidamente para evitar que la polarizacin transferida al ncleo espectro 4D puede llevar varios das, lo que resulta imprac-
se pierda por relajacin. La tcnica se aplica principalmente a ticable. La solucin al problema est en tratar de reducir el
ncleos de una pequea relacin giromagntica como el 13C o el muestreo de espectros en las dimensiones indirectas, sin pr-
15N, para los que los mximos tericos de incremento de sensi- dida de sensibilidad y sin prdida de informacin.
bilidad son mayores. El grupo de Griffing37 ha propuesto recien- El procedimiento ms aplicado con carcter general es
temente un dispositivo instrumental, conocido como TJ-DNP de evitar el muestreo total de n1 x n2, eligiendo incrementos
(salto de temperatura-DNP) que permite la acumulacin de conjuntos de los tiempos de evolucin en las dimensiones
espectros (vase Figura 12), en el que sucesivamentela muestra indirectas (t1 y t2), lo que se conoce como muestreo radial: en
se enfra (90 K), se polariza, se funde mediante la accin de el primer caso, tendramos un rectngulo lleno de puntos filas
un lser de IR para obtener finalmente el espectro. La tcnica y columnas, mientras que en el segundo, tendramos rectas de
de DNP es de indudable utilidad para reducir cantidades de distinta pendiente, partiendo del origen (t1=t2=0).
sustancia, tiempos de adquisicin de espectros, lo que la hace Los espectros resultantes de un muestreo radial son equi-
especialmente til para ser aplicada en Cintica Qumica. valentes a proyecciones 2D, a partir de los cuales es posible
reconstruir el espectro 3D. Existen distintos procedimientos
140 GHz
(c) Glucose para la reconstruccin de la informacin total del espectro
e-
@
f + 120 ! 10
3D.41,42,43 Con estas tcnicas de reduccin de la dimensiona-
Desacoplamiento
lidad es posible ahorrar una enorme cantidad de tiempo expe-
c
1H CP
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Pulsado rpido sin horizontal (13C) que en el HSQC 1H-15N, donde dicha
En todos los experimentos de RMN, incluidos los mono- dimensin corresponde al 1H, lo que resulta ser muy convenien-
dimensionales, es preciso esperar un cierto tiempo antes de reci- te en el anlisis de estructuras residuales en protenas intrnseca-
clar, para permitir que los spines nucleares se relajen y vuelvan mente desplegadas. Donde la deteccin directa de 13C resulta ser
al estado de equilibrio. Estos tiempos suelen ser de varios cen- de especial utilidad es en el caso de protenas con centros para-
tenares de milisegundos o de segundos. Otra forma de acortar magnticos. De hecho, fue el grupo de Bertini en Florencia,49
el tiempo de experimento es la de intentar reducir ese tiempo de que trabaja con esos sistemas, quien se mostr muy activo en
espera. Eso es lo que se consigue con el mtodo desarrollado por promover su desarrollo. La interaccin dipolar electrn-ncleo
Pervushin,45 que consiste en incrementar la relajacin longitudi- es un mecanismo adicional de relajacin en esos casos, y el
nal (LRE, longitudinal relaxation enhancement). ms importante. La velocidad de relajacin depende de la dis-
tancia del ncleo al centro paramagntico y del cuadrado de la
relacin giromagntica del ncleo observado, por lo que el 13C
172
T66
se ver mucho menos afectado que el 1H. En consecuencia, las
L15 resonancias protnicas ms prximas al centro paramagntico
174
N60
(ppm)
E16
T14
se ensanchan y desaparecen, mientras que las seales de 13C en
D52
esas zonas pueden seguir detectndose.
176
13C
L56
T7
Desplazamientos qumicos y estructura molecular
178
E34
V26
En aos recientes se han hecho grandes progresos en la
utilizacin de los desplazamientos qumicos como fuente de
127 122 117 112 127 122 117 112
informacin estructural. Es bien conocido que, en el proceso
15N (ppm) 15N (ppm)
deasignacin, se obtienen como datos los desplazamientos qu-
Figura 13. Planos correspondientes a dos valores de d del protn H-N, micos de todos los tomos que dan lugar a resonancias observa-
de un espectro 3D-HNCO de ubiquitina 1,9 mM, obtenido a 600 MHz bles, una riqusima informacin realmente infrautilizada. En la
mediante la combinacin de la tcnica BEST con la de la reconstruc- determinacin de estructuras de protenas, esta informacin se
cin de 6 proyecciones, en un tiempo total de tan slo 2 minutos.46 El utiliza de forma parcial, como, por ejemplo, para localizar seg-
tiempo de reciclado fue de 50 ms. mentos de estructura secundaria, o para imponer restricciones
sobre los ngulos del esqueleto z y W, mediante el frecuente-
La idea es que los spines nucleares relajan ms rpido si los mente utilizado programa TALOS.50 Ms recientemente, los
spines nucleares que los rodean (otros ncleos de la molcula o desplazamientos qumicos se han utilizado para refinar estruc-
los del disolvente) no estn excitados. Por ello, se excitan slo turas calculadas en base a NOEs e, incluso, para proponer de
un tipo de ncleos de la molcula, por ejemplo, los protones novo una estructura 3D para una protena a partir de la secuen-
de los enlaces amdicos de una protena. El resultado es que cia y de slo los desplazamientos qumicos.51 Muchos de los
los tiempos de reciclado se reducen significativamente y, con procedimientos utilizados en este sentido (CS-ROSETTA,52
ello, el tiempo de experimento total. Paralelamente se obtiene CHESIRE,53 y CS23D54) se fundamentan en la siempre cre-
un incremento de la sensibilidad. Existen varios programas que ciente base de datos de desplazamientos qumicos elaborada
incorporan esta idea, tambin conocida como la de pulsado con datos de protenas ya analizadas. Lo que se ha denominado
rpido, de los cuales el ms general es el denominado BEST el Santo Grial,51 el clculo de estructuras de protenas, con
(Band Selective Excitation Short Transients).46 En la Figura 14, base exclusivamente en los desplazamientos qumicos, parece
se muestra una aplicacin de combinada del programa BEST estar cercano mediante procedimientos heursticos.
con la tcnica de reconstruccin de proyecciones.
Clculos mecano-cunticos
Deteccin directa de seales de heteroncleos El verdadero Santo Grial consistira en determinar la
Otro de los desarrollos recientes, ligado a un especfico estructura a partir de primeros principios, es decir, median-
diseo de sondas ad hoc es la de la deteccin directa de hete- te clculos de Mecnica Cuntica, lo que involucrara dos
roncleos, fundamentalmente 13C. Es precisamente ese diseo pasos: uno, poder calcular con exactitud los desplazamientos
especial el que logra compensar en parte la menor sensibilidad qumicos a partir de una estructura y dos, realizar el proceso
del 13C, debida a su menor relacin giromagntica. Este hecho, inverso, es decir, determinar la estructura a partir de los des-
sin embargo, puede constituir una cierta ventaja, pues sus inte- plazamientos qumicos.
racciones dipolares sern tambin menores, lo mismo que sus En el clculo de desplazamientos qumicos por mtodos
velocidades de relajacin, con el resultado de que la anchura de de mecnica cuntica se estn consiguiendo importantes
sus seales ser menor. Al igual que para los experimentos 3D progresos. El mtodo ms utilizado es el denominado GIAO
que involucran al 1H, existe un conjunto de experimentos en los (gauge-including atomic orbitals).55 En los clculos de apan-
que las coherencias se transfieren y se detectan exclusivamente tallamientos, los resultados dependen de la eleccin del origen
a travs de heteroncleos47 y que se utilizan en protenas, de la o gauge del potencial vector que describe el campo magn-
misma manera que en el caso del 1H, con propsitos de identi- tico total en la posicin de cada electrn. En el mtodo GIAO
ficacin de residuos y de asignacin especfica de secuencia. La se introduce una base de orbitales atmicos dependientes del
deteccin en 13C presenta indudables ventajas en ciertos casos. gauge, con la que se obvia esa dificultad. El mtodo GIAO
El espectro 2D-HSQC 15N-13C(O),48 por ejemplo, incluye a las es rpido, preciso y relativamente insensible a la eleccin del
prolinas y presenta una dispersin mucho mayor en la dimen- conjunto de orbitales base y puede incluir los efectos de la
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Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear de alta resolucin: una herramienta fundamental en Qumica y Biologa Estructural 55
Dispersin de la relajacin
Hay que destacar, dentro de este campo, el experimento
propuesto por el grupo de Kay,62 denominado dispersin de
la relajacin. El experimento CPMG (Carr-Purcel-Meiboom-
Gil) es conocido desde los primeros tiempos de la tcnica y
se utiliza fundamentalmente para la medida de la velocidad
de relajacin transversal (R2=1/T2). Consiste en un tren de
pulsos de spin-eco con una frecuencia dada (vase Figura15).
La curva de dispersin de la relajacin (a la derecha de la
Figura) corresponde a un sistema en intercambio rpido.
Cuando existe intercambio entre dos posiciones con despla-
1 2
zamientos qumicos distintos (XA y XB), en el caso de que la
La Clair Rychnovsky/Porco
frecuencia 2n sea pequea (n=2 en la Figura), las fases en el
250 10 plano xy ({A=XAx y zB=XBx) se intercambian, con el resul-
8
tado de que, el re-enfoque no es tan efectivo y se produce una
d(13C) calc /ppm
200
J(1H,1H) calc /Hz
6
150
4 J45
T R2,eff (1/s)
100 2
0 90 y 180 x 40 n=2
50
-2
0 x x 30
-4
0 50 100 150 200 -2 0 2 4 6 8 10
d(13C) expt /ppm J(1H,1H) expt /Hz 20 n=10
n=20
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56 Manuel Rico
disminucin de la amplitud de la seal, lo que corresponde a 14. M. Rico, M. Bruix, J. Santoro, C. Gonzlez, J. L. Neira, J.L.Nieto,
una contribucin adicional a la relajacin. A medida que se J. Herranz, Eur. J. Biochem. 1989, 183, 62338.
incrementa la velocidad de repeticin, disminuye la probabi- 15. J. Santoro, C. Gonzlez, M. Bruix, J. L. Neira, J. L. Nieto
lidad de que se produzcan intercambios en el tiempo x, con J.Herranz, M. Rico, J. Mol. Biol. 1993, 229, 72234.
lo que la velocidad de relajacin eficiente disminuye, hasta 16. R. R. Ernst, G. Bodenhausen, A. Wokaum, Principles of nuclear
que, cuando la frecuencia es muy grande (n=20), R2,eff es la magnetic resonance in one and two dimensions, Clarendon
misma que si no existiera intercambio. Lo importante es que, Press, Oxford, 1987.
a partir del anlisis de las curvas de dispersin de la relaja- 17. G. Bodenhausen, D. J. Ruben, Chem. Pys. Lett. 1980, 69, 185189.
cin, es posible obtener informacin cintica (la velocidad 18. G. A. Morris, R. Freeman, J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 760762.
de intercambio), termodinmica (la poblacin relativa de los 19. P. Garcia, L. Serrano, M. Rico, M. Bruix, Structure 2002, 10, 11731185.
sitios que se intercambian) y estructural (la diferencia entre 20. M. Pellecchia, I. Bertini, D. Cowburn, C. Dalvit, E.Giralt,
los desplazamientos qumicos de los mismos). El experimen- W.Jahnke, T. L. James, S. W. Homans, H. Kessler, C. Luchinat,
to resulta de gran utilidad en la deteccin y caracterizacin B. Meyer, H. Oschkinat, J. Peng, H. Schwalbe, G. Siegal.,
de estados excitados o intermediarios en el proceso de ple- Nat.Rev. Drug. Discov. 2008, 9, 738745.
gamiento con una poblacin de tan slo 0.5% en relacin a 21. D. Marion, L. E. Kay, S. W. Sparks, D. A. Torchia, A. Bax,
la especie mayoritaria. Es aplicable a procesos dinmicos de J.Am. Chem. Soc. 1989, 111, 15151517.
intercambio con escalas de tiempos caractersticos de 100 s1 22. J. M. Prez-Caadillas, R. Campos-Olivas, J. Lacadena,
a 2000 s1 entre los que se encuentran muchos procesos de A. Martnez del Pozo, J. G. Gavilanes, J. Santoro, M. Rico,
inters qumico y bioqumico. M.Bruix, Biochemistry 1998, 37, 1586515876.
Junto a la espectroscopa de RMN de alta resolucin, se 23. L. E. Kay, M. Ikura, R. Tschudin, A. Bax, J. Magn. Reson. 1990,
han hecho grandes progresos en espectroscopa de RMN de 89, 496514.
alta resolucin en estado slido, cuyos resultados prometen 24. J. Cavanagh, W. J. Fairbrother, A. G. Palmer III, M. Rance,
ser de gran utilidad, por ejemplo, en la determinacin de N. Skelton, Protein NMR Spectroscopy. Principles and
Practice, Academic Press, 2007.
estructuras de protenas de membrana. Su descripcin mere-
cera la atencin y el espacio dedicado al presente trabajo. 25. M. C. Baran, Y. J. Huang, H. N. Moseley, G. T. Montelione,
Chem. Rev. 2004, 104, 34513456.
26. D. Malmodin, C. H. Papavoin, M. Billeter, J. Biomol. NMR
Agradecimientos 2003, 27, 6979.
Quiero agradecer vivamente a todos mis colaboradores 27. P. Gntert, Eur. Biophys. J., 2009, 38, 129143.
del pasado y del presente, por su excelente trabajo, el cual 28. I. Castrillo, N.A. Araujo, J. Alegre-Cebollada, J. G. Gavilanes,
ha contribuido a mantener, durante ms de 40 aos, a pesar A. Martnez del Pozo, M. Bruix, Proteins 2010, 78, 19591970.
de carencias y dificultades, un nivel ms que digno de la 29. R. E. Hurd, J. Magn. Reson. 1990, 87, 422428.
Espectroscopa de RMN en nuestro pas. 30. A. Bax, M. Summers, J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 20932094.
31. A. A. Bothner-by, R. L. Stephens, J. Am. Chem. Soc. 1984, 106,
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