MEDIOS DE CULTIVO (http://natalymosquera.blogspot.

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Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo in
vitro de clulas, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de
embriones, embrioides, la organognesis, la micropropagacin, etc. Los medios de
cultivo tienen una serie de componentes generales y especficos cuya presencia y
concentracin estar en dependencia del objetivo que se persiga en su utilizacin.
As, los medios de cultivo pueden ser lquidos o tener un soporte slido, tienen
sustancias minerales, vitaminas, aminocidos, azcares, fitohormonas, etc.
Tambin pueden contener por ejemplo extractos naturales, segn su finalidad y
debe quedar claro que no todos llevan un complemento completo de todos los
factores.
(http://fbio.uh.cu/webfv/docencia/tema%205.doc)
En el cultivo in vitro de tejidos vegetales, se denomina solucin madre o stock a
cualquier solucin de composicin elevada y concentracin definida, en la que el
soluto puede ser uno o ms compuestos qumicos de los que conforman un
determinado medio de cultivo y que mediante un proceso de dilucin permita la
preparacin de 1 litro de medio de cultivo. (Pierik, 1990)
Desde el punto de vista prctico la preparacin de soluciones madres o stock tiene
como finalidad evitar:
Pesar cada uno de los compuestos qumicos que constituyen un medio de cultivo,
cada vez que se requiera elaborar, lo que implicara evitar demasiado tiempo en su
preparacin.
Inexactitud al pesar cantidades muy pequeas de ciertos compuestos qumicos.
Otro aspecto importante que se debe considerar es la cantidad de agua que se
utilice para disolver las sales inorgnicas que constituyen las soluciones stock y en
general el medio de cultivo.
El agua debe ser destilada o bidestilada y necesariamente des ionizada. (Kyte &
Kleyn, 1996)
Se han creados numeroso medios de cultivos (medio basal), cuyas diferencias
estriban en las cantidades y tipos de sales empleadas.Entre los medios de cultivo
ms conocidos se encuentran:
Murashige y Skoog (MS) (1962),
Linsmaier y Skoog (LS) (1965),
Borgin y Nitsch (BN) (1967),
Gamborg (B5) (1970),
Sachs (1860), Knop (1865),
Arnon y hoglan (1940),
Gautheret (1942), Riquer y Duggar (1946),
Heller (1953-58)
Nitsch y Nitsch (1956),
Torrey y Shigemura (1957-64),
White (1963),
Blaydes (1966),
Miller y Oyima (1968).
SALES INORGANICAS
MACRONUTRIENTES
Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.
Nitrgeno (N): forma parte de aminocidos, vitaminas, protenas y cidos
nucleco.
Magnesio (Mg): es parte de la molcula de clorofila y de los ribosomas
.Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de
crecimiento,
Fosforo (P): Forma parte de las molculas que almacenan y transfieren la
energa qumica de los cidos nucleicos, de este depende la energa celular.
Potasio (K): Desempea un papel importante en la regulacin osmtica y en la
actividad enzimtica.
Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminocidos
Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halfilas y en plantas cuyos
productos fotosintticos son C4 y plantas con metabolismo acido. (Garca, 2000)
Micronutrientes
Estos micronutrientes son importantes en las clulas vegetales, ya que al
adicionarles ciertas cantidades excesivamente pequeas permite que las sales
madres sean mas eficaz para el medio de cultivo.
Hierro (Fe): forma el ncleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.
Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa
Manganeso (Mn): induce a la sntesis de clorofila, se requiere para la formacin
del O2 en la fotosntesis.
Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica,
involucrado en la sntesis de bases nitrogenadas como el uracilo.
Cobre (Cu): permite la oxidacin respiratoria final, esta ligado al proceso de
lignificacin.
Zinc (Zn): requerido para la oxidacin e hidroxilacin de compuestos fenolicos.
Cobalto (Co): componente de la vitamina B12
Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolucin del O2 en la
fotosntesis. (Garca, 2000)
REGULADORES DE CRECIMIENTO
Adicionalmente a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o ms
sustancias reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces
tambin Giberelinas o cido ascrbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro
de tejidos y rganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varan
considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endgenos de estos
reguladores, as como con la finalidad del cultivo in vitro.
El uso de fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto
Se ha demostrado que la clase y concentracin de dichas sustancias interactan
con el genoma de la planta. (Montoya, 1991)
Auxinas
Son utilizadas principalmente para la diferenciacin de races y la induccin de
callo. Las ms utilizadas son:
IBA: (cido indol-3-butrico) = diferenciacin de races
ANA: (cido naftalenactico) = diferenciacin de races
IAA: (cido indolactico) = Prolongacin de explantes
2,4-D: (cido diclorofenoxiactico) = induccin de callos.
(Las Auxinas se disuelven usualmente en etanol diluido o en una solucin de
hidrxido de sodio).
Citoquininas
Promueve la divisin celular y la induccin de yemas adventicias en callos y
rganos. Brotacin.
Las Citoquininas ms usadas son:
BAP: (bencilamino purina)
Kinetina
2-ip (isopentenil-adenina).
(Generalmente son diluidas con cido clorhdrico o hidrxido de sodio).
Giberelinas
Su funcin principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina
con mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al
calor (pierde el 90% de su actividad despus del autoclavado)
Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La
mayora de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de
hormonas.
Acido abscsico
El cido abscsico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo
en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduracin de
embriones, y en cultivos de clulas en suspensin facilita la sincronizacin de la
divisin celular.
Etileno
Interviene en procesos como: liberacin de la dormancia, crecimiento y
diferenciacin de brotes y races, formacin de races adventicias, abscisin de
hojas, flores y frutos, induccin de floracin en algunas plantas, senescencia de
hojas, flores y maduracin de frutos.
Vitaminas
La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero
aparentemente lo hacen en cantidades infraptimas. Para lograr un buen
crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o ms vitaminas.
La tiamina (B1) es la que ms se utiliza y se la considera un ingrediente esencial.
Otras vitaminas tambin han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento
in vitro, como son: pidiroxina (B6), cido nicotnico (B3), pantotenato clcico (B5).
Fuentes de carbono
Normalmente para el cultivo in vitro de clulas, tejidos u rganos es necesario
adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro
tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosntesis o incluso en
oscuridad.
La sacarosa es la ms utilizada para propsitos de Micro propagacin.
Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aqu es
convertida rpidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se
utiliza seguida de la fructosa.
El azcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar
adecuado para la Micropropagacin en muchos casos.
Azucares
Los azucares en el medio cumplen dos funciones esenciales:
Son fuentes de energa.
Mantienen en el medio un potencial osmtico determinado.
AGENTES GELIFICANTES
Agar: Es una mezcla de polisacridos extrados de un alga marina. Tiene una
elevada masa molecular, como tambin la capacidad de hidratarse y formar una
red. La planta no puede digerirlo ni absorberlo, adems no interacta con los
componentes nutritivos del medio. El Agar se funde a altas temperaturas (1000C),
solidifica alrededor de los 400C y no se degrada con la luz. Generalmente se utiliza
a una concentracin de 0,6 - 1%. El principal problema con este gelificante es su
elevado costo.
Gelrita: Es un heteropolisacrido aninico natural producido por una bacteria, que
forma geles semejantes al Agar. Se puede usar a una concentracin de 0,15-
0,30%. Los geles de gelrita son notablemente ms claros que los de Agar, y
tambin cuajan ms rpidamente. (Garca, 2000)
PROTOCOLO DE DESINFECCIN
Protocolo de desinfeccin para yemas de mora de castilla
1.0.-Introducir hipoclorito al 1%
Detergente.
BAP 2mg.
Tween 20%
Yodo 5ml.
cido ascrbico 2mg/l durante 15 minutos.
Enjuagar con agua destilada.
Pasar a cmara.
Sumergir en alcohol al 70% por 2 minutos.
Enjuagar.
Hipoclorito al 3% por 5 minutos.
Enjuagar.
Sembrar.
2. Hipoclorito al 5% por 20 minutos.
Enjuagar.
Alcohol al 70% por 5 minutos.
Enjuagar.
Hipoclorito al 5%
acido ascrbico 2mg/l durante 5 minutos.
Enjuagar.
Tween 20 por 5 minutos.
Enjuagar y sembrar.
Desinfeccin del explante: brotes de tubrculos, aproximadamente de 2-3 cm de
longitud y de 4-5 nudos/brote.
Lavar los brotes bajo agua corriente.
Sumergirlos en una solucin de agua lavandina comercial (55 g Cl/l) al 20%
ms una o dos gotitas de Tween 20, durante 15 minutos agitando suavemente.
En cmara de flujo, extraer los brotes y enjuagarlos con agua estril durante 15
minutos divididos en enjuagues sucesivos de 5 c/u.
Colocar los brotes sobre papel de filtro estril hasta la siembra.
Meristemas de pltano y banano
Alcohol al 70% 5minutos.
Hipoclorito 3% por 10 minutos
Enjuagar en cmara de siembra.
Hipoclorito 1% por 5 minutos en cmara, enjuagar.
Sembrar.
Cpsula de orqudeas
Lavar cpsula con jabn
Enjuagar.
Sumergir cpsula en hipoclorito 1% con una gota de detergente por 10
minutos.
Transferir la cpsula a la cmara de siembra.
Sumergir en alcohol al 100% por tres minutos.
Enjuagar y sembrar.

Bromelias (pia)

1ml de fungicida (Benomil) por 15 minutos.

Alcohol al 25% ms cido ascrbico (2mg/l) por 2 minutos.
 Purseu 25% mas cido ascrbico (2mg/l) por 2 minutos.
Alcohol al 25% por 5 minutos.
Enjuagar y sembrar
Anturio
Alcohol al 70% por 10 minutos
Hipoclorito 5% por 20 minutos.
Enjuagar en cmara (agua estril).
Hipoclorito 3 % por 2 minutos enjuagar y sembrar.

Rosa y clavel

Alcohol 70% por 5 minutos.

Hipoclorito 3% por 10 minutos.
Hipoclorito 5% por 10 minutos.
Enjuagar en cmara (agua estril).
Hipoclorito 1% por 3 minutos.
Enjuagar y sembrar.

Estacas de olivo

Sumergir las estacas en etanol al 80% a 96C por 2-3 segundos.

Hipoclorito de sodio por 20 minutos. Llvelo al agitador magntico a 37 (1C).
Enjuagar 3 veces con agua destilada estril.
Deje secar y siembre.

Desinfeccin de cpsulas de orqudeas

Etanol 70 (5 minutos),
Solucin de NaOCl al 3,3% ms el agregado de dos gotas de Tritn
100, durante 30 minutos en agitacin.
Finalmente, las cpsulas fueron sumergidas en etanol y flameadas.
Desinfeccin de cpsulas de orqudeas
Detergente al 1% y sumergidas 5 minutos en solucin de hipoclorito de sodio
(NaOCl) al 1 % de cloro activo al que se le aaden dos gotas de Tween 20.
Lavar con agua destilada estril.
En la cabina de flujo laminarse sumergir las cpsulas en solucin de sulfato de
cobre al 2% durante cinco minutos
Hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1 %, y finalmente se enjuagaron con suficiente
agua destilada estril.
Antes de ser seccionadas, las cpsulas fueron pasadas por alcohol al 70% y
flameadas.

Explante de cerezo (Prunus avinum) Miller 1982

Remojar los explantes en una solucin de hipoclorito de sodio al 5% con 0.1%

de tween 20 por 10 minutos.
Dos enjuagues de 5 minutos cada uno con agua destilada, desionizada o
estril.
Remoje los explantes en etanol al 70% por 5 minutos
Enjuague dos veces, cada enjuague por 5 minutos con agua destilada,
desionizada o estril.
 Kewia (Polyepis besseri Hieron)
Hipoclorito de sodio al 2.5%. segn el protocolote desinfeccin desarrollado
por plantas leosas.
Testando diferentes tiempos (15, 20 y 25 minutos).
Formol al 37% durante (15, 20 y 25 minutos).
Especies Proteceas
Explantes de 10-15 cms aproximadamente se pusieron en solucin de 3 g/L
de:
captan por 45 minutos.
Se sumergen 5 segundos en etanol 70%.
Dos enjuagues en agua destilada esterilizada.
Se traspasan a hipoclorito de sodio al 1% por 15 minutos la mitad de los
explante y la otra mitad se traspasa a una solucin de hipoclorito de sodio al
0,75% por 15 minutos, ambas en constante agitacin.
Enjuague en agua destilada esterilizada.
Se cortan los explantes de 2-3 nudos cada uno, bajo condiciones aspticas.
Nothofagus procera (embriones aislados)

Etanol al 70% v/v durante 3 minutos,

Tres enjuagues de 2 minutos cada uno, con agua destilada estril.
Luego las semillas fueron inmersas en una solucin de hipoclorito de sodio,
con un 2% de cloro activo durante 20 minutos, para luego realizar tres
enjuagues con agua destilada estril durante 2 minutos cada uno, todo lo
anterior bajo agitacin constante.
Componentes (mg/L)
Medio Base
Gamborg Murashige and
Skoog (MS)
White
Aluminum chloride 6H2O
Ammonium nitrate 1650
Ammonium phosphate
monobasic
Ammonium sulfate 134
Boric acid 3 6.2 1.5
Calcium chloride anhydrous 113.24 332.2
Calcium nitrate 200
Calcium phosphate tribasic
Cobalt chloride 6H2O 0.025 0.025
Cupric sulfate 5H2O 0.025 0.025
Na2-EDTA 37.3 37.26
ZnNa2-EDTA
Ferric chloride 6H2O
Ferric citrate
Ferric sulfate 2.5
Ferric tartrate 2H2O
Ferrous sulfate 7H2O 27.8 27.8
Magnesium sulfate 122.09 180.7 360
Manganese chloride 4H2O
Manganese sulfate H2O 10 16.9 5.04
Molybdenum trioxide
Molybdic acid (sodium salt)
2H2O
0.25 0.25
Nickel chloride 6H2O
Nickel sulfate 6H2O
Potassium chloride 65
Potassium iodide 0.75 0.83 0.75
Potassium nitrate 2500 1900 80
Potassium phosphate
monobasic
170
Potassium sulfate
Sodium nitrate
Sodium phosphate
monobasic
130.5 16.5
Sodium sulfate 200
Zinc nitrate 6H2O
Zinc sulfate 7H2O 2 8.6 2.67
Preparacin de Soluciones Stock del Medio Base Murashige & Skoog, 1962
Stock A (100X) pesar
KNO3 Nitrato de Potasio 19 g/L
CaCl2.2H2O Cloruro de calcio dihidrato 4.4 g/L
KH2PO4 Fosfato de Potasio monobsico 1.7g/L
NH4NO3 Nitrato de amonio 16.5g/L
Stock A2 10 ml
Stock A3 0.2 ml
Completar a 1000 ml
Stock A2 Pesar
KI Ioduro de Potasio 0.083g
H3BO3 cido brico 0.62g
MnSO4.4H2O Sulfato de Manganeso 4 aguas 1.68g
ZnSO4.7H2O Sulfato de Zinc heptahidrato 0.86g
Na2MoO4.2H2O Molibdato de Sodio. 2 aguas 0.025g
Completar a 100 ml con agua destilada
Stock A3
Pesar y usar Stocks
CuSO4.5H2O Sulfato de cobre 5 aguas
1.5 g
CoCl2.6H2O Cloruro de Cobalto hexahidrato
1.5g
Completar a 1000 ml con agua destilada
STOCK B Pesar
MgSO4.7H2O
Sulfato de Magnesio
heptahidrato 3.7g
Completar a 100 ml con agua destilada
STOCK C Pesar
FeSO4.7H2O
Sulfato de Hierro
heptahidrato 0.55g
*disolver separado en 20
ml
Na2EDTA.2H2O
Sodium Edta.
Dihidrato 0.75g
*disolver separado en
caliente(20ml)
Llevar a 100 ml
Preparacin de 1 lt de Medio de cultivo
En 500 ml de Agua destilada agregar:
Stock A 100 ml
Stock B 10 ml
Stock C 5 ml
Azcar 25g
Adicionar Vitaminas, y Hormonas de acuerdo a formula.
Completar a 1 Litro con agua destilada
Medir el pH segn los valores indicados en la formula. (5.5 hasta 5.9)
(Elevar el pHcon 1N KOH, bajar con 1N HCl)
Agregar el Agar en concentraciones adecuadas de acuerdo al tipo de agar.
Calentar la solucin, hasta que se disuelva el agar, Dispensar en los frascos y esterilizar en la
autoclave 121C y 15 libras de presin, por 15 a 20 minutos.
Dejar enfriar los medios, dejar al menos un da antes de utilizarlos.
PRCTICAS DE BIOTECNOLOGA VEGETAL
PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRE PARA LOS MEDIOS DE CULTIVO
1. INTRODUCCIN
Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro":
- Sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como
macronutrientes
- Vitaminas tales como Riboflavina, tiamina, piridoxina, cido nicotnico, cido pantotnico,
biotina, y cido flico.
- Aminocidos tales como L-glutamina, asparragina y cistena
- Hexitoles como mio-inositol
- Hormonas y reguladores del crecimiento
- Fuente de carbono
- Agente gelificante
- ...
Un mtodo de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como
"soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentracin que
suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentracin final del medio. Su ventaja no
estriba slo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino
tambin la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos estn tan diluidos en la solucin final,
que la pesada que habra que hacer estara por debajo de los lmites de exactitud de las balanzas de
precisin.
Las soluciones madre se conservan en frigorfico y en bote topacio durante algunos meses,
desechndose ante cualquier seal de precipitacin.
Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminocidos, hormonas, vitaminas y
hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se
necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bin en solucin.
En el caso de las hormonas es mejor preparar una solucin madre de cada una de ellas y medir
volmenes determinados y congelarlos en un frigorfico de 4 estrellas.
2. OBJETIVO.
Preparar soluciones madre necesarias para la composicin de los medios de cultivo que se emplearn
en el conjunto de las prcticas de la asignatura.
3. MATERIAL
Botes de cristal o de plstico (preferiblemente de los primeros por su transparencia), que en
algunos casos habrn de ser de color topacio para proteger de la luz determinados compuestos
que son fotosensibles
Granatario
Balanza de precisin
Esptulas de distinto tamao para pesar
Embudos de pesar
Agitador magntico
Imanes
Vasos de precipitados
Probetas
Matraces aforados
Eppendorf
Compuestos qumicos
Agua destilada
4. METODOLOGA
Se prepararn soluciones madre de las sales minerales, vitaminas, aminocidos y hormonas necesarias
para los medios DKW y MS. Veamos la composicin de cada uno de ellos:
Sales mineralesMS (Murashige and Skoog, 1962) (gL-1)
(NH4 )NO3 1.650
KNO3 1.900
CaCl2.2H2O 0.440
MgSO4.7H2O 0.370
KH2PO4 0.170
FeSO4.7H2O 0.0278
Na2EDTA. 2H2O 0.0372
MnSO4.H2O 0.0169
ZnSO4.7H2O 0.0086
H3BO3 0.0062
KI 0.00083
Na2MoO4.2H2O 0.00025
CuSO4.5H2O 0.000025
CoCl2.6H2O 0.000025
Mioinositol 0.100
Tiamina HCl 0.0001
Acido nicotnico 0.0005
Piridoxina HCl 0.0005
Glicina 0.002
Sales minerales DKW modificado (g/L-1)
(NH4)NO3 1.416
Ca (NO3)2 3H2O 1.811 (1.960 si es 4 H2O)
CaCl2 2H2O 0.147
MgSO4 7H2O 0.74
KH2PO4 0.258
FeSO4 7H2O 0.00676
Na2 EDTA 2H2O 0.0908
K2SO4 1.56
Mn SO4 H2O 0.0338
Zn SO4 7H2O 0.0212
BO3H3 0.0124
KI 0.00166
Na2MoO4 2H2O 0.0005
Cu SO4 5H2O 0.00005
Co Cl2 6H2O 0.00005
Mioinositol 0.1
Tiamina H Cl 0.001
c. nicotnico 0.001
Piridoxina. HCl 0.001
Biotina D(+) 0.00001
Glutamina (base libre ) 0.001
L-Cystena H Cl 0.001
Pantotenato de Ca 0.1
Lo ms normal es preparar soluciones que contengan varios componentes, de modo que la
preparacin de la solucin final sea ms rpida y tenga menos margen de error.
Veamos la composicin de cada una de las soluciones madre de ambos medios
SOLUCIONES MADRE DEL MEDIO MS (gL-1)
MACRONUTRIENTES (10 X)
NH4NO3 16.5
KNO3 19
MgSO4.7H2O 3.7
KH2PO4 1.7
CALCIO (10 X) gL-1)
CaCl2.2H2O 4.4
MICRONUTRIENTES (100 X)
MnSO4.H2O 1.69
ZnSO4.7H2O 0.86
H3BO3 0.62
KI 0.083
Na2MoO4.2H2O 0.025
CuSO4.5H2O 0.0025
CoCl2.6H2O 0.0025
HIERRO Y EDTA (10 X)
FeSO4.7H2O 0.278
Na2EDTA.2H2O 0.372
VITAMINAS (20 X)
Mioinositol 2
Tiamina HCl 0.002
Acido nicotnico 0.01
Piridoxina HCl 0.01
Glicina 0.04
SOLUCIONES MADRE DEL MEDIO DKW MODIFICADO (g/L-1)
A (10 X)
NH4NO3 14.16
CaCl2 2 H2O 1.47
Ca (NO3)2 3 H2O 18.11 ( 19.60 g/l si es 4 H2O )
B (10 X)
KH2PO4 2.58
C(10 X)
K2SO4 15.6
D (10 X)
Mg SO4 7 H2O 7.4
E (50 X)
Mn SO4 7H2O 1.69
Zn SO4 7H2O 1.06
BO3H3 0.6.2
KI 0.083
Na2MoO4 2H2O 0.025
Cu SO4 5 H2O 0.0025
Co Cl2 6H2O 0.0025
F1 (100 X)
Glutamina (base libre ) 0.1
L-Cistena HCl 0.1
F2 (100 X)
Biotina D(+) 0.001
Tiamina H Cl 0.1
c. Nicotnico 0.1
Piridoxina 0.1
Pantotenato de Ca 0.1
G (10 X)
Mioinositol 1
H (10 X)
Fe SO4 7H2O 0.338
Na2 EDTA 2H2O 0.454
Hormonas (1000 X)
BAP 1
IBA 1
Establecer ocho equipos de trabajo por cada grupo de prcticas (dos en cada lateral de una mesa).
Normas generales a la hora de pesar
- Comprobar los clculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre estn
expresados para un litro
- Leer las caractersticas del reactivo que se va a pesar. Algunos son txicos por inhalacin o en
contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones.
- Desde 0.01 g se utilizar el granatario. Para valores inferiores la balanza de precisin.
- Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se est haciendo la pesada. Nunca se debe
pesar directamente sobre el platillo de la balanza.
- Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que
est limpia y seca. Es una precaucin que evita la contaminacin de los reactivos
- Hay que tener la precaucin de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo
que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tom.
Normas generales a la hora de preparar las disoluciones
- Si la disolucin se va a remover con un agitador mecnico el mejor recipiente es un vaso de
precipitados. Si la agitacin es manual, suele ser mejor un erlenmeyer.
- Antes de empezar a aadir los solutos se deber poner un 70% del volumen total de agua
- Cuando una disolucin incluya ms de un reactivo, estos se aadirn uno a uno y teniendo
la precaucin de no aadir uno hasta que el otro est totalmente disuelto.
- Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de
precipitados o un erlenmeyer.
- Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren
los siguientes datos:
- Tipo de solucin. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc
- Grado de concentracin. Ej 100 X (100 veces ms concentrada que la solucin final)
- Componentes con frmula y peso en g/l
- Fecha de preparacin
Equipo 1 Preparar 250 ml de la solucin de macronutrientes del medio MS.
Equipo 2 Preparar 250 ml de la solucin de Calcio MS y 250 ml de la solucin de Hierro y EDTA
MS. En este segundo caso, se deber poner en el recipiente donde se prepara la disolucin un
volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y adicionar la solucin de hierro.
Cuando se haya disuelto, adicionar poco a poco y en agitacin las sales de EDTA hasta su total
disolucin. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en frasco topacio
en el frigorfico
Equipo 3 Preparar 250 ml de la solucin de micronutrientes del medio MS
Equipo 4 Preparar 250 ml de la solucin de vitaminas del medio MS
Equipo 5 Preparar 250 ml de de cada una de las siguientes soluciones A ,B, C y D del medio DKW
Equipo 6 Preparar 250 ml de cada una de las siguientes soluciones: F1, G, H y las hormonas del
medio DKW.
- La solucin H se prepara del siguiente modo: se pone en el recipiente donde se prepara la
disolucin un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y se adiciona la sal de
hierro. Cuando se haya disuelto, se adicionan poco a poco y en agitacin las sales de EDTA
hasta su total disolucin. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en
frasco topacio en el frigorfico
- Hormonas. Se prepararn 10 ml de cada una de las disoluciones. Para cada una de ellas se
proceder del siguiente modo: Se pesar la hormona en el un tubo aforado. Se le aaden
unas gotas de NaOH 1N y se disuelve. A continuacin se va aadiendo poco a poco y
agitando, agua destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf.
Se rotulan cada uno de ellos y se guardan en el congelador.
Equipo 7 Preparar 250 ml de la solucin E
Equipo 8 Preparar 250 ml de la solucin F2. Primero se preparan 500 ml de la solucin de biotina.
De estos 500 ml, se toman 250ml y se les aade la cantidad correspondiente a 250 ml del
resto de las vitaminas.
5. BIBLIOGRAFA
lvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prcticas de
Biotecnologa Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz)
Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hort.
Science, 19(4).
Murashige, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologa Plantarum, 15, 473-497.
Revilla Bahillo, ngeles y Ords, Ricardo. Guiones de prcticas de Biotecnologa Vegetal.
Universidad de Oviedo
PREPARACIN DE MEDIO NUTRITIVO PARA EL CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOSVEGETALES
http://ccagro.uaa.mx/cca/material/AG/S04/M/AGM24S04.pdf
Introduccin
Para mantener la viabilidad de un cultivo de tejidos, estimular su diferenciacin y guiar su
crecimiento, ste requerir de una dieta balanceada de nutrientes y hormonas.
Los medios de cultivo son combinaciones de sustancias qumicas que los investigadores han descrito
despus de numerosos experimentos y que permiten que las plantas crezcan y se multipliquen in vitro.
Los ingredientes de un medio de cultivo vegetal pueden clasificarse en: 1) sales inorgnicas
(minerales), 2) compuestos orgnicos, 3) preparaciones naturales complejas y 4) materiales inertes.
I. SALES INORGANICAS
Los esfuerzos realizados para optimizar las necesidades de plantas especficas, han dado como
resultado
numerosas frmulas de mezclas de sales. Sin embargo, los elementos mayores esenciales que todas las
plantas requieren y que estn presentes en los fertilizantes comunes, tambin forman parte de los
medios de cultivo: Nitrgeno (N), Fsforo (P), Potasio (K), Azufre (S), Calcio (Ca), Magnesio (Mg)
y Hierro (Fe).
Adems de los elementos menores, que tambin son esenciales pero que se requiere en cantidades
extremadamente pequeas: Boro (B), Molibdeno (Mo), Manganeso (Mn), Cobalto (Co), Zinc (Zn),
Cobre (Cu), Cloro (Cl) y Yodo (I).
Una de las mezclas de sales ms usadas es la descrita por Murashige y Skoog. Esta es conocida como
frmula MS.
II. COMPUESTOS ORGANICOS
En esta categora se encuentran sustancias como carbohidratos, hormonas o reguladores de
crecimiento, vitaminas y algunos otros compuestos que se han descrito como beneficiosos para el
cultivo de tejidos: aminocidos, amidas, purinas y pirimidinas y cidos orgnicos.
- Los carbohidratos: son sustancias orgnicas como los azcares que proveen tres de los elementos
mayores esenciales: Hidrgeno (H), Carbono (C) y Oxgeno (O).
Los azcares son producto de la fotosntesis, proceso por medio del cual la planta convierte el dixido
de carbono y agua en carbohidratos con la ayuda de la clorofila y la luz. Sin embargo, las plantas que
crecen in vitro, debido a la baja intensidad lumnica, no pueden fabricar todo el azcar que requieren,
por lo que se adicionan altas concentraciones de sacarosa al medio de cultivo.
- Hormonas: las sustancias hormonales crticas en el cultivo de tejidos son las auxinas y las
citoquininas. Estas intervienen en la elongacin y divisin celular, formacin de brotes y races y en la
germinacin de las semillas.
Entre las auxinas ms utilizadas en el cultivo de tejidos se encuentra: cido indolactico (AIA), cido
naftalenactico (ANA), 2,4-D, picloram. Entre las citoquininas se encuentra: benzilaminopurina
(BA), la kinetina y zeatina.
Las giberelinas y el cido abscsico son tambin utilizadas en algunos casos.
- Vitaminas: la vitamina que se ha demostrado consistentemente como importante en el cultivo de
tejidos es la tiamina. Sin embargo, otras han sido utilizadas con frecuencia por estimular procesos
especficos: biotina, cido nicotnico, piridoxina, pantolenato, riboflavina. - Aminocidos: entre los
aminocidos y amidas que se han mostrado ms frecuentemente como beneficiosos est L-arginina,
L-cido aspartico, L-glutamina, L-cido glutmico y L-tirosina.
Otros compuestos orgnicos comnmente empleados en el cultivo de tejidos son el inositol, adenina,
sulfato de adenina, el cido ctrico y el ascrbico (para evitar la oxidacin de los tejidos).
III. PREPARACIONES NATURALES COMPLEJAS
Una gran variedad de sustancias de composicin indefinida han sido utilizadas para enriquecer los
medios de cultivo. Entre ellas se menciona: extracto de malta, agua de coco, extracto de levadura,
pulpa de banano, casena hidrolizada y jugo de naranja y tomate
IV. MATERIALES INERTES
- Geles hmedos que actan como agentes de soporte: agar, gelrite, fitagel.
- Carbn activado que en bajas concentraciones contrarresta efectos negativos que producen algunas
sustancias liberadas al medio por el cultivo (fenoles).
FORMULACION DE SALES DE ORMULACION MURASHIGE Y SKOOG
Debido a que sta frmula es frecuentemente usada en la micropropagacin de un gran nmero de
especies vegetales, se describe a continuacin:
Macroelementos Compuestos mg/L
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2.2H2O 440
MgSO4.7H2 O 370
KH2PO4 170
Microelementos
H3BO3 6.2
MnSO4.H2O 16.8
ZnSO4.7H2O 8.6
KI 0.83
Na2MoO4.2H2O 0.25
CuSO4.5H2O 0.025
CoCl2.6H2O 0.025
Hierro
Na2EDTA 37.3
FeSO4.7H2O 27.8
Propsito especfico de la prctica
Preparacin de un medio nutritivo bsico sin fitorreguladores til para la siembra explantes y el
crecimiento de plntulas aspticas a partir de semillas in vitro
Criterios de desempeo
Como profesional en formacin sers competente para Preparar un medio nutritivo bsico sin
fitorreguladores til para la siembra explantes y el crecimiento de plntulas aspticas a partir de
semillas in vitro cuando:
RRTengas el conocimiento terico acerca de los nutrientes esenciales que requieren las plantas para
vivir.
RRTengas los reactivos apropiados y las soluciones madre preparadas con anticipacin.
Resultados esperados.
Que prepares un litro de medio nutritivo segn la formula de Murashigue y Skoog (1963)
Normas de seguridad especficas de la prctica.
Cuadro de Deteccin de Riesgos particulares de la prctica

Tipo de
peligro
Como evitarlo Como proceder en caso de un accidente
Quemaduras
por
contacto con
el
autoclave
Utilizar
guantes de
asbesto
al manipular la
tapa
Cubrir la zona afectada inmediatamente con un trapo humedecido.
Si la quemadura es leve, untar una porcin de pomada para
quemaduras. En caso grave acudir con el medico
Momento Actividad Duracin (horas)
1 Preparar soluciones madre 2
2 Pesar y agregar soluciones segn la formula 0.5
3 Fundir el agar y agregar el medio a los recipientes
De cultivo, esterilizar
1.5
b) Dinmica
Se explicar con detalle el procedimiento de preparacin de los medios de cultivo, de manera que el
estudiante que se inicia en el rea del cultivo de tejidos encuentre aqu una gua. Debe tener en
cuenta
que existen en el mercado frmulas completas listas para su uso que podrn usarse cuando el proceso
es rutinario, sin embargo, stas son ms costosas.
Debido a que el medio de cultivo es uno de los factores ms importantes en el xito del proceso es
importante trabajar con cuidado y despacio al principio para poder anticipar las consecuencias de
cada
accin y familiarizarse con el equipo, cristalera, etc.
Preparacin de las soluciones madre:
Por lo general, la preparacin del medio de cultivo se inicia preparando soluciones concentradas
(madre) de uno o ms compuestos. Determinado volumen de cada una de estas soluciones se
mezclar ms tarde para preparar el medio de cultivo final.
Es recomendable preparar las soluciones madre en cantidades relativamente altas y con antelacin
para
ahorrar el tiempo y el trabajo que implica pesar cada uno de los ingredientes cada vez que se prepara
un medio de cultivo. Adems, como muchos de los componentes (microelementos, vitaminas,
hormonas) son requeridos en pequeas cantidades, si se multiplica esa cantidad por un determinado
nmero de veces para preparar la solucin madre, la labor de pesado ser ms fcil y ms precisa.
La concentracin de la solucin madre debe ser un factor a considerar. Soluciones madre muy
concentradas tienden a formar precipitados. En algunos casos estos precipitados son el resultado de
mezclar sustancias incompatibles, por ejemplo, calcio y fosfato o sulfato, magnesio y fosfato. Es
recomendable que la solucin madre no sea mayor de 100 veces (100X) la concentracin final del
medio, sin embargo, el volumen de medio a preparar por semana en el laboratorio dar la pauta para
considerar el grado de concentracin de la solucin madre. Si la solucin madre presenta precipitados
es mejor descartarla ya que no poseer el balance adecuado de sustancias, alguna proporcin de stas
estar en el fondo con el precipitado. La calidad del agua:
Otro punto importante de tener en cuenta es el uso de agua desionizada (desmineralizada), destilada
o bidestilada para la preparacin de los medios de cultivo.
- Almacenamiento de las soluciones madre:
Las soluciones madre deben almacenarse en el refrigerador. No se puede dar un dato exacto de cuanto
tiempo pueden permanecer almacenadas sin que sufran deterioro, pero como regla general, los
compuestos inorgnicos son ms estables que los orgnicos, por lo que se ha recomendado almacenar
auxinas y citocininas por un mximo de 2 semanas y los otros componentes por 2 meses, sin
embargo, si se observa un precipitado la solucin debe descartarse inmediatamente.
Con un ejemplo se explicar como se prepara una solucin madre (50X) tomando como base la
frmula de sales minerales de Murashige y Skoog.
Preparacin de los macroelementos y microelementos:
NH4NO3 la frmula indica 1650 mg/l en el medio de cultivo, por lo tanto, para preparar una solucin
50X (50 veces ms concentrada, que ser suficiente para preparar 50 litros de medio de cultivo)
multiplique 1650 mg x 50 = 82500 mg (82.5 g). De la misma manera multiplique la cantidad
indicada para cada uno de los otros macroelementos. En un matraz aforado de 1 litro que contenga
aproximadamente 500 ml de agua destilada agregue las cantidades pesadas de cada uno de los
macroelementos, agite y llene el matraz con agua hasta la marca de aforo. Vuelque el matraz de
manera que quede una burbuja en el fondo y agite varias veces. Repita unas dos veces. Transfiera la
solucin de macroelementos a una botella para su almacenamiento en el refrigerador. Etiquete la
botella. No olvide escribir la frmula que us (Macro MS), concentracin (50X), fecha, nombre de la
persona que los prepar.
Para recordar la cantidad a agregar por litro de medio de cultivo a preparar recuerde dividir 1000
ml/50 = 20 ml de la solucin madre/l litro de medio de cultivo. Repita la operacin pero con los
microelementos.
Preparacin del Hierro:
Para preparar la solucin madre de hierro, ponga a hervir aproximadamente 700 ml de agua
bidestilada (destilada o desionizada dependiendo de las facilidades con que disponga) en un
erlenmeyer de 1000 ml, cuando est hirviendo agregue la cantidad pesada de Na2EDTA y
FeSO4.7H2O (recuerde que est preparando una solucin madre 50X, por lo tanto, multiplique la
cantidad indicada en la frmula por 50) hasta que desarrolle color.
Tpela y djela enfriar en un lugar oscuro. Cuando est a la temperatura ambiente transfirala a un
matraz aforado y agregue agua hasta la marca de aforo.
Almacena en el refrigerador en una botella mbar para evitar la foto descomposicin. Si no dispone
de botella mbar forre una botella con papel aluminio. Identifquela.
PROCEDIMIENTO: Preparacin de medio MS para el cultivo in vitro de tejidos vegetales.
1. Utiliza un recipiente cuyo volumen sea dos veces mayor que el final a preparar, agregue agua
destilada hasta completar aproximadamente el 90% de dicho volumen final. Por ejemplo, para
preparar 1 litro de medio se agregarn 900 ml de agua.
2. Pesa y agrega cada uno de los siguientes compuestos, agitando suavemente hasta disolver.
NH4NO3 1.650 g
KNO3 1.900 g
MgSO4.7H2O 0.370 g
KH2PO4 0.170 g
CaCl2.2H2O 0.440 g
3. Selecciona una pipeta de graduacin adecuada, para cada uno de las siguientes soluciones
concentradas tome el volumen indicado y agrgelo al recipiente mientras agita suavemente.
Sol. A 1.0 ml
Sol. B 1.0 ml
Sol. C 1.0 ml
Sol. FeEDTA 10 ml
Sol. Vitaminas 5 ml
4. Pesar y agrega la sacarosa (30g/L) y cualquier otro compuesto orgnico que se desee (ej.
Reguladores vegetales).
5. Mientras agitas continuamente, ajusta el pH en un valor deseado (ej. 5.7). Para aumentar el valor
agrega algunas gotas de NaOH y para disminuirlo agrega HCl 0.1N respectivamente.
6. Pesa y agrega el gelificante (ej. 2.0 g/L de Fitagel.
7. Agrega agua destilada adicional hasta completar el volumen final deseado.
8. Calienta la solucin a 108C aproximadamente hasta que la turbidez del gelificante se clarifique.
9. Vaca con cuidado el medio en los recipientes o frascos de cultivo y coloque las tapas.
10. Coloca los frascos de modo ordenado dentro de la autoclave y esteriliza durante 15 min. A 121C .
Sistema de evaluacin
La evaluacin se basa en la asistencia obligatoria a la prctica y en la entrega individual de un reporte
escrito que deber cumplir con las recomendaciones generales que en este manual se proponen
(Anexo 1)
El medio que prepares deber mantenerse semislido y estril despus de una semana y se utilizar
para la prctica siguiente
Contesta el siguiente cuestionario:
1. Describe las funciones que cada uno de los siguientes elementos y compuestos desempean dentro
de las plantas.:Nitrgeno, Fsforo, Potasio. Calcio, Azufre, Magnesio, Fierro, Manganeso, Cobre,
Zinc,Molibdeno, Boro, Cloro, Glicina, Piridoxina, Tiamina, Myo-inositol, Ac. nicotnico, Biotina, Ac
pantotnico.
2. Investiga las frmulas de al menos tres tipos de medios nutritivos diferentes al MS (Murashige and
Skoog).
3. Explica los mecanismos de cotransporte (simporte y antiporte) mediante los cuales, tanto aniones
como cationes nutrientes entran a la clula a travs de la membrana plasmtica y del tonoplasto.
4. En el cultivo de tejidos la mayora de las veces los explantes son secciones de tejidos carentes de
un
rgano especializado en la absorcin de agua y nutrientes (raz). Explique cmo estos tejidos pueden
incorporar dichos nutrientes y mediante cules rutas pueden transportarlos?
5. Qu diferencia presenta la nutricin hidropnica e in vitro en comparacin con la nutricin en
suelo, en relacin con la disponibilidad de los nutrientes minerales?
BIBLIOGRAFA
Roca, W.M. y Mroginsky, L.A. 1991 Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y
aplicaciones. CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical). Colombia.
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Taiz, L. and Zeiger, E. 1998. Plant Physiology 2nd edition. The Benjamin/Cummings
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