CROMATOGRAFIA

La protena altamente purificada es esencial para el examen detallado de sus

propiedades fsicas y funcionales. Las clulas contienen miles de protenas
distintas, cada una en cantidades ampliamente variables. As, el aislamiento de
una protena especfica en cantidades suficientes para analizar sus propiedades
plantea un formidable desafo que puede requerir la aplicacin sucesiva de
mltiples tcnicas de purificacin. La precipitacin selectiva explota diferencias de
la solubilidad relativa de protenas individuales en funcin del pH (precipitacin
isoelctrica), la polaridad (precipitacin con etanol o con acetona), o la
concentracin de sal (separacin de sustancias disueltas al aadir sulfato de
amonio a la solucin). Las tcnicas cromatogrficas separan una protena de otra
con base en la diferencia de su tamao (cromatografa de exclusin de tamao), la
carga (cromatografa de intercambio inico), hidrofobicidad (cromatografa de
interaccin hidrofbica), o capacidad para unirse a un ligando especfico
(cromatografa de afinidad).
Cromatografa de columna

En la cromatografa de columna la matriz de fase estacionaria consta de cuentas

pequeas cargadas en un recipiente cilndrico de vidrio, plstico o acero llamado
una columna. Fritas permeables a lquido confinan las cuentas dentro de este
espacio mientras que permiten que el lquido de fase mvil fluya o se filtre a travs
de la columna. Por medio de procedimientos qumicos se pueden preparar
derivados de las cuentas de fase estacionaria para cubrir su superficie con los
grupos cido, bsico, hidrofbico o tipo ligando requeridos para cromatografa de
intercambio inico, de interaccin hidrofbica, o de afinidad. A medida que el
lquido de fase mvil sale de la columna, es recolectado de manera automtica en
una serie de porciones pequeas llamadas fracciones. En la figura 4-2 se describe
la disposicin bsica de un sistema de cromatografa sencillo para mesa de
trabajo.
Cromatografa lquida de alta presin (HPLc)

Para la cromatografa en columna de primera generacin las matrices constaban

de polmeros de oligosacrido entrelazados, largos, conformados hacia cuentas
esfricas de aproximadamente una dcima de milmetro de dimetro.
Desafortunadamente, su tamao relativamente grande perturbaba el flujo de fase
mvil y limitaba el rea de superficie disponible. La reduccin del tamao de las
partculas ofreci el potencial de aumentar mucho la resolucin. Sin embargo, la
resistencia creada por la matriz ms estrechamente empacada requiri el uso de
presiones muy altas que aplastaran las cuentas de polisacrido blandas y
esponjosas y materiales similares, por ejemplo, acrilamida. Finalmente, se crearon
mtodos para manufacturar partculas de silicn del tamao y la forma necesarios
para preparar derivados de su superficie con diversos grupos funcionales, y para
empacarlas en columnas de acero inoxidable capaces de soportar presiones de
varios miles de libras por pulgada (psi). Debido a su mayor poder de resolucin,
los sistemas de cromatografa lquida de alta presin han desplazado en su mayor
parte las columnas de vidrio alguna vez familiares en el laboratorio de purificacin
de protena.

Componentes de un aparato de cromatografia liquida tipico. R1 y R2:

reservorios de lquido de fase mvil. p: sistema de bombeo programable que
contiene dos bombas, 1 y 2, y una cmara de mezcla, M. El sistema puede
ajustarse para que bombee lquido desde slo un reservorio, para que cambie de
reservorios en un punto predeterminado a fin de generar un gradiente de paso, o
para que mezcle lquidos de los dos reservorios en proporciones que varan con
el tiempo para crear un gradiente continuo. c: columna de vidrio, metal o plstico
que contiene la fase estacionaria. F: colector de fraccin para recolectar
porciones, llamadas fracciones, de lquido de elucin en tubos de ensayo
separados.

Cromatografa de Exclusin de Tamao

En la cromatografa de exclusin de tamao (o filtracin en gel) se separan las

protenas con base en su radio de Stokes, el radio de la esfera que ocupan a
medida que entran en solucin.
El radio de Stokes es una funcin de la masa y la forma moleculares. Una protena
alargada que cae ocupa un mayor volumen que una protena esfrica de la misma
masa. En la cromatografa de exclusin de tamao se emplean cuentas porosas.
Los poros son anlogos a irregularidades en una ribera de ro. A medida que los
objetos se mueven torrente abajo, los que entran en una irregularidad se retrasan
hasta que regresan a la corriente principal. De modo similar, las protenas con
radios de Stokes demasiado grandes como para entrar en los poros (protenas
excluidas) permanecen en la fase mvil que est fluyendo y salen antes que las
que pueden entrar en los poros (protenas incluidas).
As, las protenas surgen a partir de una columna de filtracin en gel en orden
descendente de sus radios de Stokes.

Cromatografa de Intercambio Inico

En la cromatografa de intercambio inico, las protenas interactan con la fase
estacionaria mediante interacciones de carga-carga. Las protenas con una carga
positiva neta a un pH dado se adherirn estrechamente a cuentas con grupos
funcionales que tienen carga negativa, como carboxilatos o sulfatos
(intercambiadores catinicos). De modo similar, las protenas con una carga
negativa neta se adhieren a cuentas que tienen grupos funcionales con carga
positiva, tpicamente aminas terciarias o cuaternarias (intercambiadores
aninicos). Las protenas no adherentes fluyen a travs de la matriz y se eliminan
Principio
por medio de lavado. A continuacin, las protenas de lason
unidas cromatografa
desplazadasdede
intercambio inico.
manera selectiva al aumentar gradualmente la fuerza inica de la fase mvil, lo
que debilita interacciones entre una carga yLas otra. Haypartculas
elucin de protenas en
cargadas
orden inverso de la fuerza de sus interaccionesnegativamente
con la fase estacionaria.
se unen a la matriz
solida cargada positivamente, y son
retenidas.
Las partculas cargadas
positivamente son rechazadas por la
matriz solida cargada positivamente
y son eluidas.
La elucin de las partculas
cargadas negativamente se
consigue cambiando el pH del
solvente hasta igualando a su punto
isoelctrico o hasta invertir su carga
neta.
Bibliografa:
1. Murray R. BIOQUIMICA ILUSTRADA DE HARPER. 29 ed. Mxico :
Editorial Mc Graw Hill; 2013.