UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS
PROGRAMA DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS

INGENIERA GENTICA
MANUAL DE PRCTICAS DE INGENIERIA GENETICA
COMPILADORES:
Principal: Dr. Alejandro Martnez Martnez
Colaboradores: Dr. Alejandro Martnez Martnez
Revisado por: Academia de Biologia 2011

Ciudad Jurez, Chihuahua

Universidad Autnoma de Ciudad Jurez
2011
p. 41
 M. en C. Emilio Clarke Crespo
Coordinador de la Academia de Biologa

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias

Coordinador del Programa de Biologa

Dr. Alejandro Martnez Martnez

Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas

M.C. Hugo Staines Orozco

Director del Instituto de Ciencias Biomdicas

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011

En la actualidad la Ingeniera Gentica se sustenta de la
clonacin, la PCR, la secuenciacin, y la informtica. Las
siguientes prcticas de Ingeniera Gentica no logran cubrir todos
estos campos, tampoco nos interesa formar tcnicos aprieta
botones, pero pretendemos guiar al practicante en algunos
conceptos bsicos de las tcnicas ms comunes en el laboratorio
de Biologa Molecular, abordar conceptos que van desde la
preparacin especial de los reactivos en el laboratorio de Biologa
Molecular, pasando por el fundamento espectroscpico de los
nucletidos y cidos nucleicos, el fundamento de crecimiento de
organismos unicelulares y un ejemplo de extraccin de los cidos
nucleicos y protenas. Igualmente encontrars una gua
bibliogrfica bsica para que te sirva de referencia en la
bsqueda de tu propia informacin. Al final del manual
encontraras una gua de preguntas que tienen como finalidad
inducir a que reflexiones sobre la profundidad que has logrado
abstraer los temas de estas prcticas.
Espero que este fundamento sea slido para entender con
facilidad lo que es posible realizar en el laboratorio in silico y en
los experimentos prcticos. Finalmente deseo agradecer a todo el
alumnado que ha hecho posible estas prcticas-
Alejandro Martinez

2
 Contenido

PRCTICA NO. 1 ..................................................................................................................................... 4

Preparacin de disoluciones ms comunes en el laboratorio de Biologa Molecular ............................... 4

PRCTICA NO. 2 ................................................................................................................................... 12

Espectros de absorcin de nucletidos y nuclesidos ........................................................................... 12

PRCTICA NO. 3 ................................................................................................................................... 18

Determinacin de la curva de crecimiento de la levadura del pan: Sacharomyces cerevisiae .............. 18

PRCTICA NO. 4 ................................................................................................................................... 22

Extraccin del DNA de la curva de crecimiento de la levadura Sacharomyces cerevisiae .................... 22

PRCTICA NO. 5 ................................................................................................................................... 28

Cuantificacin del DNA y determinacin de su coeficiente de extincin molar () ................................. 28

PRACTICA # 6........................................................................................................................................ 32

Extraccin de RNA con Trizol ................................................................................................................. 32

3
 PRCTICA NO. 1
Preparacin de disoluciones ms comunes en el laboratorio de
Biologa Molecular
Nombre del Alumno
Fecha
Introduccin:
La Biologa Molecular en la actualidad ha tomado un auge tan grande que le
merece una categora especial en la preparacin de los reactivos, por ello, es comn
ver catalogos genricos donde los reactivos a la venta tienen una certificacin grado
Biologa Molecular y por su alta demanda es posible encontrar las disoluciones ya
preparadas (normalmente en forma de disoluciones madre concentradas) y listas para
su uso.
Grado Biologa Molecular: Se refiere a que dicho producto ha sido probado en
ensayos de biologa molecular y el producto en cuestion esta libre de nucleasas y
proteasas, as como de altas concentraciones de sales, que de otra manera podran
daar a los cidos nucleicos. Dicho control de calidad asegura que los mtodos de
produccin, almacenamiento y envo de stos productos reunen las necesidades de los
laboratorios dedicados al estudio de esta rea del conocimiento o bien, que la usan
como herramienta experimental.
Disoluciones Concentradas: Son disoluciones que se preparan previamente a
los ensayos donde se les utiliza, las finalidades de las disoluciones concentradas es
uniformizar los ensayos, optimizar el tiempo de preparacin y minimizar el error de la
pesada al momento de preparar la disolucin. Normalmente se preparan disoluciones
diez veces concentradas (10X), aunque tambin las hay cinco (5X) y dos (2X) veces
concentradas. Pueden ser compradas o bien preparadas por el laboratorista, en
cualquier caso, as como ahorran tiempo, tambin pueden ser fuente de errores y
confusiones, por lo que hay que tener las siguientes precaucines: 1) homogenar muy
bien la disolucin concentrada antes de diluirla, ya que el almacenamiento puede
producir gradientes de densidad de algunos de los componentes (cuando se
almacenan en congelacin o refrigeracin), los periodos grandes de almacenamiento
pueden provocar la precipitacin de sales, en tales casos, es recomendable primero
calentar la disolucin concentrda, luego homogenizarla y finalmente tomar la cantidad
necesaria para la disolucin de trabajo. El no tomar la consideracin previa altera el
ensayo actual y futuro debido a que no todos los componentes estn presentes en las
concentraciones adecuadas y adems altera la concentracin de la disolucin madre,
ya que a partir de ese momento estar ms concentrada por un factor desconocido. 2)
Es muy recomendable alicuotar (fraccionar) las disoluciones concentradas en
volumenes de trabajo para hacer la dilucin directa.
Utilera: Los reactivos de Biologa Molecular deben estar libre de nucleasas y
otros contaminantes como sales y/o detergentes. En tal perspectiva, la utilera debe ser
lavada con detergentes libres de fosfatos y lavada con mezcla crmica (24 horas),
despus habr que enjuagar abundantemente con agua corriente, y posteriormente
tres enjuages con desionizada o bidestilada. Dejar secar al aire y posteriormente tapar
con papel aluminio; la cristalera deber hornearse a >200C por lo menos durante 2
horas. Dejar enfriar antes de su uso.

4
 El agua utilizada para la preparacin de los reactivos es grado desionizada y
estril. Algunas compaias venden utilera de plstico para alicuotar las disoluciones
una vez preparadas, sta utilera (tubos de ensaye, puntas, pipetas, tubos de
centrifuga, etc) viene etiquetada por el proveedor como Dnase-, RNase-free.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO:

1) Leer atentamente las instrucciones de trabajo antes de iniciar la prctica y estar
familiarizado con el laboratorio, esta actitud reduce el riesgo de accidentes y hace ms
eficiente su desempeo en la prctica. Preguente cuando tenga dudas sobre cualquier
aspecto del trabajo y respete las seales de no mover dado que podra estropear
otros ensayos en proceso.
2) Tome medidas de proteccin elementales como el uso de bata, guantes,
anteojos de proteccin, campanas de extraccin, escudos para luz UV o radiacin, y
toda medida que en su momento considere oportuna. Estas precauciones reducen el
riesgo de que se transporten materiales biologicamente peligrosos a otros lugares, as
como el dao a la persona misma.
3) Entre al laboratorio slo con sus utensilios de trabajo; bata puesta y abotonada,
manual de la prctica y libreta de laboratorio (de pasta dura). Las mochilas y bolsas
personales no deben obstruir el rea de trabajo. Tampoco se admiten visitas durante
las prcticas ni el ingreso de las mismas al laboratorio.
4) Inicie su prctica mediante la limpieza del rea de trabajo, Sature el rea de
trabajo con una disolucin desinfectante, limpie toda la superficie con un papel limpio y
deje secar. De esta forma se asegura que el rea de trabajo esta limpia. Repita la
operacin al finalizar la prctica.
5) Todos los cultivos, reactivos y disoluciones preparadas por usted o su equipo
debern estar adecuadamente etiquetadas con su nombre, clase, fecha y prctica. El
etiquetado es crtico para el uso adecuado y eliminacin de los reactivos.
6) Antes de encender un mechero asegurese que no hay fugas de gas en otras
mesas, igualmente al apagar su mechero asegurese que la llave esta bien cerrada.
Ubique los lavabos, lavaojos, extinguidores, salidas de emergencia o rutas de
evacuacin
7) Toda la utileria contaminada con materiales biolgicos o txicos, deber ser
desinfectada o neutralizada antes de su eliminacin o reuso. Coloque todo el material
para esterilizacin en un contenedor para tal fin. Las pipetas debern ser colocadas en
disoluciones desinfectantes (mezcla crmica).
8) Est prohibido comer, beber y fumar en las reas del laboratorio
9) Considere que un resultado de calidad requiere de toda la atencin, enfoquese
en su trabajo, por lo que se recomienda (en algunos laboratorios de prohibe) no charlar
ni hacer bromas, ya que podran causar daos a terceros adems de estropear el
ensayo, durante el sembrado bacteriolgico y extraccin de RNA est estrictamente
prohibido hablar.
10) Lave sus manos despus de cada prctica. Por seguridad, cualquier reactivo
del laboratorio debe ser considerado como potencialmente txico ya que existen
muchos factores que influyen en la toxicidad de los agentes nocivos (observar que en
las etiquetas de todos los reactivos se especifica que stos son para uso experimental

5
exclusivamente). Algunas de las sealizaciones ms utilizadas en el laboratorio son
las siguientes:
Carcingeno: agente que se sabe o se sospecha que causa cncer por exposicin
directa
Corrosivo: agente qumico que destruye tejido y materiales por contacto directo
Inflamable: sustancia voltil con capacidad de autoignicin
Mutgeno: que causa alteraciones en el material gentico
Teratgeno: que causa dao al feto
Txico: que causa dao a la salud
Veneno: sustancia que ingerida, inhalada o absorbida por la piel y/o mucosas puede
producir efectos dainos al organismo, frecuentemente irreversibles y que puede
ser fatal.
11) Al inicio de su prctica conteste el cuestionario correspondiente que se
encuentra en los anexos de este manual.

Propsito:
Elaboracin de algunos de los reactivos ms utilizados en las prcticas de Biologa
Molecular siguiendo las normas que se rigen en el mismo.

Objetivo:
Informar al estudiante del rea, material y normas de trabajo en el laboratorio de
Biologa Molecular.

Contenido:
Hora 1:
Lista de presentes y formacin de equipos de trabajo
Lectura de la sesin prctica, desarrollo y discusin de la misma
Revisin de escalas: mili (m, 1X10-3), micro (,1X 10-6), nano (n, 1X 10-9)
Hora 2:
Preparacin de disoluciones amortiguadoras:
Siga la siguiente gua:
1. Use la ms alta calidad de agua posible
2. Use la mejor calidad de reactivos disponible, grado Biologa Molecular
3. De ser posible esterilice las disoluciones (marque el aforo en el frasco contenedor y
no olvide esterilizar agua para rellenar el liquido faltante al aforo, si no hay perdida
de agua, simplemente dejelo as). Si la disolucin no pude ser esterilizada por
autoclave (detergentes y algunas sustancias termosensibles), esterilice por filtracin
a travs de filtros de 0.22 micras.
4. Calibre el pHmetro adecuadamente antes de ajustar sus disoluciones
5. Siempre marque el contenedor con el nombre y concentracinde la disolucin que
est preparando, asimismo marque el equipo y su(s) nombre(s). Recuerde usar
contenedores plsticos para las disoluciones altamente bsicas, como NaOH 1M.

6
6. De ser posible almacene sus disoluciones en fro (4C), sobre todo aquellas
soluiones concentradas.

Clculos de disoluciones molares

Para hacer un litro de disolucin 1M de NaCl:
1.- Obtener el peso molecular mediante la suma de todos los pesos atmicos
Na = 22.997
Cl = 35.459
NaCl = 22.997 + 35.459 = 58.456
2.- Aplicar la fromula: gr de soluto necesarios = (PM) (M) (V)
Donde:
PM = peso molecular (gramos)
M = Molaridad (moles / litro)
V = volumen (litros)
Sustituyendo:
(58.456 gr) (1M) (1L) = 58.456 g
3.- Pesar 58.456 g de NaCl disolverlos en un vaso de precipitado con unos 900 mL de
agua, disolverlos vaciar la disolucin en un matrz aforado de 1 L, enjuagar unas siete
veces el vaso de precipitado, vaciando cada vez el enjuage en el matraz aforado, aforar
a 1L, invertir y dejar pasar un tiempo para que se homogene la disolucin. Depositar en
el envase limpio (grado biologa molecular), rotular con el nombre y concentracin de la
disolucin, nombre del fabricante, fecha, equipo y nmero de prctica.
Ejemplo de un rtulo:

NaCl 1M. 10-07-2003

Alejandro Martnez
Equipo. 1, Prctica. 1
Gentica Molecular

Ejercicios:
1.- Cuntos gramos de NaCl se requieren para preparar 10 mL de una disolucin 2
M?

2.-Suponiendo que en el vaso de precipitado donde se prepar una disolucin acuosa

2M de NaCl, quedaron 5 mL y se lava seriadamente con 10 mL de agua, llevando el
lavado al matraz aforado, y que quedan otros 5mL de solucin diluida, para volver a
enjuagar con otros 10 mL de agua, y asi sucecivamente durante siete veces, cul es
la concentracin final de NaCl en el sptimo enjuage?, complete la siguiente tabla:
Tabla 1.1. Clculo del efecto de dilucin en los lavados
Enjuague mL en el vaso (M)1 ML de enjuage (M)2
1 5 2 10 0.67
2 5 0.67 10
3 5 10

7
4 5 10
6 5 10
7 5 10

Clculos de soluciones porcentuales

Una disolucin porcentual es aquella en la que se conoce la cantidad excta del
soluto en 100 mL de disolvente. La cantidad puede ser expreasada o determinada por
peso o volumen; puede escribirse en gramos y mililitros y expresada como
peso/volumen (p/v w/v) o volumen/volumen (v/v)
Porcentaje peso/volumen (p/v w/v) = peso (en gramos) en 100 mL de disolucin
Porcentaje volumen/volumen (v/v) = volumen (en mililitros) en 100 mL de disolucin
total

Ejemplo (p/v):
Para una disolucin acuosa de cloruro de sodio al 1% (p/v), pese 1 g de cloruro
de sodio (NaCl) y aadalos hasta una aforo de 100 mL con agua. Es lo mismo pesar
0.01 g y aadirlos a un aforo de 1 mL con agua.
Para una disolucin acuosa de cloruro de sodio al 5% (p/v), pese 5 g de cloruro
de sodio (NaCl) y disuelvalos a un aforo de 100 mL con agua. Es lo mismo pesar 0.05
g, disolver y aforar a 1 mL con agua.
Ejemplo (v/v)
El porcentaje de una disolucin de HCl en una botella comercial establece un
37% de HCl. Si se requieren 100 mL de una disolucin al 1%. Es erroneo tomar 1 mL
de la disolucin del 37% HCl y aforarlo a 100 mL con agua.
La forma adecuada de calcular el volumen necesario para hacer una disolucin
acuosa al 1% de HCl a partir de otra al 37% es la siguiente:
(%1) (V1) = (%2) (V2)
Donde:
V1 = volumen 1 (mL)
V2 = volumen 2 (mL)
Despejando:
V1 = (%2) (V2) / (%1)
Sustituyendo:
(1%) (100 mL) / (37%) = 2.7 mL
Tomar 2.7 mL de la disolucin al 37% y aforar a 100 mL con agua. Rotular y
almacenar.

Diluciones (porcentaje por volumen):

El mtodo aconsejable es el mismo anteriormente expuesto:
Porcentaje (%) de la disolucin de partida X volumen necesario = porcentaje (%)
deseado X Volumen deseado.
Ejemplo:
Preparar 0.5 L de etanol al 75% (v/v) a partir de un frasco con rtulo del 95% (v/v):
Sustituyendo en la formula:
95% X (L?) = 75% X 0.5 L

8
 Despejando:
75% X 0.5 L / 95 % = 0.395 L
Tomar 395 mL de etanol al 95% y aforar a 500 mL con agua para tener una
disolucin final del 75% de etanol, rotular.
Uso de micropipetas
En la actualidad existe una gran variedad de micropipetas de volumen ajustable, son
muchas las compaias que las fabrican y aunque varan los diseos, el mtodo
adecuado de pipeteo es uniforme. Aunque cada pipeta es adquirida con su manaul de
uso, la prctica siguiente tiene como finalidad adiestrar al estudiante en el manejo de
las micropipetas.
Operacin
1. Ajuste al volumen deseado mediante el tornillo de ajuste, para mejor precisin
ajuste de un mayor volumen a un menos volumen, por ejemplo: si el volumen esta
en 10 uL y usted desea 20 uL, llevar el tornillo hasta unos 25 uL y posteriormente
baje lentamente hasta los 20 uL de volumen deseado.
2. Inserte la micropipeta en una punta limpia y presione firmemente, en la medida de lo
posible, no toque la punta con las manos, si por alguna razon lo tiene que hacer,
hgalo en la base y nnca en la punta.
Puntas azules: rango de operacin de 200 a 1000 uL
Puntas amarillas: rango de operacin de 20 a 200 uL
Puntas blancas: rango de operacin de 0.5 a 20 uL
3. Presione con el pulgar el botn superior hasta el primer tope y mantenga
presionado. El embolo har un vaco equivalente al volumen ajustado.
4. Manteniendo presionado el botn, inserte la punta verticalmente en la superficie del
lquido que desea tomar, NO inmersa toda la punta, solo unos 2 milimetros.
5. Succione lentamente dejando retornar suavemente el botn superior a su posicin
original. Nunca deje de presionar al botn de manera brusca
6. Espere unos 2 segundos an con la punta inmersa para que la succin del lquido
sea total.
7. Retire la micropipeta y observe que no quede lquido adsorbido a la superficie
exterior de la micropunta. Lleve la punta al contenedor deseado y lleve la punta
hasta la superficie del tubo. Debido a que se manejan volumenes muy pequeos, en
este tipo de pipeteos no es aconsejable dejar resbalar por la pared del tubo, al
contrario, se recomienda depositar en el tubo y si es sobre una disolucin, habr
que tocar la superficie de la disolucin para depositar los microlitros pipeteados.
8. Para expulsar el volumen tomado, presione suavemente el botn superior de la
micropipeta hasta el primer tope, espere unos 2 segundos y cuando observe que ya
no expulsa mas lquido, presione hasta el segundo tope, ello es un volumen
resiudual de aire que asegura la expulsin total del lquido.
9. Con el botn superior presionado, retire la micropunta y desechela presionando el
botn de expulsin en el recipiente adecuado para el mismo fin.

Precauciones:
La consistencia en el pipeteo asegura la reproducibilidad del mismo. Por ello
ponga atencin a los siguientes puntos:

9
1. Velocidad y suavidad durante la presin y liberacin del botn superior de la
micropipeta
2. Presin aplicada al primer tope
3. Profundidad de inmersin en el lquido
4. ngulo de pipeteo
5. Si aparece una burbuja de aire en la micropipeta, retorne el lquido, verifique el
ajuste de la punta a la pipeta, y vuleva a pipetear mas suavemnete, si repite la
aparicin de la burbuje, deseche la punta y repita el proceso con una punta nueva.

Organizacin
Se estructurarn los equipos segn las necesidades del curso

Criterios de evaluacin
Asistencia y entrega de la bitcora

Elaboracin completa de la bitcora, que debe incluir:

1) Nombre del alumno
2) nombre de la prctica
3) fecha
4) Introduccin
Debern ser dos o tres prrafos claros y directos, NO incluya las tcnicas a
desarrollar NI la forma de uso del equipo. LA INTRODUCCIN NO DEBE SER
EXTENSA!
5) Materiales y mtodos
Describa el procedimiento planeado
En el reporte slo haga las anotaciones que se salen del plan diseado, en caso de
que toda la prctica haya sido desarrollada de acuerdo al plan de trabajo, en esta
seccin se puede escribir: no hubo modificaciones en el diseo prctico.
6) Resultados
Todos los datos generados y observados debern ser registrados durante la
prctica. Esto incluye la estructuracin, extensin y llenado de tablas,
grficas, frmulas, y cualquier otra forma de organizacin de datos que los
represente de forma clara y limpia, asimsimo, en esta seccin incluya los
clculos, promedios, errores y correcciones de los datos obtenidos.

7) Discusin y conclusiones
En esta seccin incluya las interpretaciones, conclusiones, o teorias generadas de
acuerdo a sus resultados. Discuta si el objetivo se logr o no y porque. ESTA
SECCIN NO ES UN RESUMEN DE LA PRCTICA!

8) Bibliografa
Incluya las referencias que uso durante la introduccin, discusin o cualquier parte
de la prctica.

10
Algunas consideraciones importantes:
1 Sea honesto y claro en todo el reporte
2 Marque todas las grficas indicando lo que representan
3 NO USE distintos colores de pluma, a menos que sea necesario en los distintos
trazos
4 Las grficas deben estar escaladas en sus ejes con la numeracin mas comprensible
posible (p. ej. 5, 10, 15, 20 pero NO 2.3, 4.6, 6.9)
5 Recuerde que este no es un diario personal, por ello no debe contener anotaciones
personales como telefonos, notas recordatorias, etc.
6 Recuerde que ni calificacin ni su merito dependen de los resultados, por lo tanto no
los modifique queriendolos ajustar a lo esperado, es mas meritorio una
representacin precisa de los mismos con una discusin inteligente.
7 Adems de la bitcora de trabajo, edite sus prcticas en un procesador de texto y al
final del curso engargolelas en aro metlico, despues de todo, es su trabajo y su
experiencia y stas podran empezar a constituir su manual de experiencias,
(uno de los objetos muy valiosos para todo profesionista).

11
 PRCTICA NO. 2
Espectros de absorcin de nucletidos y nuclesidos
Nombre del alumno
Fecha:

Introduccin:
Los nucletidos son las unidades fundamentales que constituyen los cidos nucleicos.
Los nucletidos por s solos tienen actividades biolgicas importantes y variadas en el
interior de la clula, pero cuando los nucletidos se combinan entre s, formando los
cidos nucleicos, constituirn las unidades fundamentales de la expresin gentica y
de la divisin celular.

Un nucletido est compuesto de tres partes: 1) una base nitrogenada, 2) un azcar y

3) uno o ms grupos fosfato. Hay dos tipos de bases nitrogenadas: purinas y
pirimidinas. La unin de una base purnica con un grupo fosfato y un azcar dar origen
a un nucletido purnico, la unin de una base pirimidnica con un grupo fosfato y un
azcar da origen a un nucletido pirimidnico. Las bases pirimidnicas son una sola
cadena de carbn y nitrgeno mientras que las bases purnicas son dos cadenas de
carbonos y nitrgenos.

Las propiedades que se utilizan para conocer la composicin qumica de la muestra

pueden denominarse seales analticas. Como ejemplo, la absorcin de la luz, la
conductancia, el peso, etc. La espectrofotometra se refiere a los mtodos,
cuantitativos, de anlisis qumico que utilizan la luz para medir la concentracin de las
sustancias qumicas. Se conocen como mtodos espectrofotomtricos y segn sea la
radiacin utilizada como espectrofotometra de absorcin visible (colorimetra),
ultravioleta, infrarroja.

Bourguer, Lambert y Beer, a travs de sus observaciones establecieron relaciones de

la variacin de la intensidad de luz transmitida por una muestra con el espesor de ella o
con la concentracin de la sustancia, para materiales translcidos. Estas relaciones se
conocen como la ley de Bourguer-Lambert-Beer o ley general de la
espectrofotometra que permite hallar la concentracin de una especie qumica a partir
de la medida de la intensidad de luz absorbida por la muestra.

Todas las bases de purina y de pirimidina de los cidos Nucleicos absorben

fuertemente la luz ultravioleta en la regin de 250 a 280 nm. Esta propiedad es muy til
para el reconocimiento y determinacin cuantitativa no solamente de las bases libres
sino tambin de los nuclesidos y nucletidos. La desnaturalizacin de DNA
incrementa la absorcin lumnica observada a 260 nm, a esto se le conoce como efecto

12
hipercrmico, esto es igual al numero equivalente de los correspondientes
mononucleotidos libres. El tanto por ciento de incremento de absorcin lumnica
inducido por el calentamiento de una muestra de DNA nativo se halla directamente
relacionado con su contenido en pares de bases A-T, cuanto mayor es la proporcin de
estas, mayor es el incremento de absorcin lumnica.

La absorcin lumnica, menos aditiva, de las molculas de DNA de doble hebra, se

debe a las acciones interelectrnicas entre las bases apiladas de la estructura de doble
hlice nativa, que hacen disminuir la cantidad de luz que puede absorber cada uno de
los restos. Cuando se desordena la estructura duplohelicoidal, las bases se deshacinan
y en esta forma menos obstaculizada, absorben casi tanta luz como lo haran si se
hallaran en forma de nucletidos libres.

Propsito:
Conocer y comparar los espectros de absorcin del ATP, AMP y adenosina en agua
y disolucin etanolica al 50%.

Objetivo:
Que el alumno desarrolle la habilidad para:
1) la elaboracin de espectros de absorcin de analitos y
2) determine el coeficiente de extincin molar de cada analito en sus condiciones
experimentales.

Contenido: Materiales y mtodos

Hora 1:
Lista de presentes y formacin de equipos de trabajo
Lectura de la sesin prctica, desarrollo y discusin de la misma
Clculos para la preparacin de las disoluciones (1 mL de disolucin inicial de 0.1 mM)
Hora 2:
Preparacin de disoluciones:
Siga la siguiente gua:
1. Pese cada analito por separado y disulvalo (uno en agua y otro en 50% etanol).
Marque el contenedor con el nombre y concentracinde la disolucin que est
preparando, asimismo marque el equipo y su(s) nombre(s)
2. Calcule las diluciones para obtener 1 mL de las concentraciones mM que se
observan en la siguiente tabla. Los espacios vacios son para que anote el valor de la
absortividad a la longitud de onda mxima.

Tabla 2.1. Absorbancia de nuclesidos y nucletidos en dos disoluciones

AGUA 50% ETANOL
Conc ATP AMP ADO ATP AMP ADO
mM
0.1
0.05
0.01

13
3. Determine el espectro de absortividad en la regin ultravioleta (UV) 230-300 nm en
el analito de 0.1 mM. Utilice los recuadros siguientes para pegar cada espectro de
absorcin.

Figura 2.1

ATP ATP
Agua Etanol
mx mx

Abs
Abs

AMP AMP
Agua Etanol
Abs

Abs

mx mx

ADO ADO
Agua Etanol
mx mx
Abs

Abs

Modelo de Espectrofotmetro:
Volumen de determinacin:
Analito:
Concentracion:
Solvente:
Fecha:

14
Registre el valor de absortividad mximo de cada analito tanto para la disolucin
acuosa como para la etanolica.
4. Determine la absorbancia de cada concentracin del analito a la longitud de onda
maxima de cada grafica anterior y construya las graficas correspondientes (Abscte Vs
Concentracin):

Figura 2.2

ATP ATP
Agua Etanol
y = mx + b y = mx + b

Abs
Abs

Concentracin Concentracin

AMP AMP
Agua Etanol
Abs

Abs

y = mx + b y = mx + b

Concentracin Concentracin

ADO ADO
Agua Etanol
y = mx + b y = mx + b
Abs

Abs

Concentracin Concentracin

15
Compare la longitud de onda de absortividad mxima de cada analito as como su
pendiente de acuerdo a la siguiente tabla:

Tabla 2.2 Coeficientes de absortividad en dos disoluciones

Pendiente (m) mx
AGUA ETANOL AGUA ETANOL
ATP
AMP
ADO

Resultados
(Anexar los folios necesarios)

16
Conclusiones
(Anexar los folios necesarios)

Bibliografa
(Anexar folios si es necesarios)
Lehninger, A.L. (1985), Bioqumica, 2a Edicin, Ediciones Omega, S.A., ISBN: 84-
282-0211-7, Barcelona, Espaa. pp320.

17
 PRCTICA NO. 3
Determinacin de la curva de crecimiento de la levadura del pan:
Sacharomyces cerevisiae
Nombre del alumno
Fecha:

Introduccin:
El crecimiento de un organismo en un medio ilimitado (i.e. el alimento, espaccio
y otros organismos nos ejercen un efecto limitativo), el ndice de crecimiento especfico
(esto es, el ndice de crecimiento de la poblacin por individuo): a) se hace constante,
b) es mximo en stas condiciones, c) es caracterstico de una determinada estructura
de edad de la poblacin y d) constituye un ndice nico de la capacidad de una
poblacin para crecer. Comunmente se le representa por el simbolo r , que es el
exponente en la ecuacin para el crecimiento de poblacin en un medio ilimitado en
condiciones fsicas constantes.
Nt = Noe r t
No representa el nmero de clulas en el tiempo 0
Nt representa en nmero de clulas en el tiempo t
e = base del logaritmo neperiano
r = coeficiente instantneo de crecimiento de la poblacin

El valor de r puede calcularse con un despeje y considerando los valores de dos

mediciones del tamao de la poblacin (No y Nt o en dos tiempos cualquiera durante la
fase de crecimiento ilimitado, en cuyo caso pueden sustituirse porN1 y N2 y t por (t2 -
t1) en la ecuacin anterior).
La capacidad de soporte puede definirse como la resistencia ambiental al
crecimiento del organismo (por mencionar algunos de los factores limitantes; falta de
alimento, nutrientes, espacio):
dN/dt = rN (con lmite preciso en N)
El lmite de crecimiento en N genera una curva de crecimiento asinttico cuyo
valor nmerico (K) es definido como el valor mximo de N.
La ecuacin en cuestin puede definirse como sigue:
dN/dt = rN (K N) / K
En resumen, este modelo es producto de tres componentes: 1) una constante de
ndice (r), 2) una medida del volumen de la poblacin (N), y 3) una medida del(s)
factor(es) limitativo(s) del crecimiento de la poblacin (K N) / K )

Propsito:
Determinar la cintica de crecimiento de un microorganismo de uso comn en el
laboratorio de Biologa Molecular Sacharomyces cerevisiae.
En conjuncin con la siguiente prctica, determinar la relacin entre la cintica de
crecimiento de la biomasa y la replicacin del ADN

18
Objetivo:
Que el alumno desarrolle la habilidad para: 1) determinar los valores de la cintica
de crecimiento de microorganismos en el laboratorio experimental 2) extraccin del
DNA total.
Contenido: Materiales y mtodos
Material:
Matraz erlenmayer de 250mL Micropipetas con puntas
Gasa Vaso de precipitado de 250 mL
Bao mara con agitacin a 30C Agitador mgntico con magneto
Espectrofotmetro con cuvetas Embudo y filtros para caf
desechables Levadura para cocinar (Saccharomyces
Pipetas paster o popotes de bebidas cerevisae)
Tubos para microcentrifuga

Hora 1:
Lista de presentes y formacin de equipos de trabajo
Lectura de la sesin prctica, desarrollo y discusin de la misma

Preparacin de disoluciones
Hidrate una cucharada de levadura en aproximadamente 20 mL de leche, o en
su defecto agua una vez que se tengan listos el material y los reactivos para iniciar la
practica.
Solucin Salina 10X (la solucin salina 1X es 0.9% de NaCl p/v)
Prepare 100 mL de sal de mesa al 9% p/v en agua destilada.
Medio de cultivo: Prepara inmediatamente antes de inocular las levaduras
Disuelva 0.1gr de una tableta de vitaminas comerciales (utilizar las que no
desarrollen color en solucin).
Agregue 2 gr de azcar de mesa en medio litro de disolucin salina precalentada
a 37C
Coloque 0.1gr de gelatina, y KNO3 al 10%

Nota: es posible que el medio se torne turbio, en tal caso filtre a travs de varias capas
de filtro para cafetera).

Hora 2:
Inoculacin de la levadura:
En un matrz Erlenmayer de 50 mL ponga 25 mL de medio de cultivo para
levadura, (asegurese de que el medio est a 37C)
Aada 2.5mL de levadura previamente hidratada, tape el matrz con ocho capas
de gasa y agite vigorosamente de forma circular hasta obtener una suspensin de
celulas homogeneas a la vista.
Tome una fraccin de 5 mL para determinar la Abs600nm y el peso de las celulas
pellet (ver instrucciones abajo).

19
 Repita esta operacin cada diez minutos durante 40 minutos y poteriormente
verifique los horarios de lectura en la tabla 3.1 (ajuste los horarios de muestreo de
acuerdo a su criterio)
Determinacin de la Abs600nm :
A) Calibre el blanco con medio de cultivo sin inocular.
B) En la cubeta de determinacin de absorbancia aada medio de cultivo y ajuste a 0
C) Descarte el medio de cultivo de la cubeta espectroscpica. Para la de
determinacin de la absorbancia haga una dilucin 1/100
Aada el medio de cultivo inoculado
Invierta para homogenar y regisitre la absorbancia en su tabla de resultados (es
importante tomar el primer valor de absorbancia, ya que las levaduras son pesadas y
tienden a sedimentar, generando un efecto de disminucin del valor de la absorbancia).

Determinacin del peso y preparacin para la extraccin del DNA

Tenga 10 tubos de microcentrifuga pesados y rotulados con los nmeros: 0, 1, 2,
4, 6, 8, 22, y 24 (son los tiempos de muestreo del crecimiento del cultivo, pueden
cambiar segn el muestreo de la poblacin en crecimiento).
1) Centrifuge 1 mL de la muestra a velocidad maxima por tres minutos, retire el
sobrenadante (cuidando de no llevarse el sedimento) y pese nuevamente, registre el
valor en la tabla y obtenga el valor del peso de las celulas por diferencia, antelo en la
columna correspondiente (ver hoja de resultados).
2) Centrifuge 1.5 mL de muestra como en A), descarte el sobrenadante y congele para
la extraccin del DNA en la prxima prctica.

Resultados
(Anexar los folios necesarios)

Tabla 3.1. CULTIVO DE Saccharomyces cerevisiae

T (h) ABSORBANCIA PESO (mg)
Hora Abs600nm Abs TUBO TUBO + *PELLET
PELLET (mg de
clulas)
0 10am 0

1 11am 1

2 12am 2

4 2pm 4

6 4pm 6

8 6pm 8

20
22 8am 22

24 10am 24

* El dato de los mg de clulas ser utilizado para calcular la relacin DNA/mg de

celulas en la siguiente prctica.

Clculos y observaciones

Graficas:
Grafique sus resultados, vea esta grfica como gua
Grfica 3.1. Curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae

Asntota = K

Masa
(Nmero de clulas)
Abs600nm

Espectrofotmetro:
HORAS Volumen de determinacin:
Organismo:
Valor de K:
Valor de r:
Fecha:

Conclusiones
(Anexar los folios necesarios)

Bibliografa
(Anexar los folios necesarios)
Davis, B.D., Dulbecco, R., Eisen, H.N., Ginsberg, H.S., Wood, W.B., (1978). Tratado
de Microbiologa, 2a Edicin, Salvat Editores, S.A., ISBN 0-06-140683-4, pp98-103.
Mallorca, Espaa.
Odum, E.P., (1971). Ecologa, 3a Edicin, Nueva Editorial Interamericana, S.A. de
C.V., ISBN 968-25-0042-7, Mxico, D.F.

21
 PRCTICA NO. 4
Extraccin del DNA de la curva de crecimiento de la levadura
Sacharomyces cerevisiae
Nombre del alumno
Fecha:

Introduccin:
La molcula del ADN tiene una composicin muy compleja. Principalmente esta
formada por dos largas cadenas de nucletidos unidas entre si formando una doble
hlice. Estas estn unidas gracias a puentes de hidrgeno Sus componentes estn
condicionados qumicamente al momento de unirse: la Adenina (A) solo se une con la
Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C).
Una secuencia de bases nitrogenadas guarda la informacin gentica, el orden
de esta secuencia es imprescindible ya que constituye las instrucciones del programa
gentico de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un
ADN equivale a descifrar su mensaje gentico.

Existen en la actualidad diversas estrategias para la extraccin del DNA a partir

de tejidos vivos. La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de
que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su
disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper) las clulas
mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn
en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un
surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en
menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn
fraccionado en cadenas ms pequeas y separadas de l por accin del detergente.
Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo
cual se utiliza alcohol isopropilico.

Propsito:
Determinar la cintica de replicacin del ADN de Sacharomyces cerevisiae.
En conjuncin con la prctica anterior, comparar la curva de crecimiento de la
biomasa con la del ADN.

Objetivo:
Que el alumno desarrolle la habilidad para: 1 la extraccin del DNA total.

Contenido: Materiales y mtodos

Material: Etanol al 70%
Fenol equilibrado (200uL/muestra) Sonicador
Cloroformo (200 uL/muestra) Ablandador de carne
Agua destilada estril Tubos para microcentrifuga
Acetato de solio 3M (10uL/muestra) Micropipetas con puntas
Etanol absoluto Agitador mgntico con magneto

22
Sonicador HCl
Embudo y filtros para caf EDTA
Alcohol isopropilico Levadura para cocinar (Saccharomyces
Trizma base cerevisae)

Hora 1:
Lista de presentes y formacin de equipos de trabajo
Lectura de la sesin prctica, desarrollo y discusin de la misma

Preparacin de disoluciones
TE buffer: (preparar 50 mL)
Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM; EDTA 1mM

Fenol equilibrado: (preparar 10 mL)

A 10 gr de fenol fundido (~10mL) a 60C se aade otro volumen de TE se agita y
deja reposar hasta que se separen las fases
Retire la fase acuosa (capa superior), se aade otro volumen de TE y se repite
la operacin, se vuelve a depositar TE y se deja guardado a -20C y protegido de la luz.
Tambin es posible equilibrar el fenol con agua u otro amortiguador.

Acetato de sodio 3M (preparar 10 mL en agua)

Etanol al 70%: (preparar 10 mL)

Ablandador de carne al 1%: (preparar 1 mL en TE)

Detergente al 1%: (preparar 1 mL en agua). El Triton X-100 es el detergente de primera
opcin, en caso de carecer de l, utilice detergente lquido sin fosfatos para trastes.

Hora 2:
Extraccin del DNA (mtodo de eleccin, nmero 1). Este mtodo fue diseado
para evitar el uso de fenol y cloroformo, asi como de enzimas costosas y detergentes
caros.
Este paso inicia con la resuspensin del paquete celular (1.5 ml / muestra) de la
prctica anterior.
1) Descongele el paquete celular aadiendo 350 uL de TE y aada 20 uL de
ablandador de carne e incube 5 min a 37C
2) Aada 20 uL de disolucin de detergente y mezcle invirtiendo 10 veces el tubo.
3) Sonique sobre hielo durante 60 segundos al 50% de potencia (el sonicador auxilia
en la ruptura celular, en caso de carecer de sonicador se puede prescindir de este
paso)
4) Abra el tubo para evitar que explote y ponga ~40 seg sobre un bao maria en
ebullicin (este paso inactiva las proteasas del ablandador de carne)

23
5) Centrifuge 3 minutos a 3000 rpm y transfiera el Sobrenadante a un tubo limpio y
pesado, (conserve el pellet hasta verificar que el DNA fue extraido)
6) El sobrenadante anterior aada 1/10 vol (~40 ul) de acetato de sodio 3M, agite e
incube sobre hielo de 1a 5 minutos.
7) Aada 1 mL de isoproanol, mezcle 10 veces por inversin y deje reposar
temperatura ambiente durante 20 minutos para facilitar la precipitacin
8) Centrifuge a velocidad mxima 15 minutos a 4C, recupere el sobrenadante,
descartelo una vez verificado que se extrajo el DNA.
9) Seque el pellet al aire invirtiendolo sobre papel secante, este proceso dura unos 20
minutos.
10) Pese nuevamente el tubo conteniendo el DNA seco y obtenga el peso del DNA por
diferencia con respecto al tubo sin DNA (paso5)
11) Resuspenda el pellet en 50 uL de TE, congele a -20C hasta su uso.

Extraccin del DNA: (mtodo alternativo nmero 2). Este mtodo podra utilizarse
en caso de carecer de fenol y cloroformo, o de una eliminacin adecuada de los
mismos).
1) Resuspenda el pellet en 200 uL de TE y aada 20 uL de ablandador de carne e
incube 25 min a 37C
2) Sonique sobre hielo durante 60 segundos (50% de potencia)
3) Aada 1 uL de 2-mercaptoetanol e incube a 65C durante 30 minutos
4) Meta a congelacin de -20C durante 10 minutos
5) Descongele por incubacin a 65C / 5 min y enfrie sobre hielo 3 minutos
6) Sonique un minuto como en el paso 2 y aada 10 uL de SDS al 10%, mezcle
para homogenizar el SDS e incube a 65C / 15 min
7) Aada 1/10 vol (~25 ul) de acetato de sodio 3M, agite e incube sobre hielo 5
minutos
8) Centrfuge a velocidad mxima durante 5 minutos y transfiera el sobrenadante a
un tubo limpio, pesado y rotulado, aada 3 volumenes de etanol al 95%
(~770 uL), mezcle 10 veces por inversin y deje sobre hielo 5 minutos,
centrifuge a velocidad mxima 15 minutos, descarte el sobrenadante y
seque el pellet al aire.
9) Pese nuevamente el tubo conteniendo el DNA seco y obtenga el peso del DNA
por diferencia con respecto al tubo sin DNA (paso anterior)
10) Resuspenda el pellet en 50 uL de TE (algunas veces es necesario calentar en
bao maria algunos minutos ~5 para disolver completamente el DNA).
11) Verifique que el DNA este adecuadamente etiquetado y congele a -20C.

Resultados
(Anexar los folios necesarios)

24
Clculos y observaciones
Genere una tabla conteniendo los datos de la hora del cultivo, mg de celulas y
mg de DNA extrado (tubo con DNA seco tubo sin DNA), basese en la tabla de la
prctica anterior.
Peso
Tiempo( horas) mg de clulas mg de DNA
0
1
2
3
5
7
22
24

25
Graficas:
Genere una grfica de DNA extrado (mg) en funcin del tiempo de cultivo (h).
Mediante una normalizacin al 100% de y max, haga una grfica compuesta
donde se observe la grfica de la prctica anterior (masa de Saccharomyces Vs
Tiempo) con la de sta prctica (DNA extrado Vs Tiempo).

Conclusiones
(Anexar los folios necesarios)

26
Bibliografa
(Anexar los folios necesarios)
Glover, D.M. (1985), DNA cloning, volume II a practical approach, 1a Edicin, IRL
Press Limited, ISBN 0-947946-19-5, Oxford, UK. pp 56.

27
 PRCTICA NO. 5
Cuantificacin del DNA y determinacin de su coeficiente de
extincin molar ()
Nombre del alumno
Fecha:

Introduccin:
Es comn observar la siguiente expresin para el clculo del DNA:
Volumen en
50 ug de DNA la celda
[ug de DNA / uL] = Abs260nm X X
ML Volumen de
muestra
Abs260nm = Lectura espectrofotomtrica de la solucin de DNA a 260 nm
50 ug de DNA/mL = Factor que relaciona la concentracin de una disolucin de
DNA con su absorcin a 260 nm
La formula anterior supone: 1) que el DNA es de cadena doble, 2) que el DNA es
puro (libre de fenoles, proteinas, carbohidratos, etc, 3) que el solvente es agua.

Bajo las mismas consideraciones podrian considerarse las siguientes

conversiones espectrofotomtricas:
1A260nm de DNA de cadena doble = 50 ug / mL
1A260nm de DNA de cadena sencilla = 33 ug / mL
1A260nm de RNA de cadena sencilla = 40 ug / mL
Coeficiente de extincin molar ():
Todos los factores de conversin arriba anotados se obtienen de graficar la
Absorbancia del respectivo cido nuclico contra su concentracin, de esta forma se
obtiene una recta, definida con la ecuacin de la misma (y = mx + b), la pendiente (m)
que se obtiene tiene las unidades de y/x esto es: abs/M.
De acuerdo a la ley de Beer: A = () (c) (b)
A es absorbancia (adimensional)
es el coeficiente de absorcin molar (medido en M-1 x cm-1)
c es la concentracin de la muestra (M = moles/L = umoles/mL)
b es longitud del trayecto ptico (cm)
Despejando: = A /(c b); y considerando que el trayecto ptico es 1cm se tiene que
= A /(c) cm
Esto es: = A /M cm, si se grfica la absorbancia (obtenida en un trayecto ptico de 1
cm) en funcin de la concentracin molar, y descartando la absorbancia por ser
adimensional, la pendiente tendr las mismas unidades del coeficiente de extincin
molar (M-1 x cm-1). Dicho de otra forma, El coeficiente de absorcin molar es la
propiedad caracterstica de las sustancias que indica cunta luz se absorbe a una
longitud de onda dada.
Se demuestra con ello que el factor 50 ug mL-1 es en realidad el inverso de .

28
Propsito:
Que el alumno comprenda la razn de la frmula para el clculo de la concentracin
del DNA:
Abs260nm X 50 ug/mL de DNA X FD = ug de DNA /mL

Objetivo:
Que el alumno determine el coeficiente de absortividad de una preparacin de DNA
extrada por el mismo

Contenido: Materiales y mtodos

Material:
DNA extrado en la prctica 4 Pipetas paster o popotes de bebidas
Espectrofotmetro con cuvetas Tubos para microcentrifuga
desechables Micropipetas con puntas

Hora 1:
Lista de presentes y formacin de equipos de trabajo
Lectura de la sesin prctica, desarrollo y discusin de la misma

Preparacin de disoluciones
Agua destilada

Hora 2:
Determinacin de la Abs260nm :
1) Disuelva el DNA extrado en la prctica 4 aadiendo 55 uL de agua a cada tubo,
observe como se disuleve el DNA, es posible que sea necesario incubar en bao
mara, normalmente esto se consigue a 37C durante 5 minutos.
2) Homogene el tubo con unos cuantos golpes con el dedo y baje todo el contenido
con un pulso en la microfuga
3) Determine la absorbancia a 260nm de ditaintas diluciones del DNA extrado en 1 mL
de agua:
4) Rotule 6 tubos con los nmeros: 0, 1, 5, 10, 15 y 20 (corresponden a los microlitros
de DNA que se aadirn al tubo.
5) Aada 1 mL de agua a cada tubo
6) Aada el DNA correspondiente al rtulo del tubo: 1 uL, 5 uL, 10 uL, 15 uL, 20 uL.
7) Mezcle y dtermine la Abs a 260 nm en una cuveta de cuarzo y 1 mL de capacidad
volumtrica

29
Resultados

(Anexar los folios necesarios)

Tabla 5.1. DNA EXTRADO DEL CULTIVO DE Saccharomyces cerevisiae

DNA ABSORBANCIA
uL
Hora Abs260nm Abs280nm A
260/280
1 10am
5 11am
10 12am
15 2pm
20 4pm

Muestras provenientes del cultivo de Saccharomyces cerevisiae

T ABSORBANCIA
(h
) [DNA] DNA
Abs260n Abs280n Abs260 ug / Volume total DNA mg
m m Abs280nm mL n (mL) (ug) celulas*
0

22

24

Clculos y observaciones
Calcule la Abs de la disolucin original del DNA multiplicando por el factor de dilucin
Grafique la Abs260

30
Conclusiones
(Anexar los folios necesarios)

Bibliografa
(Anexar folios si es necesarios)

31
 PRACTICA # 6
Extraccin de RNA con Trizol
Nombre del alumno:
Fecha:

Introduccin

Como ya se ha mencionado, la extraccin de mARN slo puede realizarse de

aquellos tejidos que expresan el gen de inters. El procedimiento de extraccin de ARN
total, requiere los mismos pasos que la purificacin de ADN, con la salvedad de que se
utiliza en la lisis celular, algn agente que inactive las RNAsas propias de la clula
lisada (EDTA, tiocianato de guanidina, urea, 2-mercaptoetanol).
El resultado de estos procesos es la obtencin de ARN total, del que ms del 90%
corresponde a ARN ribosmico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt) que no codifican
protenas, y solo el 5% es ARN mensajero (ARNm), que se ha transcrito de los genes
que codifican proteinasa. Para la purificacin del ARN mensajero, se suele aprovechar
la presencia de la cola poli-A (regin rica en adenina del extremo 3 del ARNm maduro)
realizndose cromatografa en columnas con resinas ligadas a residuos poli-T a las que
se unirn las molculas de ARNm. Como en el caso anterior, existen productos
comercializados para facilitar la extraccin de ARN.
La toma de muestras y su buen acondicionamiento para remitirlas al laboratorio,
son pasos esenciales para la obtencin de material adecuado para la determinacin de
las secuencias genticas. En este sentido, debemos recordar que nuestro material de
partida para la prueba, el RNA, es altamente sensible a la degradacin por enzimas
(RNAsas). Debido a la presencia universal de estas enzimas, tanto en materiales
biolgicos como en el ambiente en general, presentamos algunas consideraciones que
tienen como objetivo principal orientar hacia procedimientos de laboratorio que
minimizan la accin de las RNasas presentes en los tejidos o fluidos animales y evitar
la introduccin de RNasas externas. Las RNasas, son enzimas capaces de degradar
completamente el RNA, son extremamente resistentes al tratamiento con diversos
agentes fsicos y qumicos, y estn universalmente presentes en la piel, cabello, pelo y
aerosoles (respiracin) del operador. La extraccin del RNA viral puede hacerse a partir
de diferentes tipos de muestra: epitelio, lquido vesicular, raspado esofgico-farngeo
secreciones nasales, cultivos de clulas, entre otros.
Idealmente, se recomienda inactivar el material biolgico en el mismo momento de la
toma de muestra, mediante la adicin del reactivo TRIZOL. Este reactivo es un
producto qumico preparado a base de fenol y tiocianato de guanidina. Este agente es
altamente txico y corrosivo, por lo cual se recomienda seguir cuidadosamente las
instrucciones del fabricante, para su manipulacin (esencialmente, usar guantes, evitar
la inhalacin de vapores del qumico y el contacto con la piel).

32
Propsito
Extraccin de RNA por el mtodo de tiocianato de guanidina.

Objetivo

Que el alumno desarrolle la habilidad para la extraccin del RNA total partir de
tejido de cerebro y clulas epiteliales.

Materiales
- Solucin de trizol
- Cloroformo
- Etanol absoluto
- Etanol al 75%
- Tejido cerebral
- Clulas Epiteliales descamadas.
- Centrifugadora
- Tubos eppendorf
- Guantes
- Hielo y Cmara de fotografa

Procedimiento

1. Colocar aproximadamente 50-100 mg de tejido en 1 ml de TRIZOL (1ml de trizol

por cada 0.1g de tejido). Macerar y homogeneizar el tejido.
2. Tomar clulas epiteliales exfoliativas. Homogeneizar y centrifugar para descartar
restos de tejido. Recoger el sobrenadante en tubo estril. Por cada 100l de
muestra adicionar 900l de TRIZOL.
3. Pipetear el lisado en un eppendorf e incubar de 5 a 10 minutos a temperatura
ambiente.
4. Agregar 0.2 ml de cloroformo por cada ml. de trizol usado en cada muestra.
5. Mezclar en forma vigorosa durante 15 segundos e incubar a temperatura
ambiente durante 2-3 min. (No utilizar vortex)
6. Centrifugar a 9000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Durante esta
etapa se separarn dos fases; la inferior (rosada) conteniendo el trizol y las
impurezas de la muestra, como protenas, membranas lipdicas, etc y la
superior, acuosa, transparente e incolora, donde se encuentran los cidos
nucleicos.
7. Transferir la fase acuosa (superior, transparente), a un tubo eppendorf nuevo y
adicionar 500l de etanol absoluto (fro 20C) por cada ml de TRIZOL MR,
para precipitar el RNA.
8. Invertir tres veces muy despacio e incubar de 10 a 20 min. a temperatura
ambiente.
9. Centrifugar las muestras a 10.000 rpm durante 15 min. a 4 C.

33
10. Descartar el sobrenadante, con cuidado para no desprender el RNA, que habr
formado un precipitado blancuzco (pellet) en el fondo del tubo. (Guardarlo en
otro tubo en caso de que no se extraiga RNA)
11. Lavar el pellet de RNA con precaucin en 1 ml de etanol al 75%, y luego con
etanol absoluto (esto se hace pasando suavemente el alcohol sobre la superficie
del pellet, pero cuidando que el mismo no se desprenda del tubo).
12. Secar el pellet brevemente al aire.
13. Resuspender el pellet en 20-25l de agua con DPC.
14. Mantener siempre todo en hielo, usar guantes y material preparado
especialmente para RNA.

Determinar la densidad ptica a 260-280 nm y realizar electroforesis en gel de agarosa

al 1%.

Resultados

Anote las observaciones sobre la realizacin del procedimiento.

Reportar la concentracin de cidos nucleicos por medio de la relacin de luz

absorbida a 260/280 nm.

Inserte una fotografa del Gel de agarosa y seale el patrn de bandeo del RNA.

Cuantifique si es posible la concentracin de protenas y de DNA de las

interfases obtenidas durante la extraccin del RNA.

Conclusiones
(Anexe los folios necesarios)

34
Bibliografa:

Molecular Cloning, Tercera Edicin

35
Cuestionario de la prctica 1

1. A que se refiere el termino grado Biologa Molecular?

2. Qu son las diluciones concentradas?

3. Mencione 3 ejemplos de diluciones concentradas.

4. Qu precauciones hay que tomar para la elaboracin de las diluciones?

5. Describa los pasos para lavar la utilera.

Ejercicios:
1.- Cuntos gramos de NaCl se requieren para preparar 10 mL de una disolucin 2
M?

2.-Suponiendo que en el vaso de precipitado donde se prepar una disolucin acuosa

2M de NaCl, quedaron 5 mL y se lava seriadamente con 10 mL de agua, llevando el
lavado al matraz aforado, y que quedan otros 5mL de solucin diluida, para volver a
enjuagar con otros 10 mL de agua, y asi sucecivamente durante siete veces, cul es
la concentracin final de NaCl en el sptimo enjuague?, complete la siguiente tabla:

Tabla 1.1. Clculo del efecto de dilucin en los lavados

Enjuague mL en el vaso (M)1 ML de enjuage (M)2
1 5 2 10 0.67
2 5 0.67 10
3 5 10
4 5 10
6 5 10
7 5 10

36
Cuestionario de la prctica 2

1. Mencione de que esta compuesto un nucletido

2. Cuales son las diferencias entre una purina y una pirimidina?

3. A que se denomina seales analticas y mencione un ejemplo

4. Que provoca la desnaturalizacin del DNA?

5. A que se debe la absorcin lumnica menos aditiva

6. Defina y diga cuales son las diferencias entre pendiente de una recta y coeficiente
de extincin molar.

37
Cuestionario de la prctica 3

1. Cuales son las caractersticas del ndice del crecimiento especfico?

2. Cual es la ecuacin del crecimiento de poblacin?

3. Defina que es la capacidad de soporte.

4. Que genera el limite de crecimiento?

5. Investigue cuales son los componentes de una curva de crecimiento

38
Cuestionario de la prctica 4

1. Describa la composicin del DNA.

2. Porque es imprescindible el orden de las secuencias de las bases nitrogenadas?

3. En que se basa la extraccin de DNA de una muestra celular.

4. Menciona los tipos de extraccin de DNA que existen

5. Mencione brevemente algunas tcnicas de anlisis del DNA

6. Que es una curva Monod?

7. Como se puede relacionar el rendimiento terico con el rendimiento real en una

curva de crecimiento (Relacione en base al contenido de DNA)?

8. Como esperaras que fuera la concentracin del DNA de la levadura que creciste
en la practica anterior?

39
 Cuestionario de la practica 5

1. A que se refiere 50 ug de DNA/mL.

2. Qu es lo que supone la expresin para el calculo de DNA?

3. Mencione dos conversiones espectrofotomtricas

5. Escriba la formula de la Ley de Beer

6. A que se refiere el coeficiente de absorcin molar

40
Cuestionario de la practica 6

1. Cal es el fundamento de la extraccin de RNA por medio de Tiocianato de

guanidina?

2. Qu rendimiento de RNA esperaras al aplicar esta metodologa?

3. Cual es el patrn de bandas de RNA que se espera obtener?

4. Mencin los inconvenientes y precauciones que se deben de tener al extraer

RNA

5. Como identificaras y aislarlas el RNA mensajero

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