El gen Channelrhodopsin-2 transducido en las

clulas ganglionares de la retina restaura la

visin funcional en ratas genticamente ciegas

RESUMEN
Para probar la hiptesis de que la transduccin (proceso por el que se introduce
material gentico exgeno utilizando un virus como vector) del gen
channelrhodopsin-2 (ChR2), un gen de la rodopsina (La rodopsina es una
protena transmembranal que, en humanos, se encuentra en los discos de los
bastones de la retina. Rodopsinas Microbianas: Molculas de rodopsina que se
encuentran en microorganismos tales como ARCHAEA y PROTEOBACTERIA.) de
tipo microbiano, en las clulas ganglionares retinianas de ratas genticamente
ciegas restaurar la visin funcional, registraremos potenciales visualmente
evocados y probaremos a las ratas experimentales para la presencia de
respuestas optomotoras. El fragmento N-terminal del gen ChR2 se fusion a la
protena fluorescente Venus y se insert en un virus adeno-asociado (El AAV es
un virus muy simple y no autnomo, que contiene ADN lineal de cadena
sencilla. El virus requiere la coinfeccin con adenovirus u otros para replicarse.)
para producir AAV2-ChR2V. AAV2-ChR2V se inyect intravitrealmente (literal le
meten la aguja en el ojo) en los ojos de ratas distrficas RCS (rdy / rdy) de 6
meses de edad. Se evalu la funcin visual seis semanas despus de la
inyeccin registrando los potenciales evocados visuales (resultan de los cambios
producidos en la actividad bioelctrica cerebral tras estimulacin luminosa.) (VEPs) y las
respuestas optomotoras (La respuesta optomotora es un comportamiento
innato comn a los peces [1] y todos los insectos. Sirve para la estabilizacin
del curso durante la locomocin libre a travs de un desplazamiento
involuntario desde un curso recto. [2] El propsito de este comportamiento es
recuperar el curso deseado de locomocin.) de prueba. La expresin de ChR2V
en la retina se investig histolgicamente. Encontramos que los VEP no se
podan registrar de ratas RCS distrficas de 6 meses de edad que no haban
sido inyectadas con AAV2-ChR2V. Por el contrario, se obtuvieron VEP de ratas
RCS seis semanas despus de la inyeccin con AAV2 ChR2V. Los VEP se
registraron a tasas de estimulacin.
Introduccin
La canalrhodopsina-2 (ChR2), clonada a partir de las algas verdes
Chlamydomonas reinhardtii, se clasifica como una rodopsina de tipo
microbiano que puede ser activada por longitudes de onda especficas de luz.
ChR2 es similar a la bacteriorhodopsina, que utiliza un cromforo adjunto para
absorber los fotones. Una fotoisomerizacin reversible de la isoforma
totalmente trans del retinaldehdo cambia su conformacin, y esto induce
directamente el movimiento inico a travs de la membrana. Es esta
caracterstica especfica que permite que ChR2 funcione como un canal de
cationes despus de la exposicin a la luz.
Retinitis pigmentosa (RP) es una enfermedad degenerativa de la retina que se
asocia con una prdida progresiva de clulas fotorreceptoras que resulta en
una prdida de los campos visuales perifricos, luego la visin central y
finalmente la ceguera. Mutaciones de varios genes han demostrado causar RP,
y estos genes estn relacionados principalmente con la va de la
fototransduccin. Lamentablemente, estos resultados no han conducido a una
forma exitosa de tratar o prevenir la RP. Se ha investigado recientemente una
nueva estrategia para restaurar la visin, a saber, la transduccin del gen
channelrhodopsin-2 (ChR2) en ratones genticamente ciegos (Bi et al., 2006).
Estos experimentos se han realizado en animales que tienen la misma
mutacin que los seres humanos con retinitis pigmentosa (Bowes et al., 1990,
Pittler y Baehr, 1991). Tambin hemos informado que la inyeccin intravtrea
del gen ChR2 en ratas ms viejas de la Royal College of Surgeons (RCS) (Mullen
y LaVail, 1976), un modelo animal de retinitis pigmentaria hereditaria recesiva
(D'Cruz et al. Et al., 2000), restaur la visin funcional (Tomita et al., 2007).
Estas observaciones sugirieron que la transduccin del gen ChR2
proporcionara un nuevo mtodo para tratar ojos con RP que es independiente
de la etiologa de la degeneracin retiniana.
Flannery y Greenberg (2006) informaron que las pruebas de comportamiento
seran necesarias para determinar si el uso de ChR2 era una estrategia viable
para restaurar la visin funcional a animales ciegos. Lagali et al. (2008) inform
que las clulas ON-bipolar que fueron diseados para ser fotosensible por la
transferencia del gen ChR2 restaurado respuestas conductuales a ratones
genticamente ciegos. Cuando el gen ChR2 se transdujo en clulas ON-
bipolares, la va de retina ON se activ selectivamente por luz. Esta es una
forma razonable de activar la va ON normal de la retina, aunque todava
existen algunas dificultades metodolgicas cuando se consideran las
aplicaciones clnicas, por ejemplo, el mecanismo de transferencia gnica a las
clulas ON-bipolares. Las clulas ganglionares de la retina son buenos
candidatos para recibir el gen ChR2 porque los genes diana pueden ser
fcilmente transducidos en ellos. Hemos demostrado que una nica inyeccin
de un vector AAV incluyendo ChR2 hizo posible cambiar alrededor del 30% de
todas las clulas ganglionares de la retina a clulas ganglionares fotosensibles.
Recientemente se inform que la expresin ectpica (es un desplazamiento o
mala ubicacin de un rgano del cuerpo) de la melanopsina en las clulas
ganglionares de la retina de los ratones de degeneracin retiniana da como
resultado una visin funcional (Lin et al., 2008). De la misma manera, es
importante determinar si el gen ChR2 puede restaurar la visin funcional
cuando se transfirieron clulas ganglionares de la retina.
Por lo tanto, el propsito de este estudio fue determinar si la transduccin del
gen ChR2 en las clulas ganglionares de la retina de ratas ciegas RCS puede
restaurar la visin funcional. Utilizamos respuestas visualmente evocadas y
respuestas optomotoras para evaluar la condicin funcional del sistema visual.
Encontramos que la transferencia de ChR2 mediada por AAV2 puede conducir a
la recuperacin no slo de respuestas electrofisiolgicas sino tambin
optocinticas.
2. Materiales y mtodos
Los procedimientos utilizados en los animales en estos experimentos estaban
de acuerdo con la declaracin de ARVO para el uso de animales en la
investigacin oftlmica y de la visin y las pautas para los experimentos
animales de la universidad de Tohoku.
2.1. Animales experimentales
Los experimentos se realizaron en ratas macho de 6 meses de edad, RCS; 18
distrficos (rdy / rdy) y 4 no distrficos ( / ). Las ratas se obtuvieron de CLEA
Japan, Inc. (Tokio, Japn).
2.2. Construccin de vectores
La construccin del vector que expresa ChR2 y la preparacin del vector para
inyeccin se han descrito en detalle (Sugano et al., 2005, Tomita et al., 2007).
En resumen, se fusion el fragmento N-terminal (residuos 1-315, nmero de
acceso GenBank AF461397) del gen ChR2 a una protena fluorescente, Venus,
en marco al final del fragmento codificante de ChR2. Entonces ChR2-Venus
(ChR2V) se introdujo en los sitios EcoRI y Hind III del plsmido 6P1 (Kugler et
al., 2003). El promotor de sinapsina se cambi por un promotor hbrido de
CMV / promotor de b-actina de pollo (CAG) (Niwa et al., 1991). El vector AAV2 -
ChR2V se purific mediante un mtodo de purificacin en columna de etapa
nica de Auricchio et al. (Auricchio et al., 2001, Sugano et al., 2005).
2.3. Inyeccin del vector AAV
Se ha descrito en detalle el mtodo utilizado para inyectar el vector AAV-
ChR2V en el vtreo de ambos ojos de ratas RCS (rdy / rdy) de 6 meses de edad
(Tomita et al., 1999, 2007). En resumen, las ratas se anestesiaron mediante
una inyeccin intramuscular de una mezcla de cetamina (66 mg / ml) y xilazina
(33 mg / kg). Bajo un microscopio de operacin, se realiz una pequea incisin
en la conjuntiva para exponer la esclertica y se inyectaron 5 ml de una
suspensin de vectores virales a una concentracin de 1 e 10 1012 partculas
genmicas / ml en el centro de la cavidad vtrea a travs de la ora serrata con
Una aguja de calibre 32 en una jeringa Hamilton de 10 ml (Hamilton Company,
Reno, NV).
2.4. Grabacin de potenciales evocados visualmente (VEP)
Los VEP se registraron antes y una semana despus de la inyeccin del vector
AAV-ChR2V con un sistema Neuropack (MEB-9102; Nihon Kohden, Tokio, Japn)
como se describe en detalle (Tomita et al., 2007). El mtodo de registro se
deriv de una combinacin de los protocolos utilizados por Papathanasiou et al.
(2006) e Iwamura et al. (2003). Brevemente, al menos siete das antes de las
grabaciones, los electrodos de cloruro de plata plateado se implantaron
epiduralmente 7 mm detrs del bregma y 3 mm lateralmente a la lnea media
de ambos hemisferios. Se implant epiduralmente un electrodo de referencia
en la lnea media 12 mm posterior al bregma. Bajo la anestesia de
ketaminaexilazina, el ojo se estimul con estmulos fticos de 0,5 ms de
duracin de 20 ms. Los estmulos fticos se generaron por activacin por
impulsos de un diodo emisor de luz azul (LED) con longitudes de onda emisoras
de luz de 435e500 nm (pico a 470 nm). Se utiliz un LED blanco para
determinar la respuesta espectral (los LED blancos incluyen todas las
longitudes de onda). Los filtros de paso de banda alto y bajo del amplificador se
ajustaron a 50 kHz y 0,05 kHz, respectivamente. Se promediaron 100
respuestas consecutivas para cada VEP. Tambin se investigaron los cambios
de las respuestas VEP suscitadas por un tren de frecuencias de estmulo de
1e50 Hz con una duracin de pulso de 10 ms. La intensidad de la luz de
estmulo se midi mediante un medidor de potencia lser (Lasercheck,
Edomond Optics, Japn).
2.5. Respuesta espectral del ojo despus de la transduccin de ChR2V
Para investigar la responsividad espectral de las retinas transducidas con
ChR2V, VEPs fueron provocados por diferentes estmulos de longitud de onda
de 1 mW / cm2. Las longitudes de onda se aislaron mediante filtros de paso de
banda (FUJIFILM Japn, Tokio, Japn, Fig. 1A).
2.6. Evaluaciones del comportamiento
Las evaluaciones de comportamiento se realizaron en un instrumento de
seguimiento de la cabeza (Hayashi Seisakusyo, Kyoto, Japn). El instrumento
consista en un tambor circular que giraba alrededor del animal (Cowey y
Franzini, 1979, Haruta et al., 2004, Lund et al., 2001). Cubrimos el tambor
rotatorio circular con un filtro azul transparente (filtro de color ultra # 67,
Toshiba, Japn, el filtro transmite las longitudes de onda <560 nm) debido a la
absorcin espectral de ChR2. Las franjas azules y negras verticales subtendan
un ngulo de 10 , y la velocidad de rotacin se cambiaba de 0 a 0,5, 2, 4 y 8
rpm. La frecuencia espacial corresponde a 0,05 ciclo / grado, pero la frecuencia
espacial del estmulo cambiar ligeramente con la posicin de la cabeza de la
rata porque el animal puede moverse libremente sobre la plataforma.
Los movimientos de cabeza de los animales fueron registrados por una cmara
de video montada sobre el aparato. Todos los movimientos se registraron a una
velocidad de 29,95 cuadros / s. El nmero de movimientos se analiz con
software sensible al movimiento (Move-tr / 2D ver.7.0, Library, Tokyo). Hicimos
tres marcas; En la nariz, el cuello y la cintura de la rata en el software. Los
puntos marcados fueron seleccionados en el rea que tena un contraste de
color distinto para que sea fcil rastrearlos automticamente. El software
produjo el ngulo de los tres puntos marcados. Todos los movimientos
angulares> 5 se consideraron movimientos de seguimiento si la direccin
corresponda al movimiento del estmulo giratorio. No se contaron grandes
movimientos con movimientos del cuerpo del animal. Se rest el nmero de
movimientos a 0 rpm de cada velocidad de rotacin.
2.7. Etiquetado retrgrado de clulas ganglionares de la retina (RGCs) con
fluorogold
Para identificar los RGC en la capa de clulas ganglionares (GCL), los RGC se
marcaron retrogradablemente siete das antes de sacrificar las ratas. El
etiquetado se realiz inyectando 4 ml de fluorogrel acuoso al 2% (FG,
Fluorochrome, Englewood, CO, Brecha y Weigmann, 1994) que contena
dimetilsulfxido al 1% en el colculo superior con una aguja de 32 G en una
jeringa de Hamilton.
2.8. ChR2V expresin en la retina
Seis semanas despus de la inyeccin de AAV-ChR2V, se sacrificaron las ratas
(n ) y se retiraron los ojos y se fijaron en paraformaldehdo al 4% en tampn
fosfato 0,1 M. Las retinas ipsolaterales fueron aisladas y montadas en placas de
microscopio. El fluorogold marcado y ChR2-expresando las clulas se contaron
en 12 reas distintas de la retina (tres reas en cada cuadrante a partir de 1
mm del nervio ptico) para evaluar la eficiencia de transduccin. Dos de los
ojos contralaterales fueron incrustados en compuesto OCT (Sakura, Tokio,
Japn) despus de la inmersin en solucin de sacarosa al 30% en PBS. Se
cortaron secciones retinianas de 15 micrmetros y se montaron en
portaobjetos. Las lminas de monturas y secciones enteras retinianas se
cubrieron con medio Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). La
fluorescencia de Venus se examin con un microscopio de fluorescencia,
Axiovert40 (Carl Zeiss).
2.9. Estudios histolgicos de la retina
Otros dos de los ojos se utilizaron para las secciones embebidas en parafina
para examinar los cambios histolgicos inducidos por la expresin de ChR2. Los
anlisis de las morfologas retinianas en ChR2V / y ChR2V / ratas se realizaron
como se describe Li et al. (2007). En resumen, las ratas fueron sacrificadas por
asfixia con dixido de carbono despus de la induccin de la degeneracin de
los fotorreceptores. Los ojos estaban enucleados, fijos e incrustados en
parafina. Se cortaron secciones gruesas de tres micrmetros de retinas a lo
largo del meridiano vertical y se tieron con hematoxilina y eosina para
permitir el examen de la retina en los hemisferios superior e inferior (LaVail et
al., 1992).
2.10. Anlisis estadstico
Los anlisis estadsticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism
(GraphPad Software, San Diego, CA). El criterio de significacin estadstica fue
P <0,05.
La luminosidad en el centro de la cmara de retencin se fij en 500 (1 mW /
cm2), 300 (0,55 mW / cm2) y 100 lux (0,19 mW / cm2). Las ratas distrficas y
RCS de control se ensayaron durante 4 min a cada velocidad antes y despus
de la transferencia del gen ChR2.
3. Resultados
3.1. Respuesta espectral de retinas que expresan ChR2V
Para investigar la respuesta espectral de retinas que expresan ChR2V, se
obtuvieron potenciales evocados visualmente mediante luz filtrada a travs de
seis filtros de paso de banda que aislaron diferentes partes del espectro (Figura
1A). Las formas de onda tpicas provocadas por la luz filtrada a travs del filtro
BP-450 nm en ratas con o sin ChR2V se muestran en la Fig. 1B. Se registraron
VEP de gran amplitud a partir de ratas RCS no distrficas de 6 meses de edad,
pero no se obtuvo respuesta de ratas ECS distrficas de 6 meses sin tratar (Fig.
1B). Sin embargo, seis semanas despus de la inyeccin de AAV-ChR2V, se
registraron VEP grandes (123,0 13,5 mV) cuando se estimul el ojo con una
intensidad de estmulo de 3500 lux (Figura 1B). La mayor amplitud fue
obtenida por la longitud de onda de 450 nm (Fig. 1C), y VEPs fueron evocados
por los estmulos cuyas longitudes de onda fueron 550 nm.
3.2. Los cambios en la amplitud de VEP en diferentes momentos despus de la
inyeccin de AAV2-ChR2V
Los VEP en ratas RCS inyectadas con AAV2-ChR2V se detectaron primero dos
semanas despus de la inyeccin (Figura 2A). Posteriormente, la amplitud
aument progresivamente hasta cinco semanas despus de la inyeccin
cuando la amplitud media era de 118,4 mV (figura 2A). En ratas RCS distrficas
de la misma edad, no se detectaron VEP con los mismos estmulos (nivel de
ruido 5 mV). Con el aumento de las intensidades de estmulo, las amplitudes de
los VEP aument y las latencias de P1 disminuy (Figura 2B]. Curiosamente, las
latencias de P1 en las ratas RCS transducidas con ChR2 (24,68 2,78 ms)
fueron ms cortas que las de las ratas RCS no distrficas (49,43 1,21 ms, P
<0,0001, prueba t no pareada, Fig. 2C).
3.3. Cambios en las respuestas de VEPs por diferentes frecuencias de
estimulacin lumnica
Los VEP obtenidos por diferentes frecuencias de estimulacin lumnica se
registraron de ratas de tipo salvaje y distrficas transducidas con el gen ChR2V.
Se registraron VEP de ambos tipos de ratas cuando las frecuencias de estmulo
eran 40 Hz y 50 Hz. Las respuestas de ambas ratas fueron bien ajustadas por la
curva de ajuste de Boltzmann (Fig. 3B). Las amplitudes de los VEP en ratas con
ChR2V no se vieron afectadas por un intervalo de 200 ms de un tren de
estmulos de luz (Fig. 3C). Estos resultados indicaron que la capacidad de
respuesta a la luz permitida por la transduccin de CR2V es similar a las ratas
de tipo salvaje.
3.4. Evaluacin conductual por respuestas optomotoras
Para determinar si la transduccin del gen ChR2 restaur la visin funcional, se
registraron respuestas optomotoras a partir de las ratas RCS no distrficas (Fig.
4A), distrficas (Figura 4B) y transducidas con ChR2 (Figura 4C). Los
experimentos preliminares mostraron que cuando el ngulo del cuello se mova
sobre 5, los movimientos estaban bien correlacionados con la velocidad de
rotacin en las ratas RCS ( / ) no distrficas (Fig. 4D). El puntaje en ratas
distrficas sin inyectar de 30 semanas a 2 rpm fue de 3,00 3,64, mientras que
en ratas de 30 semanas seis semanas despus de la inyeccin fue
significativamente mayor 13,31 5,82 ( P <0,0006, Fig. 4E). Aunque las ratas no
distrficas ( / ) respondieron a la rotacin incluso a velocidades de 2 rpm a
300 lux ya 4 rpm a 100 lux (figura 4F), las ratas con el gen de ChR2V
transducido no respondieron a la luz inferior Intensidades (Fig. 4G).
3.5. ChR2V expresin en la retina
El examen histolgico de monturas planas de la retina mostr que las clulas
sobre una amplia rea de la retina haban sido marcadas retrogradualmente
con Fluorogold (Figura 5A). Estas clulas se consideraron RGC (Figura 5B).
Fusionado imgenes mostraron que la expresin de ChR2V fue principalmente
en el RGCs (Fig. 5C]. Cuando se inyect el vector AAV-Venus, se observ
fluorescencia de Venus en los RGC, pero la protena de Venus se localiz en el
cuerpo celular, que era completamente diferente de los inyectados con AAV-
ChR2V (figura 5D). Las criosecciones mostraron que las clulas marcadas se
observaron en la capa de clulas ganglionares (Figura 5E y F) y algunas de
ellas estaban en la capa nuclear interna (Figura 5F). No se observaron clulas
fotorreceptoras en las retinas de las ratas RCS (Fig. 5G). El nmero de clulas
marcadas con fluorogold, que son ms probable clulas de ganglio de la retina,
fue 2531,8 214,8. El nmero de clulas marcadas doble fue 710,6 117,7. As, el
rendimiento de transduccin fue de aproximadamente 28,3% (Figura 5H). Las
secciones de parafina tampoco mostraron diferencias en el grosor de la capa
fotorreceptora entre las retinas inyectadas y no inyectadas con AAVChR2 (Fig.
5I y J).
4. Discusin
Nuestros resultados demostraron que los VEP pueden ser registrados a partir
de ratas RCS genticamente ciegas que expresaron el gen ChR2, y la respuesta
mxima fue provocada por estmulos con un pico de longitud de onda a 450
nm. Esto coincide con un informe anterior de que la absorcin espectral
mxima de ChR2 es aproximadamente de 460 nm (Nagel et al., 2003).
Adems, se obtuvieron VEP por estmulos hasta 550 nm, mientras que las ratas
RCS no distrficas respondieron a longitudes de onda superiores a 600 nm.
Esta habilidad de las ratas normales para responder a las longitudes de onda
ms largas es probablemente debido a que tienen dos fotopigmentos de cono
con absorbancias de pico a 359 nm (Nee y Jacobs, 1986), a 359 nm (Deegan y
Jacobs, 1993; Yokoyama y col., 1998) ya 510 nm. Por lo tanto, el espectro de
respuesta espectral de las ratas transducidas con el gen ChR2 es algo ms
estrecho que el de las ratas no distrficas, y esto se debe a la presencia de slo
canalrhodopsina-2 en la retina. VEPs distintivos se registraron por primera vez
a las dos semanas despus de la inyeccin. Las amplitudes de los VEP de ratas
distrficas RCS que portaban el gen ChR2 en sus RGC aumentaron
gradualmente hasta seis semanas despus de la inyeccin. Curiosamente, los
tiempos implcitos (IT) de los VEP fueron ms cortos que los de las ratas no
distrficas. La causa de las IT ms cortas fue ms probable porque las seales
neurales fueron transducidas en los RGC, y las seales no tienen que pasar a
travs de la red interna de la retina. Estos resultados sugieren que las clulas
ganglionares de la retina se convirtieron en fotosensibles por la expresin del
gen ChR2, y las seales generadas en las clulas ganglionares se transmitieron
a la corteza visual de los RGCs.
Se compar la respuesta a diferentes frecuencias de estimulacin de la luz
entre no distrfica RCS ratas y ChR2V inyectado ratas. La rata RCS con el gen
ChR2 respondi hasta 20 Hz, que era la misma que la de la rata RCS no
distrfica. Jehle et al. (2008) inform de que el estado de equilibrio VEPs podra
provocado por una frecuencia de estmulo de 38 Hz y amplitudes distintas se
observaron a 19 Hz. La responsividad fue ligeramente superior a nuestros
resultados (20 Hz). La amplitud mxima evocada a partir de ratas RCS con
ChR2 era aproximadamente el 50% de la de ratas RCS no distrficas a 1 Hz. La
menor amplitud de ratas con ChR2V probablemente se debi a la eficiencia de
transduccin de genes en el ganglio de la retina, que fue de alrededor del 30%
de las clulas ganglionares de la retina en este estudio. Anteriormente se
inform de que la eficiencia de transduccin de ratas RCS de 10 meses de edad
fue de alrededor del 30% (Tomita et al., 2007). La eficiencia de transduccin en
las ratas de 6 meses de edad que utilizamos en este estudio fue
aproximadamente la misma. El AAV que utilizamos en este estudio requiere la
sntesis de la clula husped de la cadena complementaria para la
transduccin. El fracaso de someterse a la sntesis de segunda cadena viral
conduce a una menor eficiencia de la expresin del transgn (Ferrari et al.,
1996, Fisher et al., 1996). El uso de vectores auto-complementarios de AAV
(scAAV) que no requieren sntesis de la cadena complementaria para la
expresin de transgenes puede eludir este problema. Por lo tanto, este mtodo
tiene la posibilidad de ser ms eficiente y actuar ms rpidamente (Andino et
al., 2007, Jayandharan et al., 2008, McCarty et al., 2001).
Para determinar las capacidades visuales funcionales de las ratas RCS
transducidas con ChR2, se investigaron sus respuestas optomotoras (Haruta et
al., 2004; Lund et al., 2001). La a-onda del ERG es un indicador de la funcin
del fotorreceptor, y desaparece en 80e100 das en ratas RCS distrficas (Bush
et al., 1995; Sauve et al., 2004). Sin embargo, la actividad de las clulas de un
solo ganglio podra registrarse desde el tracto ptico de las ratas RCS incluso
despus de que el electrorretinograma (ERG) no pudiera ser registrado
(Cicerone et al., 1979). Las evaluaciones de su sensibilidad visual, determinada
por potenciales elctricos registrados en el colculo superior, indicaron que la
sensibilidad disminuy progresivamente para alcanzar una meseta a 180e 240
das (Sauve et al., 2001). Por lo tanto, elegimos Ratas RCS de 8 meses de edad
(2 meses despus de la inyeccin de AAVChR2V) para las evaluaciones de
comportamiento. Las puntuaciones de comportamiento de las ratas RCS
transducidas con ChR2 fueron significativamente mayores que las de ratas no
tratadas. Tambin se encontr que las puntuaciones de las ratas RCS
transducidas con ChR2 se vieron afectadas por la intensidad de luz en el
tambor (figura 4F).
Lagali et al. (2008) inform de que las clulas ON-bipolar que fueron diseados
para ser fotosensible por la transduccin del gen ChR2 restaurado funcin
visual a los ojos con degeneracin de la retina. Las clulas bipolares ON y OFF
reciben entrada sinptica de los fotorreceptores. Las clulas ON-bipolares son
una de las clulas candidatas para la recepcin del gen ChR2 porque ChR2
puede provocar respuestas de luz. Sin embargo, se han publicado algunos
informes de que la remodelacin de la retina se desencadena en clulas
bipolares y clulas horizontales despus de la degeneracin de los
fotorreceptores (Strettoi y Pignatelli, 2000, Strettoi et al., 2002, 2003). Por lo
tanto, la funcin de las capas internas de la retina, incluyendo la va ON-
bipolar, podra tener algunas diferencias con respecto a la de los ojos normales.
Encontramos que las respuestas conductuales no podran ser provocadas por
intensidades de estmulo <300 lux, aunque las ratas podran responder a 500
lux. Las intensidades de 500 y 300 lux corresponden a aproximadamente 2,25
1015 y 1,24 1015 fotones / cm2, respectivamente. Se esperaba que la
intensidad de luz crtica que provocaba respuestas de comportamiento en ratas
con ChR2 transducidas en sus RGC fuera de 2,25 1015 fotones / cm ^ {2} s,
que estaba cerca del nivel de luz (3 1015 fotones / cm2 s) (Lagali et al., 2008)
Reportados en los experimentos de comportamiento realizados en ratones con
ChR2 transducidos en sus clulas ON-bipolares.
Nuestros hallazgos de que ChR2 transduced-ganglio clulas podran restablecer
la funcin visual tanto electrofisiolgicamente y el comportamiento
demuestran que las clulas ganglionares tambin deben ser considerados
como candidatos prometedores clulas para restaurar la visin a travs de la
transferencia del gen ChR2.