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Informe Final Bioprocesos Grupo A1
Informe Final Bioprocesos Grupo A1
servicio al
cuidadano
CURSO:
LABORATORIO DE INGENIERA DE
BIOPROCESOS
DOCENTE:
CASTILLO CALDERN AUGUSTO
TEMA:
INGENIERA DEL CULTIVO CELULAR
POR LOTES DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-
7124
INTEGRANTES:
Se llev acabo el desarrollo del cultivo celular de la cepa Pichia stipitis NRRL
Y 7124, aplicando toda la metodologa de un diseo de cultivo por lote con la
manipulacin desde su estado inactivo en agar. Se sigui una serie de
procedimientos secuenciales tales como activacin en el shaker, inoculacin en
agar, proporcionndoles todas las condiciones y facilidades para que pueda
crecer, asimismo siguiendo con la secuencia se inoculo en un medio
denominado rico (15ml), el cual contiene todos los nutrientes que esta bacteria
requiere para su ptimo desarrollo.
Se evidencio el crecimiento en el medio rico, la totalidad de este medio es
diluido dentro de otro medio al que se denomina mnimo (200 ml) por sus
limitaciones en cuanto a nutrientes, ya que este contiene solo los componentes
necesarios para que el microorganismo pueda subsistir, tales como fuente de
carbono que en nuestro caso fue Xilosa.
Se procedi a observar y comparar como se va produciendo el crecimiento
celular con los nutrientes exactamente necesarios y establecidos para tal efecto
y al mismo tiempo como va disminuyendo el sustrato en este caso
principalmente la Xilosa, por el consumo que realiza el microorganismo como
fuente principal para su desarrollo. Y esto es posible determinar haciendo
evaluaciones tales como crecimiento de biomasa mediante absorbancia (640
nm en el espectrofotmetro) y el ensayo con reactivo DNS para el caso del
sustrato con una absorbancia de 540 nm en el espectrofotmetro y la
generacin de productos como el etanol el cual ser medido mediante GC
(cromatografa de gases) usando como factor externo n-propanol.
Los tres aspectos (crecimiento de biomasa, consumo de sustrato y generacin
de producto) evaluados en un determinado tiempo, son expresados en grficas
adems de ser comparados en una curva de calibrado para ambos casos, nos
darn informacin sobre el microorganismo tales como un max igual 0.382 h -1,
un tiempo de crecimiento (t) equivalente a 10 horas (Pichia stipitis NRRL Y
7124).
INTRODUCCION
II.2. DISEO
El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de
los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de
productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe
tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el
microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los
requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del
proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre
las materias primas. Otros aspectos que son tambin importantes se
refieren a todos los procesos y operaciones previas y posteriores a la etapa
de fermentacin y al conocimiento de los mecanismos bioqumicos que
regulan la formacin de algunos productos.
Si la
El extracto de malta
Un extracto acuoso de la cebada malteada (cebada germinada que produce
enzimas que hidrolizan el almidn), es un sustrato excelente para muchos
hongos filamentosos, levaduras y actinomicetos. El extracto seco de malta
contiene aproximadamente 90-92% de carbohidratos y est compuesto de
hexosas (glucosa y fructosa), disacridos (maltosa, sacarosa), trisacridos
(maltotriosa) y dextrinas (polmeros de glucosa 1,4 con ramificaciones 1,6).
Las sustancias nitrogenadas presentes en el extracto de malta incluyen
protenas, pptidos, aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas. Los
medios de cultivo que contienen extracto de malta deben ser esterilizados
cuidadosamente. Cuando existe sobrecalentamiento se produce la reaccin
de Maillard debido al bajo pH y a la alta proporcin de azcares reductores.
En esta conversin los grupos aminos de las aminas, aminocidos
(especialmente lisina) o las protenas reaccionan con los grupos carbonilo
de los azcares reductores, aldehdos y cetonas, lo que resulta en la
formacin de productos de condensacin de color tostado. Estos productos
de reaccin no son sustratos adecuados para los microorganismos.
El agar
Presenta algunos inconvenientes; el principal consiste en ofrecer una
aireacin insuficiente que puede afectar el crecimiento de algunos tejidos.
Por otra parte, la composicin del agar es variable y, a veces, mal definida y
podra aportar oligoelementos que actan favorablemente sobre el
crecimiento
2.5. PARMETROS A TENER EN CUENTA EN UN MEDIO DE CULTIVO
Aporte de nutrientes:
La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene
determinada por el rendimiento de un producto en especial adems de los
requerimientos nutricionales del microorganismo
pH:
Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de
las sustancias producidas por el propio microorganismo; por ejemplo:
Utilizacin de carbohidratos Produccin de cidos orgnicos
Acidificacin
Necesidades de gases:
Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxgeno y el
dixido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al
oxgeno libre clasificndose en cuatro grupos:
Control de la temperatura:
El desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas, y la
velocidad con que se efectan estas reacciones est influida por la
temperatura, por lo que la temperatura puede en parte determinar la
velocidad de crecimiento de los microorganismos.
El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un
lado cada reaccin qumica individual, de todas las que conforman el
metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento
de sta resulta en una mayor velocidad de reaccin.
Biomasa
Concentracin de nutrientes:
Aireacin:
b) Instrumentos e Equipos
Balanza analtica
Olla a presin (autoclave)
Mechero Bunsen
c) Reactivos
Componentes segn la
tabla N1
Extracto de levadura 3g/L
de solucin
Peptona 5g/L de solucin
Extracto de malta 3g/L
Agar 20g/L de sokucin
Glucosa 10g/L
Muestra: Pichia sttpitis NRRL Y
7124
Sustrato: Xilosae
Agua destilada
Agua destilada
Mechero Bunsen
Agitador Maxi Mix
Bao Maria
c) Reactivos
HClcc
Sacarosa
NaOH 1.7M
Agua destilada
DNS
a) Materiales
b) Instrumentos y equipos
Mechero Bunsen
Agitador Maxi Mix
Espectrofotmetro
c) Reactivos
DNS
Agua destilada
1 Matraz de 125ml
2 tubos de ensayo con tapa
1 pipeta de 5ml
Gradilla
b) Instrumentos e Equipos
Autoclave
Mechero bunsen
c) Reactivos
Glucosa
Extracto de levadura
Extracto de malta
Solucin de sales
Agua destilada
1 Matraz de 500ml
2 tubos de ensayo con tapa
Gradilla
b) Instrumentos e Equipos
Autoclave
Mechero bunsen
c) Reactivos
Sacarosa
Extracto de levadura
Solucin de sales
Tampn citrato
Agua destilada
Cintica de cultivo
d) Materiales
Alcohol 96
Algodn
Jabn
2 Pipeta 10 ml y 5 ml
7 viales
Tubos de celda
Papel toalla
Taper de plstico
a) Instrumentos e Equipos
Mechero bunsen
Centrifuga
Espectrofotmetro
Refrigeradora
b) Reactivos
Agua destilada
Determinacin de la concentracin celular por D.O.
Diluciones
a) Materiales
1 matraz (medio rico)
2 pipeta (5ml y 2 ml)
1 gradilla
3 tubos de ensayo
Tubos de celda
b) Instrumentos y equipos
Espectrofotmetro
c) Reactivos
Agua destilada
Peso Seco
a) Materiales
3 capachos de aluminio
1 matraz (medio rico)
2 pipetas 5ml
Celdas (tubo)
3 tubos de ensayo
b) Instrumentos y equipos
Espectrofotmetro
Centrifuga
Estufa
Balanza analtica
c) Reactivos
Agua destilada
b) Instrumentos y equipos
Agitador Maxi Mix
Bao Maria
c) Reactivos
Sobrenadantes (medio rico)
HClcc
NaOH 1.7M
Agua destilada
DNS
a) Materiales
8 tubos de ensayo sin tapa
Gradilla
Micropipeta con puntas
Vasos precipitado
Olla con trpode
Hielo
Celdas
b) Instrumentos y equipos
Mechero Bunsen
Agitador Maxi Mix
Espectrofotmetro
c) Reactivos
DNS
Muestra de la hidrolisis de la sacarosa
Agua destilada
C1 H1.79 O0.60
N0.17
(Levadura -formula qumica)
No obstante que los microorganismos (Pichia stipitis NRRL Y-7124) varan
considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible
efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes como son
los macronutrientes representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg y
micronutrientes representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co.
Requerimientos nutricionales
Fuente
Fuente de de K
Xilosa N
Sulfat sulfato de fosfato fosfato
o de magnesio dicido dicido
Fuente de amoni de de
carbono y o Fuente Potasio Potasio
energa de Mg y S Fuente
de P
Solucin de sales: heptahidrat
ado
Solucin de sales concentrada (100 veces)
Fuente de Ca : CaCl2
Fuente de Na : NaCl
Fuente de Fe : FeSO4.7 H2O
Fuente de Cu : CuSO4.5 H2O
Fuente de Mn : MnCl2.6H2O
Fuente de Mo : MoO3
Fuente de Co : CoCl2.6H2O
Fuente de Zn : ZnSO4.7H2O
Condiciones de cultivo
pH 4.5
Velocidad de agitacin(Shaker)
120 rpm
Tabla 05: Composicin del medio mnimo de cultivo de Pichia Stipitis NRRL Y-
7124 para un crecimiento en biomasa de 2 g/L.
Gaza Gruesa
CORTAR
Perpendicularmente en
COLOCAR
la boca del matraz.
Encima de la gaza el
HUNDIR algodn a presin
(Vasos precipitados,
matraz y tubos de
ensayo). LAVAR
En la Estufa en
SECAR posicin vertical
COLOCAR Un filtro de algodn
en las pipetas
(Vasos precipitados,
Con papel
matraz y tubos de ENVOLVER
ensayo). aluminio
Extracto de levadura,
peptona, extracto de
malta y agar
PESAR
CALENTAR
Constantemente con un
AGITAR varilla por un minuto
(aparicin de la primera
burbuja).
6 tubos de 6-7 ml de la mezcla en
ensayo con tapa. caliente a cada tubo de
DISTRIBUIR
ensayo, con pipeta de 10
ml
121 C / 20 min
CALENTAR
AGITAR
REFRIGERA
5. MEDIO DE ACTIVACIN
Xilosa, extracto de
levadura, extracto de PESAR
malta
En 20ml de agua
DISOLVER
destilada
Solucin de sales
MEDIR
MEZCLAR
6. PREPARACIN DEL MEDIO DE
FERMENTACIN, SEGN LA TABLA 03
PARA EL CULTIVO DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124
7. MEDIO DE FERMENTACIN
Materiales a utilizar (garantizar asepsia)
ESTERILIZAR
El Asa Bacteriolgica
Cada compuesto en agua
1ml Solucin de Sales destilada:
(Al rojo vivo) MEDIR
SOMETER
-
Xilosa en un matraz de 500
ml con 130 ml agua
destilada.
- Extracto de levadura con
DISOLVER 20ml de tampn citrato en
ENFRIAR Pormatraz
unos segundos
un de 125ml
- Las 3 sales en un tubo con
15ml de agua destilada.
ESTERELIZA - Solucin de sales en un
tubo con 14ml agua
Una azada EXTRAER
delR
Tubo de Ensayo que
Lascontena las clulas
disoluciones por desarrolladas
separado.
ENFRIAR
o RESEMBRAR
MONTAJE DEL EQUIPO En tubos de ensayo
EXPERIMENTAL, preparados
CULTIVO con medio slido (Agar
DEL M.O.,
ETC.
REALIZAR
Azada desde dentro hacia fuera en el tubo (Cruzado)
LLEVAR
A la Incubadora a 30C durante 24 a 48 horas.
El tubo de Ensayo
Para cerrarlo FLAMEAR
ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INCULO
INOCULAR
En el Matraz con los 20ml del medio de activacin
MEDIR
Estas X0
se realizaran
y S0 con D.O
cada hora y media
Se toman las para la primera
5ml del medio
medidas de cultivo
de asepsia EXTRAER muestra y
en la zona de trabajo posteriormente cada
y el encendido del hora de la siguiente
mechero. manera:
La toma de muestras
se inicia desde la
dilucin del medio
de activacin en el
medio de
MEDIR
fermentacin. Absorbancia a 640nm y pH
CENTRIFUGAR
A la mxima velocidad por 20 minutos
VERTER Y GUARDAR
El sobrenadante en viales y ponerlos en refrigerador
Con el fin de despus determinar el consumo de sustrato
2. Tabular Si vs. i
dX / dt = m X .()
X = X0 e mt
% de C en la clula = 46.57 %
ENFRIAR
Agua
destilada
10
AADIR
volmenes
RESUSPENSE Sobrenadante
ELIMINAR Sobrenadante
REDISOLVER Precipitado
SECAR Estufa: 80 C
hasta peso
constante
IV. RESULTADOS
XILOSA
N (2g/l) ABS 540 nm
1 2 1,135
2 1,6 0,925
3 1,2 0,743
4 0,8 0,461
5 0,4 0,201
6 0,2 0,091
7 0 0
TABLA N1- CURVA DE CALIBRADO DNS
ABS 540 nm
f(x) = 0.59x - 0.01
R = 1
ABS 540 nm
Linear (ABS 540 nm)
x(g/L)
f(x) = 0.34x - 0
GRAFICA N02 CURVA DE CALIBRADO PARA BIOMASA CELULAR (Todos los
Grupos)
BIOMASA
SUSTRATO
GRAFICA N 03 Crecimiento cintico y consumo del sustrato en la experiencia
con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como fuente de carbono
GRUPO A-1
Ln(X/Xo)
LN(X/Xo)
GRAFICA N 05 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para
determinar el umax en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando
XILOSA como fuente de carbono
TABLA N02 : Parmetros cinticos y rendimientos determinados en la
experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como fuente de
carbono.
s x
GRAFICA N 06 Crecimiento cintico y consumo del sustrato en la experiencia
con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando GLUCOSA como fuente de carbono
GRUPO A-2
GRAFICA N 07 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para
determinar el umax en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando
GLUCOSA como fuente de carbono
BIOMASA
SUSTRATO
GRAFICA N 09 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para
determinar el umax en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando
la mezcla de GLUCOSA +XILOSA como fuente de carbono
V. DISCUSIONES
VI. CONCLUSIONES
VII. BIBLIOGRAFIA
VIII. ANEXOS