POSGRADO INGENIERIA SANITARIA Y AMBIENTAL

CURSO MICROBIOLOGIA. GUA DE LABORATORIO 1.

UBICUIDAD MICROBIANA

Los microorganismos en el ambiente son diversos y ubicuos, los

microorganismos del ambiente se diferencian marcadamente de aquellos que se
encuentran contenidos o almacenados en laboratorios o de los aislamientos
clnicos, debido a que se han adaptado a condiciones ambientales difciles y
fluctuantes. Es posible determinar su presencia empleando tcnicas
microbiolgicas en medios de cultivo que brinden informacin de la diversidad
presente y de su cantidad.

Materiales
Medios de cultivo slidos para el crecimiento de bacterias y mohos
Incubadoras
Hisopos estriles
Portaobjetos
Colorantes de Gram
Microscopios
Mechero
Asas

Procedimiento
1. Identifique cada uno de los elementos que le son suministrados en la
prctica
2. Rotule con el nmero de grupo de laboratorio los materiales con cinta o
marcador permanente
3. Para evaluar la presencia de microorganismos en el ambiente: Seleccione
una locacin y deje expuestas las cajas que contienen los medios de
cultivo por 5 minutos, tape las cajas y retrnelas al laboratorio
4. Incube las cajas de bacterias a 35 C / 18-24 horas y las de mohos a
temperatura ambiente ~25C /3-5 dias
5. Para evaluar la presencia de microorganismos en superficies: seleccione
una superficie de inters (mesn, dedo, bolgrafo, silla, etc), abra la placa
de contacto RODAC y permita el contacto con la superficie por al menos
10 segundos. Retire la placa, tpela y proceda como en el numeral 4.
6. Otra manera de recuperar microorganismos de superficies es realizando
un raspado con un elemento estril, para ello destape el hisopo estril y
frote la superficie de inters, lleve dentro de su cubierta el hisopo al
laboratorio y haga un extendido sobre la superficie de un medio de cultivo.
Incube como en el numeral 4.
7. Selecciones una colonia de bacteriana y una colonia fngica, realice
coloracin de Gram a la primera y tincin con azul de lactofenol a la
segunda.

Resultados
1. Observe el crecimiento en cada uno de los medios de cultivo, tome una
fotografa de cada detector (caja petri)
2. Estima la cantidad de microorganismos presentes en cada detector
3. Comparta la informacin con los dems grupos de laboratorio
especificando la fuente o el lugar donde se tomaron o expusieron los
detectores
4. Establezca si se presentan diferencias en el crecimiento entre los medios y
entre los diferentes puntos de muestreo argumentando las diferencias.

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METABOLISMO BACTERIANO1

Los microorganismos al igual que todo ser vivo necesita de nutrientes para un
buen desarrollo. Si se combinan las fuentes de crecimiento e inhibidores
adecuados y se proporcionan las condiciones favorables se puede lograr la
separacin de grupos de microorganismos lo que facilitara su estudio posterior.
Se conocen diferentes mtodos para el cultivo de microorganismos, pero sin
lugar a dudas uno de los factores ms importantes para realizar en forma
correcta cualquier mtodo de cultivo, aislamiento, recuento e identificacin
bioqumica son los mtodos de esterilizacin y tcnicas de asepsia que son
utilizadas en el laboratorio, si estas fallan se puede correr el riesgo de
contaminacin y por consiguiente de falsos positivos en los resultados finales.

Despus de cultivar el microorganismo en estudio, para su identificacin ms

exacta se recurre a las pruebas bioqumicas para determinar el metabolismo
general de dicho espcimen y de esta manera llegar a una caracterizacin
primaria o secundaria. El metabolismo microbiano lo podemos definir como el
conjunto de reacciones bioqumicas que pueden llevar a cabo los organismos
para obtener energa que ms adelante podr usarse en otros procesos. Las
diferencias en la forma como procesan los nutrientes y los desechos que
producen y liberan los microorganismos son el resultado de las enzimas que
poseen y pueden ser utilizadas para su clasificacin. Estas enzimas participan en
procesos de fermentacin y oxidacin de azcares y de otros compuestos
orgnicos, liberando metabolitos caractersticos para identificar cada grupo
taxonmico.

El metabolismo bacteriano se define como el conjunto de actividades qumicas

de la clula las cuales se puede dividir en dos: la produccin de energa y la
utilizacin de energa. La diferencia en la forma como procesan los nutrientes
y los desechos que producen y liberan los microorganismos es el resultado de las
enzimas que poseen y pueden ser utilizadas para su clasificacin. Estas enzimas
participan en los procesos de fermentacin y oxidacin de azcares y de otros
compuestos orgnicos, liberando metabolitos caractersticos para identificar
cada grupo taxonmico. La mayor parte de bacterias obtienen energa a travs
de reacciones qumicas, siendo ms comunes las de oxidacin reduccin ya
sea en forma anaerbica o aerbica. Algunas bacterias obtienen energa de la luz
(fotosintticas), sin embargo, la energa lumnica debe convertirse en energa
qumica para ser utilizada por la clula.

Produccin de energa en forma aerbica: La clula utiliza una serie

de reacciones para el transporte de electrones. Esta serie de reacciones
son llamadas cadena respiratoria o sistema del citocromo. Su funcin es
aceptar electrones de compuestos reducidos y transferirlos al oxgeno que
es el ltimo aceptor, para formar agua, y de ah que se llame aerbica.
Liberando energa suficiente para sintetizar ATP como fuente de electrones
las bacterias pueden utilizar carbohidratos, lpidos y protenas. Otras
pueden utilizar compuestos orgnicos e inorgnicos. Algunas pueden
utilizar CO2 (quimioauttrofas).

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Produccin de energa en forma anaerbica: se habla de respiracin

anaerbica cuando el aceptor final de electrones es una molcula
inorgnica diferente del oxgeno o de fermentacin cuando los electrones
son aceptados por un compuesto orgnico. El ATP formado por las
reacciones productoras de energa se gasta por diversas vas. Parte de ella
se utiliza en la sntesis de nuevos componentes para las clulas nuevas,
manteniendo la integridad fsica y qumica de la misma clula, en el
transporte de solutos a travs de la membrana, en la locomocin, y en la
produccin de calor.

Para la caracterizacin bioqumica de los cultivos microbianos se disponen de

numerosas tcnicas de laboratorio. Se cultivan los microorganismos en presencia
de diferentes sustancias nutritivas especficas o sustratos a los que
generalmente se les aaden indicadores, los cuales reaccionan con algn
producto de la reaccin enzimtico produciendo un cambio de color en el medio
y qu es lo que generalmente vamos a observar. Los indicadores pueden
aadirse al medio desde antes de efectuarse la reaccin, es decir antes de que el
microorganismo a estudiar sea sembrado en el medio despus de que el
microorganismo se halla desarrollado en el medio.

Pruebas bioqumicas de desdoblamiento bacteriano de azcares: Se

puede determinar la capacidad de un microorganismo para atacar y desdoblar
diferentes azcares empleando un medio nutritivo adecuado que contenga el
carbohidrato y un indicador.

Pruebas bioqumicas de desdoblamiento o uso de carbohidratos:

Para estas pruebas se emplean medios lquidos contenidos en tubos de
ensayo que incorporan un indicador de rojo de fenol con cada uno de los
diferentes azcares a examinar. Cada tubo debe contener un tubo de
Durham invertido en el que se acumula el gas que se produce a partir de
la fermentacin del carbohidrato. La prueba se incuba a 35C +/2 C por
24 48 horas y se interpreta la acidez y produccin de gas de la siguiente
forma: Cambio de color de rojo a amarillo indica la fermentacin del
azcar correspondiente. Desplazamiento del lquido por una burbuja en el
tubo de durham indica produccin de gas por el microorganismo.

Pruebas de fermentacin oxidacin de carbohidratos: El objetivo

de esta prueba es comprobar si un microorganismo fermenta y oxida al
tiempo un carbohidrato especfico. El medio empleado es el Hugh Leifson
(OF) con peptona en baja cantidad (0.2%) y glucosa (1%). La acidez
producida por metabolismo oxidativo es baja. A su vez, la mayora de las
bacterias producen sustancias alcalinas del uso aerobio de las peptonas.
A las concentraciones de peptona usadas habitualmente en los medios
(12%), no es posible observar la baja produccin de cido como parte del
metabolismo oxidativo de azcares ya que es neutralizado por el uso
aerobio de las peptonas. La baja concentracin de peptona del medio HL
permite diferenciar los microorganismos oxidativos de los inactivos frente
a la glucosa. En ausencia de otros aceptores de electrones externos, la
oxidacin de carbohidratos es un proceso estrictamente aerobio, en tanto
que la fermentacin es un proceso anaerobio. Se usa un medio de cultivo
semislido, que evita posibles corrientes de convencin y
consiguientemente un mezclado del cido producido en la superficie con

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el resto del medio. Para esta prueba se separan dos tubos que contienen
medio HL por cada carbohidrato a examinar. A uno de los tubos que
conforma el duplicado del carbohidrato se le adiciona parafina estril
luego de inocularlos con el microorganismo deseado, se incuban a 35C
+/2C por 24 48 horas.

Pruebas bioqumicas para identificacin de enzimas: el objetivo de estas

pruebas es comprobar la presencia de enzimas en la clula microbiana. Ejemplo:
Hidrlisis de almidn: algunas bacterias producen enzimas capaces de desdoblar
las molculas complejas de polisacridos. Ests enzimas son extracelulares y
realizan la ruptura de los substratos por medio de la hidrlisis

Pruebas bioqumicas para la deteccin de metabolitos: Como el nombre lo

indica estas pruebas se usan para identificar la presencia de metabolitos
producidos por las bacterias durante su proceso vital. Por lo general, la deteccin
de esas sustancias se hacen adicionando reactivos para observar una reaccin
especfica luego que la muestra es incubada a diferencia de las pruebas
anteriores, que luego de la inoculacin determinan la actividad de una va
metablica por el cambio de color del medio.

MATERIALES
Cepas de bacterias gram negativas y gram positivas.
Medios de cultivo (en el laboratorio se identificar cada prueba bioqumica
a emplear)
Agares selectivos.
Gradilla
Mechero
Asas de incoulacin

PROCEDIMIENTO
1. A cada grupo se le dar una cepa problema la cual utilizarn para realizar
las reacciones bioqumicas que indique el instructor
2. Rotule adecuadamente su material de trabajo
3. Realice un registro fotogrfico incial
4. Realice la inoculacin (siembra) del microorganismos asignado de acuerdo
con las instrucciones del instructor y basndose en el siguiente esquema:

5. Lleve a incubacin de acuerdo a las instrucciones

6. Realice un registro fotogrfico las 4, 18 y 24 horas

RESULTADOS

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1. Comparta su registro fotogrfico con un grupo que tenga una cepa

diferente.
2. Establezca si se presentan o no diferencias en el crecimiento entre los
medios utilizados y entre los resultados del otro grupo
3. Se presentaron variaciones de los medios en el tiempo? Discuta al
respecto.
4. Argumente a qu se deben estas diferencias en el crecimiento desde una
perspectiva metablica.

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