Pre Informe Biotecnologia - Original

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD
ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA

GUIA COMPONENTE PRCTICO DEL CURSO: 305689 BIOTENOLOGA
PRE INFORME
BIOTECNOLOGIA
TUTOR: FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES
ADRIANA ESPERANZA TRUJILLO MARTINEZ
GRUPO: 305689_7
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

UNAD
03/11/12
INTRODUCCION
El desarrollo de la biologa en las ltimas cuatro dcadas, ha hecho posible el

desarrollo de sofisticados, procedimientos para el aislamiento, manipulacin y
expresin de material gentico, lo que ha llevado consigo al avance de una
nueva disciplina: La Biotecnologa , la cual tiene aplicaciones tanto en la
investigacin bsica, como en la aplicada. Las tcnicas de esta ciencia se han
utilizado para estudiar los mecanismos de la replicacin y expresin gnicas en
procariotas, eucariotas y sus virus. Algunos de los ms importantes
descubrimientos bsicos de la gentica se han realizado utilizando tcnicas
ingenieriles. En cuanto a la investigacin aplicada, la Biotecnologa permite el
desarrollo de cultivos microbianos capaces de fabricar productos valiosos, tales
como la insulina humana, la hormona humana del crecimiento, interfern,
vacunas y enzimas industriales. La aplicacin industrial de la Biotecnologa,
parece tener un potencial ilimitado.
La Biotecnologa, se ha convertido en la herramienta para un nuevo desarrollo

social, basado en el conocimiento del funcionamiento de la vida y sus
posibilidades de manipularlo y transformarlo. Su impacto en la Medicina, la
agricultura, el mejoramiento de las especies, la evolucin, la industria alimenticia y
la farmacologa, dan muestra de la importancia que tiene esta disciplina, que se ha
convertido sin lugar a dudas en la base de la revolucin tecnolgica que ha
acaparado la atencin de los cientficos y gobiernos como posible estrategia para
encontrar soluciones a los problemas que aquejan a la humanidad.
Objetivos
Conocer algunos procedimientos empleados para la obtencin de producto

utilizando los fundamentos biotecnolgicos.
Identificar los procedimientos para la obtencin de un determinado

productos y su aplicacin industrial.
Relacionar los conceptos cientficos con los procedimientos tcnicos

utilizados en Biotecnologa.
PRACTICA No. 01 DETERMINACION DE LA CURVA DE CRECIMIENTO E

ORGANISMOS UNICELULARES
OBJETIVO
Ejercitar de la determinacin de la curva de crecimiento de organismos

unicelulares (bacterias y levaduras), determinando los parmetros principales que
la caracterizan.
Fundamentacin Terica: El crecimiento microbiano est definido como el

aumento armnico e irreversible de masa y estructura. Esto puede estar
acompaado o no de la divisin celular, ya que sta no es un obligatorio
requerimiento.
En el cultivo de microorganismos en condiciones artificiales, es muy empleado el

cultivo batch, discontinuo o en lote. Generalmente se trata de un cultivo en medio
lquido, aireado o esttico y a temperatura constante, y en el cual se parte de una
pequea poblacin inicial o inoculo. En este no se adiciona medio fresco ni se
extrae material exhausto, por lo cual todos los parmetros varan con el tiempo, es
decir, es un proceso en estado transiente. Bajo estas condiciones, si
determinamos el comportamiento de una poblacin de organismos unicelulares en
funcin del tiempo (log del # de clulas o de viables o de absorbancia vs tiempo)
podremos al menos observar cuatro etapas o estadios fisiolgicos conocidos en su
conjunto como curva de crecimiento.
Existen muchos mtodos para la medicin del crecimiento. Entre los ms

Utilizados se encuentran: recuento total de clulas, conteo de viables, peso seco y
turbidimetra. Este ltimo es el ms empleado para organismos unicelulares por la
rapidez y facilidad con que se logran los resultados, midiendo la densidad del
cultivo a medida que este crece. Para ello se utilizan los fotocolormetros o
espectrofotmetro.
El aspecto de la curva de crecimiento vara de acuerdo con las condiciones del

cultivo, el medio empleado y caractersticas del inocul (edad del cultivo y medio
de donde proceda) entre otros aspectos.
CICLO CELULAR PROCARITICO
Un ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados que

comienza con la formacin de una nueva clula y termina cuando dicha clula se
divide en otras dos hijas. Los ciclos celulares se describen generalmente
atendiendo a una serie de eventos identificables que se van produciendo en una
secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta
que se complete el anterior. Los periodos del ciclo celular procaritico son:
fase C (equivalente a la S eucaritica): replicacin del ADN cromosmico;
fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminacin coincide con el

final de divisin celular;
Fase innominada, equivalente a la G1 eucaritica.
Lo caracterstico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y

por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generacin (g), lo hace a expensas de
la fase G1. Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 min, y D = unos 20 min.
CICLO CELULAR EN FUNCIN DEL TIEMPO DE GENERACIN
Vamos a estudiar con el ejemplo de E.coli qu ocurre con el ciclo celular a

distintos tiempos de generacin.
Cuando Existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicacin). En estas

g>C+D condiciones podemos observar ntidamente periodos
diferenciados entre s (de sntesis de ADN y de divisin celular).
Cuando Ya no existe G1, y cada ronda de replicacin comienza

g=C+D inmediatamente tras la precedente divisin celular (es decir,
cada clula hija recin nacida se embarca inmediatamente en
replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de replicarlo,
la clula inicia la divisin celular).
Cuando Las rondas de replicacin de un ciclo se inician antes de que

g<C+D haya terminado la divisin celular del anterior (superposicin
parcial entre fases C y D).
Cuando g<C Ya no se puede detectar fase D como tal. La sntesis de ADN es

continua durante todo el ciclo. Se inician rondas de replicacin
cromosmica antes de que haya terminado la anterior. Esto se
traduce en que los cromosomas muestran un tpico patrn de
replicacin dicotmica y en que dichos cromosomas pasan a
cada clula hija ya embarcados en una nueva ronda de
replicacin.
Una caracterstica del ciclo es que, cuanto ms rico es un medio, y por lo tanto
menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao medio de las clulas.
Es decir, los individuos de una cepa bacteriana que est en un medio rico son ms
grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio pobre.
CONTROL DEL CICLO CELULAR
De lo anterior se deduce que debe de existir algn tipo de acoplamiento entre las
ondas de replicacin y la divisin celular. Este es un campo de investigacin an
joven, del que no conocemos todava todos los detalles
Las copias de cromosomas recin replicadas se encuentran en principio

adyacentes de la membrana citoplsmica (unidas a sendos mesosomas?)
probablemente unidas a travs de sus respectivos orgenes de replicacin (oriC).
No se sabe muy bien cmo esas copias se van separando de modo que cada una
va a parar a una clula hija. Se sabe que en este reparto o particin de los
cromosomas intervienen varias protenas, entre ellas ParA y ParB, que en las
clulas a punto de dividirse se sitan en los dos polos opuestos. Es posible que
exista algn mecanismo activo para separar estos cromosomas, pero parece ser
que tambin intervienen los mecanismos pasivos de crecimiento de membrana y
pared celular en el tabique transversal en crecimiento
Tambin se sabe hoy que existen dos secuencias paralelas e independientes de

acontecimientos que controlan el ciclo celular: un control es sensible a una masa
umbral celular para desencadenar el inicio de la replicacin del cromosoma, y el
otro responde a cierta longitud umbral (en el caso de los bacilos) para que ocurra
el reparto de los cromosomas y la formacin del tabique.
El comienzo de la replicacin del cromosoma se indica mediante la unin de

muchas unidades de la protena DnaA (unida a ATP) al origen de replicacin
(oriC). Una vez que se ha iniciado una ronda de replicacin en oriC, esta regin
queda hemimetilada, pero en vez de ser metilada inmediatamente, queda
secuestrada u ocultada a efectos de la metilasa Dam y de la maquinaria de
replicacin. Se sugiere que en este fenmeno est implicada una protena (SeqA),
que a su vez ayudara a esconder a oriC en la membrana. Slo ms tarde (y por
factores desconocidos, pero que puede que tengan que ver de nuevo con la
proporcin entre sitios de inicio y algn parmetro celular como masa o volumen),
vuelven a quedar las secuencias oriC disponibles para su metalicin y uso en una
nueva ronda.
El comienzo de la fabricacin parece que requiere dos seales:
por un lado, el cromosoma ha debido terminar su replicacin y las copias hijas

deben de estar separadas en extremos opuestos
por otro lado, la clula debe haber alcanzado una longitud umbral
Como ya vimos en el captulo 5, llegado el momento, la protena FtsZ (que hasta

entonces estaba diseminada por toda la clula), se concentra ahora en la parte
central, sealando el plano de la tabicacin: se forma un anillo citocintico o
divisoma, en el que la FtsZ se va contrayendo hacia el interior (hidrolizando GTP
hasta GDP). A continuacin se van ensamblando en el divisoma varias protenas
Fts, entre ellas la PBP3, que como vimos es una transglucosidasa-transpeptidasa
especfica del tabique, que va produciendo peptidoglucano en el septo transversal.
La terminacin del tabique seala el final del ciclo celular.
MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS
En la prctica habitual del laboratorio, los experimentos se realizan siempre con

poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de
su crecimiento en un medio de cultivo. En el resto del captulo nos vamos a referir
al crecimiento microbiano a escala de poblaciones. Comenzaremos con algunos
mtodos habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales

sern aprendidos en vivo por el alumno en las prcticas de laboratorio.
El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede expresar en

funcin de:
aumento de masa del cultivo
aumento del nmero de clulas
Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn

en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes
aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo).
MEDIDA DE MASA CELULAR
MTODOS DIRECTOS
En estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas.
1) Determinacin del peso hmedo:
se tara un tubo de centrfuga;
se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
Se determina el peso del sedimento.
Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya

cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa,
intensidad del empaquetamiento, etc.
2) Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca

antes de ser pesado (105C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas
de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo.
Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores:

es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de
laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x10 9 bacterias.
3) Determinacin del nitrgeno total: tcnica de micro-Kjeldahl.
4) Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN,

ARN, protenas, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos, etc.
MTODOS INDIRECTOS
1) Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por

unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxgeno (QO 2) y consumo de carbnico
(QCO2), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin de cidos.
2) Mtodos turbidimtricos (pticos). Son muy usados en la prctica cotidiana

del laboratorio. La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la
cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano.
Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que
cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin de
la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.
a) Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio

de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la
absorbancia (una medida de la luz transmitida a travs de la suspensin).
Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de A
con la masa bacteriana en una muestra problema.
b) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est

situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se
mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor
sensibilidad que el espectrofotmetro.
MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS
MTODOS DIRECTOS
1) Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial

con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas:
excavacin con 0.02 mm de profundidad;
rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes;
Cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados

pequeos.
O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeos).
La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de
clulas en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros
grandes). Se anota el nmero n de clulas observadas en esas 16 celdillas.
Entonces, la concentracin celular es fcil de establecer:
n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml.
Ventajas: es un mtodo muy rpido.
2) Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una

suspensin microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente
elctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm dimetro) pasa una partcula (p. ej.,
bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de
registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van
pasando. (El tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al
paso de la partcula).
MTODOS INDIRECTOS
1) Recuento de viables en placa: Los mtodos de recuento de nmero de

clulas que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre clulas
vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en
laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una clula se define
como viable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar
descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas
de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Pitra con medio
slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus del
tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles, teniendo en

cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil
deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original. (Para esto, mira el
ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la prctica correspondiente,
que se suele realizar en la 3 tanda).
Mientras tanto, y para luego repasar esa prctica, puedes realizar un experimento
on-line sobre crecimiento bacteriano
Precauciones:
para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5

placas de cada dilucin;
hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin;
Contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.
Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de un

individuo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones
de 2 o ms clulas), el recuento se refiere no a clulas viables reales sino a
unidades formadoras de colonia (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde,
como mnimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la
medida por siembra en placa infravalora el nmero real de individuos, porque cada
UFC puede corresponder a dos o ms individuos que estaban juntos al ser
sembrados en la placa.
2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se

hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de
nitrocelulosa o de nylon estriles (con un dimetro de poro que retiene las
bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se
deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman
sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se cuentan,
deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de
suspensin que se hizo pasar por el filtro.
CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)
Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se

mantienen constantes todos sus parmetros nutricionales y ambientales, crece de
forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, n o de clulas,
ADN, ARN, protenas, etc., es un valor constante y similar en cada caso:
DM/M = DN/N = D[ADN]/[ADN] = D[protenas]/[protenas] = ... = K
As pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logartmico, el cultivo se

comporta como una reaccin auto cataltica de primer orden:
Velocidad de aumento del componente = K{cantidad del componente}
Tambin se puede decir que el n o de clulas, la masa celular u otros

componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado.
Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza,

pues, por ser el crecimiento en el que
todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra

manera:
Aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo

factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de
crecimiento (m), que es caracterstico para cada cepa bacteriana en cada medio
determinado.
EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO
Para deducirla vamos a aprovechar la definicin emprica anterior, atendiendo por

un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del nmero de
individuos.
a) En funcin del aumento de masa celular:
, y por lo tanto, dM = Mmdt
Si integramos, resulta: M/M0 = em(t-t0)
Aplicando logaritmos neperianos:

{12.1}
De aqu se puede deducir que el coeficiente m es
{12.2}
b) En funcin del aumento del nmero de clulas. Supongamos que partimos

de una clula. Tras una divisin (generacin celular), tendremos 2, tras dos
divisiones tendremos 4, luego 8, etc.: tenemos una serie geomtrica. 1, 2, 2 2, 23,
24, ... 2n (donde n es el nmero de generaciones transcurridas). Si en vez de partir
de una clula partimos de N0 clulas inciales, tenemos:
N = N02n ; por lo tanto:
N/N0 = 2n {12.3}
Por otro lado, el nmero de generaciones se puede calcular fcilmente teniendo

en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generacin (g):
Sustituyendo esta expresin en la frmula {12.3} tenemos:
N/N0 = 2(t-t0)/g
Apliquemos logaritmos neperianos:
{12.4}
Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones
matemticas {12.1} y {12.4} que hemos deducido (la de la seccin A, basada en
masa, y la de la seccin B, basada en nmero de individuos) son equivalentes:
, y por lo tanto:
m (t-t0) = (t-t0)/gln2, de donde se deduce el valor del coeficiente de crecimiento

exponencial:
, expresado en h-1 {12.5}
Esta es la expresin matemtica del coeficiente del crecimiento balanceado, en

funcin del tiempo medio de generacin (g).
En un medio ideal, sin limitacin de nutrientes, este coeficiente es m = mmx, o

sea, el mximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir,
es un crecimiento balanceado no restringid
En un medio donde exista algn nutriente limitante (o sea, cuya concentracin

est por debajo del lmite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento
balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento
es inferior al mximo, segn la frmula emprica siguiente (ecuacin de Monod):
Donde [S] es la concentracin del nutriente limitante; K S es la constante de

saturacin, equivalente a la concentracin de nutriente para la que el coeficiente
es semimximo. Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por m) es una
funcin hiperblica de la concentracin del sustrato (nutriente) limitante (ver
grfico). Este sustrato puede ser una fuente de C y/o de energa, fuente de N, de
P, un factor de crecimiento, etc.
Ejemplos de KS:
la KS para la glucosa en E. coli es 110-6M
la KS para el triptfano en esta bacteria es 210--7 M
Estos bajos valores se deben a la alta afinidad de las permeasas de

membrana hacia los sustratos, lo cual es una adaptacin evolutivamente adquirida
de las bacterias a los medios muy diluidos en nutrientes en los que normalmente
viven. (Por el contrario, los medios de laboratorio donde se suelen cultivar las
bacterias suelen ser ms concentrados).
Como veremos en el apartado 6, en la naturaleza, y en los sistemas de cultivo

cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el
crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se
acumulan sustancias de desecho.
CULTIVO CONTINUO (SISTEMAS ABIERTOS). QUIMIOSTATO
El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por

un sistema abierto de flujo que se compone de:
una cmara de cultivo de volumen constante,
a la que llega un suministro de nutrientes,
y de la que se eliminan o separan los productos txicos de desecho (por un

dispositivo de rebosadero).
Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el nmero de clulas y la

concentracin de nutrientes en la cmara permanecen constantes, y entonces se
dice que el sistema est en estado estacionario, con las clulas creciendo
exponencialmente.
Los parmetros a tener en cuenta son:
flujo (f), medido en ml/h
volumen de la cmara de cultivo (v, en ml)
densidad celular en la cmara (x)
factor de dilucin D = f/v (en h-1).
Existe una prdida de clulas por el rebosadero: -dx/dt = xD

El crecimiento bruto es dx/dt = xm
Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = xm - xD = x(m - D)
Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m) se haga igual al factor de

dilucin (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentracin de clulas se hace
constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinmico de
equilibrio. Las prdidas de clulas por drenaje se compensan con las ganancias
por crecimiento.
Una de las maneras de lograr un cultivo continuo es mediante el

llamado quimiostato: en el quimiostato podemos controlar de modo independiente
la densidad de la poblacin celular y la velocidad de crecimiento del cultivo. La
densidad celular en el equilibrio se controla ajustando el factor de dilucin (D),
mientras que la velocidad de crecimiento se controla variando la concentracin del
nutriente limitante en la cmara reservorio (S R).
En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad

de tasas de crecimiento exponencial
El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que existe

un nutriente o sustrato presente en una concentracin suficientemente baja como
para limitar la densidad de poblacin.
As pues, el quimiostato tambin permite elegir la densidad de clulas a la que se

quiere trabajar.
Algunos comentarios sobre el grfico:
La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilucin

(D). Este margen es el ms adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En
cambio, el valor de tiempo de generacin (g) vara ampliamente. O sea, el
quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte
la densidad celular.Sin embargo, a valores extremos de dilucin, se puede ver que
el equilibrio se rompe:
A altas tasas de dilucin la concentracin microbiana cambia rpidamente, y en un

margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (D C: dilucin crtica). Es

decir, el cultivo se lava porque su velocidad de crecimiento es inferior a la tasa
de dilucin.
A muy bajas diluciones (D M) el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es

la fuente de energa. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energa
slo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no
queda para el crecimiento. A este valor lo llamamos energa de mantenimiento.
Los procesos relacionados con esta energa de mantenimiento son el potencial de
membrana, el transporte de solutos y la renovacin de protenas.
Aplicaciones del cultivo contino en quimiostato:
Aportan una fuente continua de clulas en fase exponencial, lo que se aplica

a procesos industriales de fermentacin (produccin de bebidas alcohlicas, de
antibiticos, de aminocidos, etc.).
En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite

estudiar:
aspectos fisiolgicos (por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante);
seleccin de mutantes
Estudios ecolgicos.
CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS
En los sistemas cerrados (que pueden ser lquidos o slidos), no existe aporte
continuo de nutrientes, ni drenaje de clulas ni de sustancias de desecho.
En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido

dura slo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la
acumulacin de desechos.
CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LQUIDO
Como se puede constatar en el anterior grfico, el crecimiento en un sistema

cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:
1) Fase de retardo (fase lag): Es el perodo de tiempo durante el que el

inculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha
sembrado. Se trata de un perodo de ajuste metablico. Su duracin depende de
varios factores:
tamao del inculo;
bondad del inculo (estado metablico previo del inculo):
Si el inculo procede de clulas en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase

lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros
constituyentes de las clulas son bajos, y las clulas deben reponerlos en el
medio fresco.
Si las clulas estn daadas por algn agente, el lag tambin es largo, ya que
necesitan un tiempo para la reparacin de los daos.
Si las clulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en fase logartmica, el lag
es ms corto.
medio del que procede el inculo:
si el medio es similar al medio fresco, el lag es ms corto;
Si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es ms pobre, la fase
de retardo se hace ms larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional
para activar la sntesis de las enzimas biosintticas que estaban reprimidas en el
medio rico.
Pero aun cuando la inoculacin se hace desde un cultivo previo en fase

logartmica, cuyo medio sea idntico al medio fresco, se observa siempre una fase
lag. Por qu?:
necesidad de neutralizar sustancias txicas en el medio fresco;
porque se produce dilucin de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las

bacterias en el medio nuevo; por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcanzar una
concentracin de esos metabolitos adecuada para el crecimiento, ste no
arranca.
Ejemplo: Supongamos que inoculamos una bacteria heterotrfica en un medio

ligeramente cido, sometido a aireacin: en un principio, se produce dilucin de
CO2, por lo que se retardan reacciones de carboxilacin que requieren este CO 2, y
se produce un retardo.
2) Fase de transicin, de crecimiento acelerado, que conduce a
3) Fase de crecimiento exponencial (= fase logartmica). La fase 2 se debe a

que cada clula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus
compaeras. Ello demuestra que las clulas del inculo no estn todas en las
mismas condiciones fisiolgicas.
Durante la fase logartmica se da un crecimiento balanceado no restringido

durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de
generacin (g) es caracterstico para cada especie o cepa, en cada medio
concreto:
El valor del tiempo de generacin (g) depende de:
composicin del medio
temperatura
pH
osmolaridad (tonicidad), etc.
Los microorganismos hetertrofos suelen crecer ms rpidamente en los medios

complejos, ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos ltimos, mejor
con glucosa que con otras fuentes de carbono. Algunos microorganismos tienen, a
su temperatura ptima tiempos de generacin muy cortos (15, 20 min), mientras
que otros tienen crecen ms lentamente, con tiempos de generacin que pueden
ser de varias horas o incluso das.
4) Fase de aceleracin negativa, de crecimiento desequilibrado
5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de

crecimiento se hace nulo (m = 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es
que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares.
En este perodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de

desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el
crecimiento celular.
Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transicin (de aceleracin

negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes
alternativas (p. ej., puede recurrir a aminocidos como fuente de C una vez
agotados los hidratos de carbono).
En la fase estacionaria an existen reacciones metablicas, pero el metabolismo

general es diferente al de la fase logartmica:
las clulas son ms pequeas, debido a que existe divisin celular despus de
que se haya detenido el incremento de masa;
suelen ser ms resistentes a agentes fsicos y qumicos;
existe reciclado de ciertos materiales intracelulares;
Baja el contenido en ARN.
6) Fase de transicin hacia
7) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del

cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energa. Algunas veces las clulas
aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas fantasmas, ghost). La
pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en
bacterias entricas es suave, mientras que en Bacillus es ms acentuada).
CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SLIDOS
Un medio slido es una solucin nutritiva (como el lquido), pero incorporado a un

gel, que le da consistencia.
Los tipos de gelificantes usados para los medios slidos (ms explicaciones en la
2 tanda de prcticas):
agar-agar (o simplemente, agar): es el ms comnmente empleado;
gelatina (inconveniente de que se lica a temperaturas relativamente bajas, y

adems, algunos microorganismos lo degradan por gelatinasas);
Silicagel (o gel de slice): tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para

quimioautotrofos.
Los medios slidos se suelen inocular mediante asa de siembra o esptula,

diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados,
como las placas de Petri (ver prcticas). Tras la incubacin a la temperatura y
condiciones pertinentes, cada bacteria o agrupacin bacteriana que ha quedado
en un punto determinado del medio da origen, por crecimiento, a una acumulacin
de clulas, visible a simple vista, denominada colonia.
La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 10 7 clulas para una
colonia de unos 5 mm). Esto se debe a que en el medio slido, a diferencia del
lquido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio
slido permite un aporte continuo de nutrientes (por difusin desde el entorno de la
colonia, hacia ella), y eliminacin contina de productos de desecho (por difusin
desde la colonia hacia fuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo,
excepto que no hay drenaje de clulas.
Como el alumno comprobar en prcticas (2 tanda), cada especie bacteriana

suele originar colonias de un tipo determinado, en cada medio concreto. Con
vistas a la determinacin taxonmica, se suele tomar nota de una serie de
caractersticas de las colonias (caracteres culturales):
tamao (relativo)
forma general
forma de los bordes de la colonia
aspecto de la superficie y elevacin sobre el sustrato
color
consistencia, etc.
Recursos a utilizar en la prctica (Equipos / instrumentos)
Material
Curva de crecimiento.-
Cua de c/u de las cepas de saccharomyces cerevisiae en medio malta-agarizado

(18 h)
-erlenmeyers de 100 ml con 20 ml de medio extracto de malta, estriles (2)
-erlenmeyers de 250 ml con 48 ml de medio extracto de malta, estriles (9)
-placas de medio extracto de malta-agar (10)
-tubos de ensayo con 9 ml de solucin salina estril (80)
-reactivo 3,5-dns 500 ml o reactivos del fenol sulfrico 500 ml
-puntas estriles para las pipetas automticas. En su defecto
-pipetas de 1 y 5 ml, estriles. (35 de c/u)
-placas de medio extracto de malta-agar (80)
-tubos de ensayos de 15 x 150 mm (30)
-fotocolormetro
-centrfuga
-zaranda orbital (shaker)
PRACTICA No. 02: CUANTIFICACIN DE AZUCARES
Los microorganismos consumen diferentes tipos de sustratos, pero poseen

preferencia por un tipo particular de sustrato y algunos resultan no consumibles
para algunas cepas de una especie en particular. Cuando dos o ms sustratos
estn presentes en el medio de cultivo, los microorganismos no los consumen por
igual, sino que consumen preferencialmente uno de ellos hasta agotarlo. Solo en
este punto inician el consumo del siguiente sustrato preferido. Este fenmeno se
conoce como diauxia.
Esa preferencia por un sustrato en particular es diferente para cada una de las
cepas de un organismo, y puede ser medida como la variacin en la velocidad de
crecimiento, consumo de sustrato o generacin de producto.
IDENTIFICACION Y CUANTIFICACION DE AZUCARES
REACCION DEL ACIDO MUCICO
Este ensayo permite la identificacin de la galactosa o de los azcares que la

contienen. El cido ntrico oxida tanto al grupo aldehdo como al alcohlico
primario de cualquier azcar para originar cidos dicarboxlicos que han recibido el
nombre general de cidos sacridos. El cido mcico o galactrico es el menos
soluble en agua acidificada de todos los cidos sacridos.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Colocar 700 mg de galactosa, glucosa y de la sustancia problema en distintos

tubos de ensayo, a continuacin aadir 1 ml de agua y 1 ml de HNO3 a cada tubo.
Calentar los tubos en un bao de agua hirviendo durante una hora y luego se
dejan enfriar lentamente. La reaccin debe considerarse positiva si aparece un
precipitado blanco de cristales de cido mcico.
REACCION DE MOLISCH
Este ensayo permite detectar la presencia de hidratos de carbono en una muestra;

se basa en la accin hidrolizante y deshidratante que ejerce el cido sulfrico
sobre estos compuestos. Como se sabe, los cidos concentrados originan una
deshidratacin de los azcares para rendir furfurales, que son derivados
aldehdicos del furano. Los furfurales se condensan con los fenoles para dar
productos coloreados caractersticos, empleados frecuentemente en el anlisis
colorimtrico.
En un tubo de ensayo se depositan 10 ml de una disolucin al 5% de la muestra a

ensayar, en un segundo tubo de ensayo se deposita la misma cantidad de una
disolucin tambin al 5% de un hidrato de carbono conocido (glucosa). Se aaden
unas gotas de reactivo de Molisch (-naftol al 5% en etanol) y se mezcla el
contenido. Inclnense los tubos y djese resbalar cuidadosamente 1 ml de cido
SO4H2 concentrado a lo largo de la pared del tubo de manera que se forme una
capa bajo la fase acuosa. A continuacin se calientan los tubos en un bao de
agua unos minutos. La reaccin es positiva si se forma un anillo rojo violceo en la
interfase. Esta reaccin la dan todos los azcares por lo que debe llevarse a cabo
evitando la presencia de restos de papel de filtro o materiales similares en los
tubos de ensayo.
REACCION DE FEHLING
Este ensayo pone de manifiesto la presencia de azucares reductores (aldosas:

glucosa, ribosa, eritrosa, etc.). Se trata de una reaccin redox en la que el grupo
aldehdo (reductor) de los azcares es oxidado a grupo cido por el Cu2+ que se
reduce a Cu+. Tanto los monosacridos como los disacridos reductores
reaccionan con el Cu2+ dando un precipitado rojo de oxido cuproso. La reaccin
tiene lugar en medio bsico por lo que es necesario introducir en la reaccin
tartrato sdico-potsico para evitar la precipitacin del hidrxido cprico. La
prueba de Fehling no es especfica; otras sustancias que dan reaccin positiva
son los fenoles, amino fenoles, benzona, cido rico, catecol, cido frmico,
hidrazobenceno, fenilhidrazina, pirogalol y resorcinol.
El reactivo de Fehling consta de dos disoluciones que se mezclan a partes iguales

en el momento de su utilizacin. La solucin I est formada por SO4Cu* 5H2O al
7% en agua y la solucin II por tartrato sdico-potsico al 35% en NaOH al 10%
en agua. En un tubo se disuelven 500 mg de la sustancia a ensayar en 5 ml de
agua. Se procede de igual manera con otros tubos que contengan azcares
reductores y no reductores conocidos. A continuacin se aaden a todos los tubos
5 ml del reactivo de Fehling. Finalmente se someten a ebullicin en bao de agua
durante 5 minutos. La reaccin debe considerarse positiva si se forma un
precipitado rojo de xido cuproso.
REACCION DE BARFOED
Este ensayo se emplea para diferenciar a los monos de los disacridos. Estos
ltimos reaccionan ms lentamente con el acetato cprico, debido probablemente
al tamao molecular, aunque tambin pueden estar implicados otros factores tales
como una interaccin ms compleja con los dos anillos monosacridos.
El reactivo de Barfoed se prepara aadiendo 2.5 ml de cido actico al 38% en

agua a 100 ml de acetato cprico al 6.6% en agua. Se disuelven 500 mg de la
sustancia a ensayar en 5 ml de agua y se aaden 5 ml del reactivo de Barfoed. Se
repite la operacin con muestras de mono y disacridos conocidos.
Posteriormente se someten a ebullicin en bao de agua y se anotan los distintos
tiempos de formacin del precipitado.
REACTIVOS
Reactivo de Barfoed : 50 ml de cido actico y 100 ml de acetato cprico al 6.6 %
en agua
200 ml de sulfato cprico al 7 % en agua
200 ml de tartrato sdico-potsico (o disdico en su defecto) al 35 % en

NaOH al 10 % en agua.
50 ml de sacarosa al 5 % *
50 ml de fructosa al 5 % *
50 ml de glucosa al 5 % *
20 ml de 1-naftol al 5 % en etanol
100 ml de NaCl al 5 % en agua
*Estas disoluciones debern conservarse en el refrigerador.
DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS
La fraccin de la luz incidente absorbida por una solucin a una longitud de onda
determinada es proporcional al grosor de la capa absorbente (paso ptico) y a la
concentracin de la especie absorbente. Estas relaciones estn Expresadas en la
ley de Lambert-Beer.
I0 I0
Log = .c.l A = log
II
A= .c.l
En donde I0 es la intensidad de la luz incidente, I es la intensidad de la luz

transmitida, es el coeficiente de absorcin molar en unidades de M-1. Cm-1, c es
la concentracin de la especie absorbente en molar y l es el paso ptico de la
muestra que absorbe en cm. A es absorbancia que es a dimensional.
Componentes principales de un espectrofotmetro El coeficiente de absorcin

molar est relacionado con la probabilidad de que la sustancia absorba un fotn
y depende del compuesto y de la longitud de onda a la cual es determinado. En
muchas ocasiones no se conoce para las condiciones concretas del ensayo y es
preciso determinarlo en cada caso. Para ello se prepara una recta patrn; que
consiste en una serie de disoluciones de concentraciones conocidas de la
sustancia a valorar. Estas disoluciones se someten al mismo tratamiento que la
disolucin problema, se mide la absorbancia y se representa grficamente la
absorbancia frente a las correspondientes concentraciones. La concentracin de la
disolucin problema se interpola directamente de la grfica. Cuando no se conoce
el rango de concentracin de la solucin problema es preciso realizar varias
diluciones de la misma para asegurar que, al menos una de ellas, est dentro del
rango de concentraciones de la recta patrn.
OBJETIVO
Determinar azucares en soluciones acuosas: valoracin colorimtrica de hidratos

de carbono por el mtodo de fenol/cido sulfrico usando una disolucin de
glucosa/sacarosa como patrn. Los resultados se expresan como g de
equivalentes de glucosa/sacarosa en 100 ml.
REACTIVOS
-Acido sulfrico concentrado (H2SO4) PRECAUCION MUY CORROSIVO
-Fenol en agua al 80% en peso: 3.2 g fenol ms 0.8 ml de agua. Agitar

PRECAUCION no entrar en contacto con el fenol, prepararlo en un tubo de
ensayo.
-Solucin patrn de glucosa/sacarosa 1 mg/ml: disolver 100 mg en 100 ml de

agua, utilizar un matraz Erlenmeyer de 100 250 ml.
-Solucin problema, muestra lquida con azcares (proporcionada por los

alumnos, o bien jugos de frutas comerciales). Aparte de la muestra (A) realizar dos
diluciones, 1/10 y 1/100 (B y C)
PROCEDIMIENTO
Preparacin de la recta patrn y de la muestra: numerar 15 tubos de ensayo del
1 al 15, en los tubos agregue los reactivos en el orden que aparecen en la
Siguiente tabla. Los volmenes en todos los casos son en mililitros.
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE AZCARES REDUCTORES Y TOTALES

(MTODO DE LANE Y EYNON).
Existen diversos mtodos de cuantificacin de carbohidratos basados en la

capacidad reductora de los azcares que tienen libre el grupo carbonilo. Estos
+2
carbohidratos son capaces de reducir elementos como el cobre (Cu ), el hierro
+3 0
(Fe ) o el yodo (I ).
+2 +1
En el caso especfico del cobre, este es reducido desde Cu a Cu . En este
sentido, en el mtodo de Lane y Eynon (1923) se hace reaccionar sulfato cprico
con azcar reductor en medio alcalino, formndose oxido cuproso, el cual forma
un precipitado rojo ladrillo. Este mtodo utiliza azul de metileno como indicador, el
cual es decolorado una vez que todo el cobre ha sido reducido, lo que indica el fin
de la titulacin.
A. Reactivos:
1. Solucin de Fehling A (34,639 g de CuSO 5H O en 500 ml de agua)
4 2
2. Solucin de Fehling B (173 g de tartrato de sodio y potasio, y NaOH en 500 ml
de agua)
3. Azul de metileno (1%)
4. Solucin patrn de glucosa al 1%
5. Solucin diluida de glucosa (50 mg/ml), preparada a partir de la solucin patrn
de glucosa (1%)
6. Solucin de acetato bsico de plomo al 30%
7. Oxalato de sodio o potasio en polvo
8. Solucin de HCl 1:1
9. Solucin de NaOH 6 N.
B. Procedimiento:
A.- ESTANDARIZACIN DE LA SOLUCIN DE FEHLING
Colocar la solucin diluida de glucosa en una bureta.
Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solucin de Fehling A y 5 ml de solucin de

Fehling B. Aadir 2 o 3 gotas de solucin de azul de metileno. Diluir con
aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio.
Llevar a ebullicin la solucin de Fehling y agregar lentamente la solucin de

glucosa sin dejar de calentar, hasta que desaparezca la coloracin azul. En el
momento en que desaparece el color del indicador, en los bordes del fondo de la
fiola se puede observar cierto tono rojizo.
Nota: durante todo el tiempo en que se aade la solucin de glucosa, la solucin
de Fehling debe mantenerse en ebullicin.
B.- Preparacin de la solucin clarificada de azcares:
Pesar una cantidad de muestra tal que en la solucin final clarificada, la

concentracin de azcares reductores sea de 2 a 5 mg/ml (para gastar entre 10 y
25 ml de dicha solucin por cada 10 ml de solucin de Fehling).
Homogeneizar la muestra con 50 ml de etanol al 80% (v/v) y traspasar
cuantitativamente a un matraz aforado de 250 ml; aforar con etanol (80%), mezclar
bien y filtrar.
Tomar una alcuota de 25 ml de la solucin filtrada y colocarla en una matraz

aforado de 250 ml. Diluir con 50 ml de agua destilada y aadir unos pocos mililitros
de solucin de acetato de plomo (30%), hasta lograr la precipitacin completa (en
el caso de jugos, pulpas y mermeladas de frutas es suficiente aadir 1 o 2 gotas
de la solucin de acetato de plomo al 30%). Mezclar bien y filtrar.
Agregar al filtrado oxalato en polvo en pequeas porciones (una cantidad muy

pequea tomada con la punta de una esptula para evitar el profusin de oxalato)
hasta eliminar el exceso de acetato de plomo. Mezclar y filtrar descartando los
primeros mililitros. El filtrado debe quedar perfectamente transparente.
C.- Determinacin de azcares reductores (originalmente presentes):
Tomar una alcuota de 25 ml, colocarla en un matraz aforado de 100 ml, aforar con
agua, mezclar bien y colocar la solucin en una bureta. Colocar en una fiola de
250 ml 5 ml de solucin de Fehling A y 5 ml de solucin de Fehling B. Aadir 2 o 3
gotas de solucin de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua
destilada y agregar perlas de vidrio. Llevar a ebullicin la solucin de
Fehling y proceder igual a como se hizo durante la estandarizacin de la solucin

de Fehling.
D.- Determinacin de azcares totales:
En un vaso de precipitados de 100 ml, colocar una alcuota de 25 ml de solucin

clarificada.
Agregar 5 ml de solucin de HCl (1:1) y calentar a 70 C durante 5 minutos. Enfriar

a temperatura ambiente y con ayuda de un potencimetro llevar a pH 8,2
utilizando una solucin 6N de NaOH (en caso de no disponer de un potencimetro,
aadir 2 o 3 gotas de fenolftalena y titular lentamente con la solucin de hidrxido
de sodio hasta el cambio de viraje del indicador, luego aadir lentamente, gota a
gota HCl (1:1) hasta la desaparicin del color rosado). Una vez alcanzado el pH
indicado, pasar la solucin cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml,
aforar con agua, mezclar bien y colocar la solucin en una bureta.
Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solucin de Fehling A y 5 ml de solucin de

Fehling B. Aadir 2 o 3 gotas de solucin de azul de metileno. Diluir con
aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio. Llevar a
ebullicin la solucin de Fehling y proceder igual a como se hizo durante la
estandarizacin de la solucin de Fehling.
ESQUEMA DE DETERMINACIN DE AZUCARES EN MERMELADA.
DETERMINACIN DE FIBRA CRUDA.
La fibra cruda est constituida por los carbohidratos presentes en los alimentos
que no son digeridos por las enzimas de los animales. Metodolgicamente, sta
es el residuo orgnico insoluble resistente a la hidrlisis cida (H SO al 1,25%) y
2 4
bsica (NaOH al 1,25%). El residuo obtenido de esta forma contiene minerales y
una mezcla de materiales componentes de la pared celular de los vegetales que
no corresponde a ningn compuesto especfico; correspondiendo
aproximadamente el 97% de tales compuestos a celulosa y lignina.
A pesar de que con el anlisis de fibra cruda se pretende cuantificar carbohidratos

componentes de la pared celular de los vegetales, segn el alimento analizado,
durante la determinacin se pierde entre el 20 y el 60% de la celulosa original
presente y entre el 33 y el 96% de la lignina.
Reactivos:
1.- Solucin de cido sulfrico al 1,25%
2.- Solucin de hidrxido de sodio al 1,25%
3.- Etanol al 95%
Procedimiento:
Pesar aproximadamente 2 g de muestra (en el caso de muestras que no estn

secas utilizar un vidrio de reloj para pesar la muestra).
Transferir cuantitativamente la muestra al vaso de precipitados especial del equipo
de extraccin y aadir algunas perlas de vidrio.
Agregar 200 ml de la solucin de H SO (1,25%) hirviente, conectar el vaso de
2 4
precipitados al condensador de reflujos y mantener la muestra en ebullicin
durante 30 minutos exactamente. Durante la ebullicin, el contenido del vaso de
precipitados debe mantenerse perfectamente mezclado.
Transcurridos los 30 minutos, retirar el vaso de precipitados del condensador y
filtrar la solucin a travs de un embudo de porcelana con lana de vidrio como
material filtrante. Una vez filtrada la solucin, lavar el residuo del embudo con
agua hirviente, haciendo pasar el agua a travs del vaso de precipitados. Se debe
lavar el contenido del filtro hasta que el agua salga a pH neutro.
Transferir cuantitativamente el residuo del embudo al vaso de precipitados
(incluyendo la lana de vidrio) y agregar 200 ml de la solucin de NaOH (1,25%)
hirviente. Luego conectar el vaso de precipitados al condensador de reflujos y
proceder de igual manera a como se hizo durante la digestin cida.
Despus de los 30 minutos de digestin alcalina, retirar el vaso de precipitados del
condensador y filtrar de igual forma que en la digestin cida, lavando con agua
hirviente hasta que el agua salga a pH neutro.
Lavar el residuo con etanol (95%) y transferir totalmente su contenido a una

cpsula de porcelana.
Colocar la cpsula de porcelana en una estufa a 100 C hasta llegar a peso
constante. Una vez esto, pasar la cpsula a un desecador y pesarla cuando se
encuentre a temperatura ambiente.
Poner la cpsula de porcelana en una mufla y mantener a 600 C hasta la
destruccin total de toda la materia orgnica.
Una vez destruida la materia orgnica, colocar la cpsula en un desecador y pesar
al alcanzar la temperatura ambiente.
Recursos a utilizar en la prctica (Equipos / instrumentos):
8 x 2 g de levadura seca o hmeda de cerveza o de
Panadera. Preferiblemente 3 grupos de laboratorio deben trabajar con el mismo

tipo de levadura.
200 cm3 de solucin de fructosa 0.2M
200 cm3 de solucin de galactosa 0.2M
200 cm3 de solucin de glucosa 0.2M
200 cm3 de solucin de lactosa 0.2M
200 cm3 de solucin de maltosa 0.2M
200 cm3 de solucin de rafinosa 0.2M
200 cm3 de solucin de sucrosa 0.2M
8 x 0.5g de ortofosfato dihidrogeno de amonio
8 x 0.5g de sulfato de amonio
(Alternativamente puede emplearse 1g de nutriente de levadura disponible

comercialmente, para reemplazar las dos sales de amonio)
8 x 250 cm3 erlenmeyers
8 x tapones de caucho con dos orificios
Varillas de vidrios
Bureta de 50 cm3
Jeringas aforadas de 25 cm3 o equivalentes para

Muestreo
8 x 100 cm3 erlenmeyers para titulacin
Solucin de hidrxido de sodio 0.1M (alrededor de
400cm3)
Solucin indicadora de fenolftalena y gotero.

PRACTICA No. 03: Aislamiento de microorganismos productores de amilasa
El almidn est conformado por un polmero lineal de glucosa llamado amilosa y

por un polmero ramificado tambin de glucosa llamado amilopectina; lo que hace,
que sea considerado como un polmero natural con una alta riqueza calrica, la
degradacin del mismo en las molculas de glucosa que representan energa para
las clulas se realiza a partir de enzimas extracelulares como la amilasa, la cules
segregada por una gran variedad de microorganismos en ambientes naturales.
Uno de los objetivos de la biotecnologa es encontrar microorganismos
productores de enzimas, que bajo condiciones ptimas produzcan enzimas a nivel
industrial
Recursos a utilizar en la prctica (Equipos / instrumentos):
- 50 ml de agua destilada previamente esterilizada agua peptonada 0.1%

(p/v)
- Pipeta de 10 ml
- Pipetas de vidrio 1 ml estril
- 1 gr de tierra seca recogida 1 cm por debajo de la superficie, de diferentes

sitios tambin a diferentes alturas se pueden tomar muestras de
diferentes tipos de suelo (Se debe colocar en bolsas estriles y rotular).
Mnimo utilizar tres muestras
- Una solucin de yodo
- Bastoncillos de algodn estril
- Cajas de petri estril con 15 a 20 mm con nutriente de agar preparado con

0,2 de almidn soluble Rotulador.
PRACTICA No. 04: Aislamiento de ADN Microbiano
Introduccin
La tecnologa del ADN recombinante ha revolucionado el estudio de la clula, y la

molcula de ADN ha pasado a ser muy simple de estudiar. Desde el ao 1953,
cuando Watson y Crick propusieron el modelo de la doble hlice como estructura
del ADN se han obtenido innumerables avances en el campo de la biologa
molecular y se han desarrollado muchas tcnicas genticas sofisticadas. La
construccin de molculas de ADN recombinantes y artificiales se denomina
Ingeniera Gentica, a causa de su potencial para crear nuevas combinaciones
genticas por medios bioqumicos. El proceso tambin se denomina clonacin
molecular o clonacin gentica, porque se pueden propagar en una estirpe de
organismos genticamente idnticos, los cuales todos contienen la molcula
compuesta y al crecer la amplifican, as como cualquier producto gnico cuya
sntesis sea dirigida por ella
Para clonar (multiplicar) un fragmento de ADN se requiere de los siguientes pasos
1. Obtener el fragmento de ADN que se pretende clonar.

2. Obtener y purificar el Vector de Clonado.
3. Digerir y ligar las molculas de ADN (forneo y vector) de tal manera que nos
permita crear la molcula recombinante.
Las reacciones de corte y ligacin utilizadas deben poder ser comprobadas
fcilmente por el uso de electroforesis en gel.
Introduccin a la Biologa Celular y Molecular
4. Introducir la construccin obtenida en el organismo hospedador adecuado

(bacterias, levaduras, clulas de insecto, otros sistemas eucariticos)
5. Crecimiento y seleccin de los organismos portadores de la molcula

recombinante.
6. Obtener y purificar la nueva molcula de ADN.
Enzimas de restriccin
En los organismos procariotas existe el mecanismo de restriccin regulado por el

husped que les permite a las bacterias distinguir lo propio de lo ajeno. Este
fenmeno que involucra la modificacin y la restriccin tiene como objetivo
controlar la entrada de ADN exgeno, y las endonucleasas responsables de la
degradacin de ese ADN se denominan endonucleasas de restriccin. La bacteria
protege su propio ADN contra los efectos letales de sus endonucleasas y para ello
modifica su ADN metilando ciertas bases de las secuencias de ADN que

constituyen las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restriccin.
Las enzimas de restriccin (ER) reconocen una secuencia nucleotdica especfica
de doble cadena en la molcula de ADN y la cortan o digieren dejando extremos
romos -extremos de doble cadena- o cohesivos -con extremos de simple cadena
complementarios entre s (figura 2).
Existe una gran cantidad de endonucleasas de restriccin que reconocen y
digieren el ADN en secuencias concretas de tetra, penta, hexa o hepta
nucletidos, llamadas
secuencias palindrmicas, que se caracterizan por tener un eje de simetra, de
manera que ambas cadenas poseen la misma secuencias 3-5. Ejemplo:
Plsmidos y clonacin
Los plsmidos son molculas de ADN circulares cerradas covalentemente (CCC)
que poseen los procariotas y se heredan de manera estable en estado extra
cromosmico. Esta definicin implica homogenizacin gentica, tamao constante
de las unidades monomricas y la capacidad de replicarse independientemente
del cromosoma. Los genes existentes en los plsmidos codifican para distintos
caracteres fenotpicos como: resistencia a antibiticos, produccin de antibiticos,
resistencia a metales pesados, degradacin de compuestos aromticos, etc. Estos
plsmidos pueden ser modificados para utilizarse como vectores de clonado (para
amplificar un fragmento de ADN de inters), o como vectores de expresin (donde
el fragmento de ADN insertado codifica para alguna protena de inters).
Las caractersticas generales de un vector de clonacin son: bajo peso molecular,
contienen un origen de replicacin, tienen capacidad de conferir caracteres
fenotpicos fcilmente seleccionables en las clulas husped (por ejemplo
contienen un gen de resistencia a algn antibitico) y poseen un sitio poli-linker o
MCS (multiple cloning site), el cul es una pequea regin con alto nmero de
secuencias reconocibles por un diferentes de endonucleasas de restriccin.
El proceso de clonacin consiste en insertar el fragmento de ADN exgeno en un
vector y su posterior incorporacin en un organismo receptor adecuado como se
mencion anteriormente. Como la eficiencia de esta incorporacin es muy baja, es
esencial que el plsmido tenga algn fenotipo fcil de identificar. Generalmente
este es un gen de resistencia a un antibitico contenido en el plsmido, de manera
que slo crecen las colonias que efectivamente incorporaron el vector.
Para corroborar que el plsmido incorporado en el organismo hospedador

contiene el fragmento de ADN de inters (y no es un plasmado vaco), existen
distintas estrategias. Una de ellas es el sistema -gal: el vector codifica la enzima
-galactosidasa y en el interior de este gen est el polilinker; de esta manera el
inserto de ADN interrumpe la expresin de -galactosidasa y por lo tanto al crecer
la bacterias en una placa con x-gal (el sustrato de dicha enzima que da un
producto azul al hidrolizarse) obtendremos colonias azules (-) sin inserto y
colonias blancas (+) recombinantes.
Extraccin de ADN plasmdico:
Existe una gran variedad de mtodos para el aislamiento de ADN plasmdico, en

particular para aquellos plsmidos encontrados en Escherichia coli y otras
enterobacterias. Estos mtodos se diferencian en la pureza del producto final, en
el tiempo necesario para llevarlos a cabo y en la posibilidad de aplicarlos en
aislamientos a pequea o gran escala; sin embargo todos incluyen tres etapas
comunes: crecimiento de las bacterias y amplificacin del plsmido, cosecha y lisis
de las bacterias y purificacin del ADN plasmdico.
La mayora de los mtodos explota, de una u otra forma, las diferencias existentes
entre el ADN cromosmico y el ADN plasmdico:
Los plsmidos tienen un pequeo tamao en relacin con el cromosoma

bacteriano.
El ADN cromosmico de las bacterias es circular, pero al ser extrado la mayor

parte se obtiene fragmentado, en molculas lineales.
Los plsmidos son molculas de ADN circular, cerrado en forma covalentes (CCC
covalently closed circular).
El procedimiento de desnaturalizacin alcalina, descripto por Birnboim & Doly

constituye la base de varios protocolos de extraccin de ADN plasmdico. Para la
extraccin de ADN plasmdico se lisan las clulas por el agregado de un
detergente (por ejemplo SDS) y NaOH. Las condiciones alcalinas (pH 12-12,5)
desnaturalizan por completo las molculas lineales de ADN, pero no las molculas
CCC (las cuales sufren una desnaturalizacin parcial). El ADN cromosmico
estar en mayoritariamente en forma fragmentada (mltiples molculas lineales) y
el plsmido que en relacin es ms pequeo, se mantendr cerrado. Cuando el
extracto celular es neutralizado (por ejemplo con cido actico) bajo condiciones
de alta concentracin salina (acetato de potasio), el ADN
Cromosomal precipita; obedeciendo a la reasociacin inespecfica de las largas
cadenas de ADN simple cadena, que ocurre en mltiples sitios formando una
masa insoluble. Parte del ARN precipita, pero siempre quedan cantidades
detectables de esta molcula, a menos que se utilicen RNasas durante el proceso
de extraccin. Tambin precipitan algunas protenas debido a que la reaccin se
realiza en presencia de SDS y alta fuerza inica, pero la extraccin mayoritaria de
las protenas se realiza posteriormente con cloroformo. Finalmente, el ADN
purificado se suele concentrar mediante precipitaciones alcohlicas. El cambio de
polaridad del medio que genera el agregado de alcohol, y la disminucin de la
temperatura vuelven insoluble al ADN, pudindose recuperar en un precipitado si
es centrifugado a altas velocidades.
Este protocolo es comnmente utilizado para minipreps de ADN plasmdico, es
decir extracciones a partir de un pequeo volumen (1-1,5 ml) de cultivo bacteriano
saturado. En lneas generales, cuanto ms chico sea el plsmido, mejor es el
resultado obtenido, ya que a medida que se incrementa el tamao, sus
propiedades se asemejan cada vez ms a las del ADN cromosmico. Con
plsmidos mayores a 25 kb el aislamiento se hace dificultoso y el rendimiento es
muy bajo. Sin embargo para los vectores de uso rutinario el rendimiento es muy
bueno y el producto obtenido es lo suficientemente puro como para realizar
digestiones con endonucleasas de restriccin sin necesidad de una purificacin
ulterior.
Procedimiento
Extraccin de ADN total de bacterias
1) Tomar 500 l de la suspensin de bacterias y adicionarle 500 l de fenol:
cloroformo: isoamlico
Mezclar con vortex durante 5 segundos
2) Centrifugar 5 minutos a 14.000 rpm.
3) Colectar la fase acuosa (aproximadamente 400 l de la fase superior) y
agregarle
1 volumen de cloroformo. Mezclar con vortex 5 segundos.

4) Centrifugar 5 minutos a 14.000 rpm.
5) Transferir la fase acuosa (superior) a otro tubo y adicionar 1000 l de etanol
96%
6) Incubar un mnimo de 30 minutos a -20C para precipitar el ADN
7) Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm y 4C
8) Descartar el sobrenadante y lavar el pellet agregando 1000 l de etanol 70%
9) Centrifugar 5 segundos a 14.000 rpm y descartar el sobrenadante
10) Secar el pellet de ADN a 50C y resuspenderlo en 20 ul de H2O destilada.
11) Almacenar a -20 C.
Extraccin de ADN plasmdico de bacterias
Solucin 1: glucosa 40 mM, EDTA 10 mM, Tris HCl 25 mM (pH 8,0).
Solucin 2: NaOH 0,2 N, SDS 1% (w/v). Preparar en el momento de usar
mezclando volmenes iguales de NaOH 0,4N y SDS 2%.
Solucin 3: Kac 3M + Hac, pH 4,8. Mantener a 4 C.
1) Colectar las clulas de E. coli de un cultivo lquido (1,5 ml) por centrifugacin a
5000 rpm durante
3 minutos y descartar el sobrenadante.
2) Agregar 1,5 ml ms del cultivo en el mismo tubo
3) Re suspender el pellet obtenido en el paso 1 con el vortex
4) Centrifugar a 5000 rpm durante 3 minutos.
5) Preparar la solucin 3 mezclando 200 ul de NaOH 0,4 N y 200 ul de SDS 2%.
6) Re suspender el pellet celular con 200 ul de la solucin 1 (para lavar las
clulas).
7) Volver a centrifugar a 5000 rpm y descartar el sobrenadante.
LAS SIGUIENTES DOS ETAPAS SON CONTNUAS SIN INTERVALOS ENTRE

ELLAS.
8) Adicionar 100 ul de la solucin 1 y resuspender las clulas mediante el vortex.
9) Agregar 200 ul de la solucin 2 y mezclar suavemente por inversin hasta

observar que la suspensin se aclara (debido a la lisis celular)
10) Adicionar 150 ul de solucin 3, homogeneizar suavemente por inversin 5
segundos.
11) Agregar 200 ul de cloroformo y agitar. Dejar reposar por 90 segundos a
temperatura ambiente y centrifugar a 14.000 rpm durante 5 minutos.
12) Transvasar el sobrenadante a otro eppendorf, sin interrumpir la fase formada.
13) Precipitar el ADN con 1 volumen de Isopropanol fro y 24 hs de incubacin a
-20C
14) Colectar el ADN por centrifugacin a 14.000 rpm y descartar el sobrenadante.
15) Lavar el pellet agregando 1000 l de etanol 70%
16) Secar el pellet de ADN a temperatura ambiente y resuspenderlo en 20 ul de
H2O destilada.
17) Almacenar a -20 C
Procedimiento:
1. Preparar un cultivo de E. Colli en un caldo nutritivo y dejarlo madurar por lo
menos durante 4 das
2. Aadir 10 mg de lisozima a 5 ml de suspensin bacteriana y agitarla
durante 2 minutos
3. Incubar la mezcla durante 30 minutos a 37 C
4. Aadir a la suspensin bacteriana 5 ml de detergente domstico
5. Llevar la mezcla a bao mara a 60C durante 2 minutos
6. Enfriar la mezcla en agua fra
7. Lentamente y con mucho cuidado verter etanol frio sobre la superficie de la
mezcla de manera que forme una capa
8. Los cidos nucleicos precipitarn en la capa superior de etanol de la cual se
extraern utilizando una pipeta
9. Se puede aadir unas gotas de azul de metileno con el fin de teir el ADN y
volverlo ms visible.

Pre Informe Biotecnologia - Original

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Pre Informe Biotecnologia - Original

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA

TUTOR: FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES

ADRIANA ESPERANZA TRUJILLO MARTINEZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

El desarrollo de la biologa en las ltimas cuatro dcadas, ha hecho posible el

La Biotecnologa, se ha convertido en la herramienta para un nuevo desarrollo

Conocer algunos procedimientos empleados para la obtencin de producto

Identificar los procedimientos para la obtencin de un determinado

Relacionar los conceptos cientficos con los procedimientos tcnicos

PRACTICA No. 01 DETERMINACION DE LA CURVA DE CRECIMIENTO E

Ejercitar de la determinacin de la curva de crecimiento de organismos

Fundamentacin Terica: El crecimiento microbiano est definido como el

En el cultivo de microorganismos en condiciones artificiales, es muy empleado el

Existen muchos mtodos para la medicin del crecimiento. Entre los ms

El aspecto de la curva de crecimiento vara de acuerdo con las condiciones del

CICLO CELULAR PROCARITICO

Un ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados que

fase C (equivalente a la S eucaritica): replicacin del ADN cromosmico;

fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminacin coincide con el

Fase innominada, equivalente a la G1 eucaritica.

Lo caracterstico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y

CICLO CELULAR EN FUNCIN DEL TIEMPO DE GENERACIN

Vamos a estudiar con el ejemplo de E.coli qu ocurre con el ciclo celular a

Cuando Existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicacin). En estas

Cuando Ya no existe G1, y cada ronda de replicacin comienza

Cuando Las rondas de replicacin de un ciclo se inician antes de que

Cuando g<C Ya no se puede detectar fase D como tal. La sntesis de ADN es

CONTROL DEL CICLO CELULAR

Las copias de cromosomas recin replicadas se encuentran en principio

Tambin se sabe hoy que existen dos secuencias paralelas e independientes de

El comienzo de la replicacin del cromosoma se indica mediante la unin de

El comienzo de la fabricacin parece que requiere dos seales:

por un lado, el cromosoma ha debido terminar su replicacin y las copias hijas

Como ya vimos en el captulo 5, llegado el momento, la protena FtsZ (que hasta

MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS

En la prctica habitual del laboratorio, los experimentos se realizan siempre con

mtodos habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales

El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede expresar en

aumento de masa del cultivo

aumento del nmero de clulas

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn

MEDIDA DE MASA CELULAR

En estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas.

1) Determinacin del peso hmedo:

se tara un tubo de centrfuga;

se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;

Se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya

2) Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca

Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores:

3) Determinacin del nitrgeno total: tcnica de micro-Kjeldahl.

4) Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN,

1) Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por

2) Mtodos turbidimtricos (pticos). Son muy usados en la prctica cotidiana

a) Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio

b) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est

MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS

1) Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial

excavacin con 0.02 mm de profundidad;

rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes;

Cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados

O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeos).