UNIVERSIDAD AUTNOMA DE

YUCATN
FACULTAD DE INGENIERA
QUMICA

Prctica 5
Sacarificacin de celulosa para la
produccin de biocombustibles:
Determinacin de la actividad de
celobiohidrolasas en hongos.

Integrantes:
Angel, K., Martnez, N., Palacios, J., Ullate, R., Yah, G.

Profesores:
Dr. Santiago Gallegos Tintor
Dra. Mnica Snchez

.
INTRODUCCIN

La celulosa es el compuesto orgnico ms abundante en la Naturaleza. Su

potencial energtico ha sido aprovechado desde tiempos remotos por
numerosos organismos; mas recientemente ha atrado la atencin de los
biotecnlogos, que estudian los medios para utilizarla como fuente de
combustibles y otros productos qumicos de inters industrial (Macarron, R.,
1992).

La celulosa forma parte de las paredes de las clulas vegetales en ntima

asociacin con lignina y hemicelulosas, constituyendo en conjunto la
denominada lignocelulosa. La proporcin de estos polmeros vara segn el
origen del residuo lignocelulsico considerado. La celulosa est formada por
cadenas lineales de D-glucosa unidas por enlaces glucosidicos (14)
(Macarron, R., 1992).

La hidrlisis enzimtica de la celulosa ha sido investigada intensamente en los

ltimos aos. Hasta el momento no se ha instalado ninguna planta industrial
para hidrolizar celulosa por va enzimtica; no obstante, existen plantas piloto
en Japn (Fan et al., 1987) y Francia (Pourqui et al., 1988), y la tecnologa
desarrollada est muy cercana al umbral de viabilidad comercial.

La sacarificacin de residuos lignocelulsicos por va enzimtica requiere un

pretratamiento para aumentar la susceptibilidad de los mismos a la hidrlisis.
Sin un pretratamiento adecuado, la biodegradacin de la lignocelulosa es lenta
y con un bajo rendimiento en azcares fermentables (Dale, 1987).

El producto de la hidrlisis, la D-glucosa, tiene mltiples posibilidades de uso:

Refinada, puede destinarse a la industria alimentaria.

Se puede transformar por isomerizacin en fructosa, que es un potente
edulcorante.
Puede ser sustrato para procesos fernientativos que rinden:
etanol
biomasa microbiana
biopolmeros
productos qumicos y frmacos tales como antibiticos, L-
aminocidos, cido ctrico, acetona, butanol, etc.
La celulasa es una enzima compleja especializada en descomponer celulosa,
transformndola en mltiples monmeros de glucosa. Las enzimas celulasas
son producidas por una variedad de bacterias y hongos aerbicos o
anaerbicos, mesfilos o termfilos. Sin embargo, slo algunos de ellos
producen enzima celulasa extracelular capaz de hidrolizar la celulosa
(Ljungdahl & Eriksson 1985; Marsden & Gray 1986; Bhat & Bhat 1997;
Dongowski et al. 2002).

Las celulasas de origen fngico se han agrupado tradicionalmente en tres

categoras: celobiohidrolasas (CBH; exoglucanasas; EC 3.2.1.91), que atacan
las molculas de celulosa por su extremo no reductor, liberando
secuencialmente subunidades de celobiosa; endoglucanasas (EG; EC 3.2.1.4),
que rompen al azar enlaces internos de las molculas de celulosa; -
glucosidasas (EC 3.2.1.21), que hidrolizan celobiosa y celodextrinas de bajo
peso molecular. En sentido estricto slo las EGs y CBHs se consideran
celulasas; las -glucosidasas participan indirectamente en la degradacin de
celulosa al hidrolizar celobiosa que inhibe a las CBHs (Macarron, R., 1992)..

Avanzar en el conocimiento de las celulasas, de su biosntesis, propiedades y

mecanismo de accin, seleccionar buenos productores y buenas tcnicas de
produccin, ha abaratado esta biotecnologa hasta hacerla casi competitiva con
otras tecnologas empleadas en la produccin de azcares (fundamentalmente
la hidrlisis de almidones).

OBJETIVO

Medir actividad celobiohidrolasa presente en extractos de hongos

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

Materiales y equipo Reactivos

12 celdas plsticas de 1.5 ml 1g de Hongo fresco
6 tubo cnico de 15 mL p-nitrofenil glucopiranosido 1.5
2 tubos eppendorff de 1.5 mL mM
Hielo Stop solution 2X o en su lugar
Balanza analtica NaOH 100 mM
Micropipetas automticas 200 y p-Nitrofenol 1 mM
1000L Buffer de resuspensin 10X
Centrfuga Buffer de extraccin
Espectrofotmetro

PROCEDIMIENTO
Preparacin de muestras

1. Se pes 1 g del hongo a analizar y coloc la muestra pesada en el mortero

2. Se agregaron 2 mL del buffer de extraccin fro a la muestra

3. Se macer hasta obtener una pasta homognea

4. Se dividi la muestra en dos tubos eppendorff colocando 1ml en cada tubo

5. Se centrifug a 10,000 rpm por 5 min a 4C

Preparacin de la solucin para detener la reaccin

6. Se tomaron 6 celdas plsticas de 1.5 ml y a cada una se le adicion 500 l

de stop solution 1X o NaOH 100 mM

Preparacin de la mezcla de reaccin enzimtica

7. A un tubo Falcon de 15 mL se aadi lo siguiente:

3 ml de sustrato (p nitrofenil glucopiranosido 1.5mM)

250 L de extracto del hongo

Inmediatamente se agit y se comenz la cuenta en el cronmetro

8. Se tomaron 500 L de la mezcla de reaccin en cada uno de los tiempos

indicados en la Tabla 1 y se vaciaron en las celdas correspondientes. Se
midieron las absorbancias a 410 nm.

Tabla 1. Tiempos en minutos para la medicin de absorbancias de las muestras

Celda espectrofotomtrica Tiempo (min)

1 1
2 2
3 4
4 6
5 8

Curva estndar

a. Dilucin de estndares

Se prepar la solucin D aadiendo 400 l de la solucin C y 600 l de agua un

tubo eppendorff, seguidamente se realiz la dilucin de los estndares de
acuerdo a la Tabla 2.
Tabla 2. Diluciones para la preparacin de la curva estndar

Tubo Volumen (mL) Volumen agua

(mL)
E1 1 solucin D 1 Agitar
E2 1 solucin E1 1
E3 1 solucin E2 1
E4 1 solucin E3 1
E5 1 solucin E4 1

b. Curva estndar

Se marcaron 6 tubos eppendorff y se realiz la curva estndar de acuerdo a las

cantidades sealadas en la Tabla 3. Se midieron las absorbancias a 410 nm.

Tabla 3. Cantidades de reactivos para las mediciones de absorbancias de la curva

estndar

Tubo nmol p- L L Stop L agua

nitrofenol (solucin) solution 1X
o NaOH
100 mM
1 0 0 500 500
2 6.25 500 500 0
3 12.5 500 500 0
4 25 500 500 0
5 50 500 500 0
6 100 500 500 0

REFERENCIAS

Macarron, R. (1992). PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE ENDOGLUCANASA

III DE Trichodenna reesei QM9414. pp. 2-7.

Dale, E. E. (1987) Lignocellulose conversion and the future of fermentation

biotechnology Trrnds Biorechnol. pp. 287-291

Pourqui et al. (1988). Scale up of cellulose production and utilization en

Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation. pp. 71-86

Ovando, S. & Waliszewski,N. (2005). PREPARATIVOS DE CELULASAS

COMERCIALES Y APLICACIONES EN PROCESOS EXTRACTIVOS. pp. 111-113

Marsden, W., Gray, P. (1986) Enzymatic hydrolysis of cellulose in lignocellulosic

materials. CRC Critical Reviews in Biotechnology. pp. 235-274.
Ljungdahl, L., Eriksson, K. (1985) Ecology of microbial cellulose degradation.
Advances in Microbiology and Ecology. pp. 237-299.

Bhat, M., Bhat, S. (1997) Cellulose degrading enzymes and their potential
industrial applications. Biotechnology Advances. 15: 583-601.