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Observacin de mutaciones alares en

Drosophila melanogaster

Jana Peremart
Departamento de Gentica y de Microbiologa
Curso 2012-13

Objetivos

Introduccin al ensayo de mutacin y recombinacin somtica SMART para la


evaluacin de posibles efectos genotxicos de agentes qumicos o fsicos.

Observacin de fenotipos en alas de D. melanogaster debido a distintos eventos


mutacionales.

Estudiar la importancia de efectos biolgicos que pueden inducir la expresin


de alelos mutantes.
INTRODUCCIN
Para esta prctica hay tres conceptos bsicos a tener en cuenta: Genotoxicidad,
dao en el DNA y mutacin.

Genotoxicidad
Capacidad de un agente fsico o qumico para daar el DNA.

Dao en el DNA
Lesiones en la molcula de DNA como roturas o modificaciones qumicas.
Ejemplos:
- Roturas de cadena simple o de doble cadena.
- Modificaciones qumicas en las bases nitrogenadas por mecanismos como
oxidacin, alquilacin, etc.

Existen muchos agentes genotxicos, unos ms potentes que otros, por ejemplo, la
luz ultravioleta puede causar hasta 1x10 lesiones por da (Hoeijmakers, 2009).
Tambin, se ha estimado que el humo del cigarrillo causa 1000 lesiones en el DNA
por clula (Phillips et al., 1988)

Figura 1. Coleccin de tipos de dao del DNA (Modificado de Lord y Ashworth,


2012)
Mutacin:
Cambio en la secuencia del DNA.

Ejemplo 1:

La secuencia de DNA en una clula es: ATGCCTGAA...

Sin embargo, despus de la divisin celular las clulas hijas presentan una
modificacin en dicha secuencia: ATGGCTGAA...

Ha ocurrido un cambio en la cuarta posicin de la secuencia; donde haba


citocina (C), ahora hay guanina (G).

Ejemplo 2:

ATGCCTGAATGCTGCGGAA (secuencia original)

ATGGCTGCGGAA (secuencia en la descendencia, que ha perdido 7


bases, indicadas con negrita en la secuencia original)

El dao en el DNA no se considera una mutacin, sin embargo, se debe tener


en cuenta que el dao en el DNA incrementa la probabilidad de aparicin de una
mutacin.

Ensayo de mutacin y recombinacin somtica


(SMART)

Los ensayos de mutacin y recombinacin somticas en D. Melanogaster son ensayos in


vivo que permiten la deteccin rpida y barata de agentes genotxicos. Se basan en la
deteccin y cuantificacin de eventos mutacionales y recombinacionales en clulas
somticas de un organismo eucariota.

Se han descrito dos sistemas de ensayo diferentes, uno que emplea marcadores de las
alas (Graf et al.,1984) y el otro que emplea marcadores que afectan a la pigmentacin de
los ojos (Vogel y Zijlstra, 1987).
Estas pruebas se basan en la prdida de heterocigosidad de los genes normales en las
clulas de los discos imaginales de las larvas, lo que causa la formacin de clones o
sectores de clulas mutantes, expresndose fenotpicamente en clones mutantes en las
alas o en los ojos de las moscas adultas.

As, el ensayo SMART permite determinar, de manera rpida, el potencial de un agente


qumico o fsico para inducir la prdida de la heterocigosidad (LOH, del ingls Loss of
Heterozygosity).
La prdida de heterocigosidad (LOH) es un mecanismo gentico por el cual una
clula somtica heterocigota pasa a un estado homocigoto o hemicigoto debido a
la prdida del otro alelo en el cromosoma homlogo (Happle, 1999). De esta
manera, puede llevar a la expresin de alelos recesivos (Figura 2).
Una clula puede sufrir la prdida de heterocigosidad debido a una mutacin gnica, re-
ordenamiento cromosmico, rotura cromosmica o prdida cromosmica. (Rodrigues de
Andrade et al., 2004)

Figura 2. La prdida del alelo silvestre (A, en nuestro ejemplo) de una


clula heterocigota permite que la expresin del alelo recesivo (a) sea
evidente en el fenotipo.
SMART en alas (wing spot test)

Este ensayo fue desarrollado por Graf et al, (1984) y constituye el nico ensayo descrito
que utiliza marcadores de alas para el estudio de mutacin y recombinacin somtica.
Este ensayo se lleva a cabo sometiendo a larvas de Drosophila melanogaster a una
exposicin con el agente a evaluar (por ejemplo, diferentes concentraciones de un
compuesto qumico).
En el interior de la larva existen poblaciones celulares llamadas discos imaginales
que durante la metamorfosis darn lugar a las diferentes estructuras de la mosca
adulta, como ojos, antenas, patas, etc. (Figura 3).
Figura 3. Los discos imaginales se encuentran dispuestos en el interior de
la larva. Se indican las estructuras que darn lugar en el individuo adulto
(Morgan, D. (2007). The Cell cycle: principles of control)

Si durante los ciclos de divisin mitticos el agente a evaluar es capaz de daar el


DNA de las clulas que forman los discos imaginales se generaran m utaciones en
los alelos silvestres, de modo que se puede esperar la expresin de los alelos
recesivos de los genes marcadores.
La(s) clulas(s) que sufran la prdida de heterocigosidad darn origen a un clon
celular de tipo mwh o flr3 siendo visibles en la superficie del ala de un individuo adulto
en forma de sectores o spots (Figura 4).
La mutacin mwh se ubica en el cromosoma 3, es recesiva, su origen es espontneo y
resulta viable en homocigosis. Su manifestacin fenotpica se caracteriza por la aparicin
de tres o ms tricomas en cada clula alar en lugar de uno por clula, que es el fenotipo
normal.
La mutacin flr3 est situada tambin en el cromosoma 3, es recesiva y originalmente se
obtuvo por tratamientos con metanosulfonato de etilo; produce letalidad en homocigosis en
la lnea germinal, pero no en las clulas somticas. El fenotipo es bastante variable ya que
se pueden observar desde pelos cortos, gruesos y deformes, hasta pelos amorfos con
aspecto globular.
Figura 4. Dentro de las circunferencias se muestran los sectores o clones
mutantes en la superficie del ala. Note el la diferencia con los pelos
normales alrededor del clon. (Rodrigues de Andrade et al, 2004)

La aparicin de sectores simples (mwh o flr3) indican la ocurrencia de una mutacin


puntual, una alteracin cromosmica o recombinacin mittica. Los sectores
simples se dividen en sectores pequeos (1 2 clulas mutantes) y sectores
grandes (3 ms clulas mutantes). Los sectores pequeos se producen durante
los ltimos ciclos mitticos en la pupa, mientras que los sectores grandes lo hacen
en la etapa larvaria (etapa de ingestin del alimento). Sin embargo, estas
diferencias no son completamente exactas debido a las variaciones en el tiempo
de desarrollo, a las diferentes propiedades farmacocinticas de los agentes
(ingestin, transporte, bioactivacin, tasa de excrecin, etc.) o, incluso porque ciertos
clones pueden tender a permanecer pequeos (Graf et al,1984).
Los sectores dobles (clones mwh y flr3 adyacentes) aparecen nicamente
debido a recombinacin mittica, por lo que indican la accin recombinognica de
un compuesto evaluado (agente qumico o fsico).
El nmero total de clones inducidos en un grupo de individuos (larvas) permite
obtener datos cuantitativos en relacin a la actividad genotxica total del compuesto,
mientras que el tipo y tamao de los clones pueden revelar los mecanismos
mutacionales involucrados en la produccin del clon (Figura 5).

Figura 5. Mecanismos que explican la aparicin de los diferentes sectores


mutantes en el ala (Graf et al, 1984)
Observacin microscpica

1. Anotar y numerar la disposicin de las alas en la lmina portaobjetos.


2. Colocar la lmina con el extremo biselado hacia la derecha de la platina.
3. Buscar y centrar la primera ala del extremo superior izquierdo utilizando el
objetivo de 10 aumentos (10X)

Figura 6. Ubicacin aproximada de las alas en la lmina portaobjetos.

4. Identificar los sectores en los que se divide el ala.

Figura 7. El ala se divide en 7 sectores (A-E, C' y D')

Teniendo en cuenta la lnea vertical en la figura, la parte del ala que se encuentra
a la izquierda, presenta pelos pequeos que no permiten observar la presencia
de los fenotipos flr o mwh.

5. Girar el revlver del microscopio hacia el de 40 aumentos (40X)

6. Obsrvese minuciosamente cada uno de los sectores del ala siguiendo el


orden establecido en el paso 7.

7. La observacin microscpica para cada ala se realiza desde el sector A


hasta el E desplazndose como se indica a continuacin:
Si se est evaluando la capacidad genotxica de un agente, se realiza una
comparacin entre los grupos de tratamiento (que fueron sometidos a diferentes
dosis del agente) con respecto a un grupo control (que no fue sometido al agente).

Bibliografa

Graf U., Wurgler F.E., Katz A.J., Frei H., Juon H., Hall C.B., Kale P.G. (1984)
Somatic mutation and recombination test in Drosophila melanogaster. Environ.
Mutagen., 6: 153-188.

Rodrigues de Andrade H.H., Reguly M.L., Lehmann M. (2004) Wing somatic


mutation and recombination test. En: Drosophila Cytogenetics Protocols.
Henderson D.S. ed. Humana Press. 389-412.

Happle R. Loss of heterozygosity in human skin. J Am Acad Dermatol. 1999


Aug;41(2 Pt 1):143-64. Morgan, D. (2007) The Cell cycle : principles of control.
London. New Science Press.

Hoeijmakers JH. DNA damage, aging, and cancer. N Engl J Med. 2009 Oct
8;361(15):1475-85.

Phillips DH, Hewer A, Martin CN, Garner RC, King MM. Correlation of DNA adduct
levels in human lung with cigarette smoking. Nature. 1988 Dec 22-
29;336(6201):790-2.

Lord CJ, Ashworth A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 2012
Jan 18;481(7381):287-94.
Observacin de cromosomas humanos

Objetivos

Observar la morfologa y nmero de los cromosomas humanos usando una


metodologa de tincin convencional.

Conocer las ventajas y desventajas de las tcnicas citogenticas y su


aplicacin en la clnica y en la investigacin.

INTRODUCCIN

Los cromosomas (del griego, chroma, color y soma, cuerpo) son las estructuras en
que se organiza la cromatina nuclear y que tienen una expresin dinmica en
las distintas fases del ciclo celular.
En la mitosis estas estructuras comienzan un proceso de compactacin que
alcanza su mximo nivel en la metafase. Los cromosomas se tien fcilmente
cuando estn condensados y pueden ser individualizados con el microscopio
ptico.
Cada cromosoma contiene una molcula de ADN lineal asociado a distintas
protenas y el contenido de genes es variable aunque est en relacin con su
tamao. Por eso, cualquier alteracin en el nmero o la estructura de los
cromosomas puede ser causa de enfermedades. Para la deteccin de estas
alteraciones se desarrollaron numerosas tcnicas y todas ellas requieren de un
observador entrenado que las interprete.
La citogentica es la rama de la biologa que se encarga del estudio de la
estructura, organizacin y funcin de los cromosomas, as como de sus
anomalas.
Los avances en las tcnicas de biologa molecular han permitido establecer el
desarrollo de la citogentica molecular, sin embargo la citogentica convencional
acompaa siempre de forma paralela los nuevos estudios.

Cariotipo
Los humanos tenemos un nmero total de 46 cromosomas y este nmero vara
segn las especies. Los 46 cromosomas estn constituidos por 23 pares de
homlogos y cada miembro del par proviene de un progenitor. El cariotipo es
el conjunto cromosmico de un individuo que se puede conocer por medio de la
frmula cromosmica o de una imagen que muestra los cromosomas, conocida
como cariograma.
Los cariotipos se pueden informar presentando todos los pares cromosmicos
ordenados de acuerdo a su tamao, que en un principio eran recortados de la
fotografa de una metafase, y ahora se pueden hacer con analizadores
automticos. De los 23 pares, el par de cromosomas sexuales se seala por
separado para indicar el sexo del individuo. Para citar el cariotipo de un
individuo se indica primero el nmero total de cromosomas y seguidamente los
componentes del par sexual precedido de una coma. As, el cariotipo normal de
un varn se escribe 46,XY y el de una mujer 46,XX. Las anomalas
cromosmicas son una causa ms importante de abortos espontneos, retardo
mental y malformaciones.

Ejemplos:
1. El cariotipo de un varn con un cromosoma 21 adicional se describe con la
siguiente frmula: 47,XY,+21 (Trisoma 21)
2. Una clula que presenta 45 cromosomas, siendo un cromosoma 4 el que
ha perdido, se describe: 45,XY, -4 (Monosoma del cromosoma 4).

Las normas para la descripcin del cariotipo se encuentran en el manual


ISCN (en la bibliografa se cita la versin 2009).
Cromosomas metafsicos
Durante la interfase del ciclo celular, los cromosomas se mantienen sin dividirse y
sin un grado de condensacin elevado. Sin embargo, despus de la fase S (sntesis
de DNA) y al iniciar la etapa de divisin celular, el grado de condensacin es mayor. Al
alcanzar la etapa de metafase, los cromosomas se encuentran en su mximo
grado de organizacin y es en esta etapa donde pueden ser fcilmente visibles al
microscopio ptico bajo una tincin con un colorante bsico.
Cada cromosoma metafsico est constituido por dos cromtides unidas por el
centrmero. Este centrmero o constriccin primaria divide al cromosoma en dos
brazos que se designan p (pequeo) para el brazo corto y q para el brazo largo.
De esa manera, por ejemplo, 7p es el brazo corto del cromosoma 7; e Yq es el
brazo largo del cromosoma Y.
La posicin del centrmero nos permite clasificar a los cromosomas en tres tipos
principales:

1. Metacntricos: cuando el centrmero es ms o menos central y los brazos


son de aproximadamente igual longitud.

2. Submetacntricos: cuando el centrmero est alejado del centro y los


brazos son desiguales.

3. Acrocntricos: cuando el centrmero est cerca de uno de los extremos y


uno de los brazos es muy corto.

Sobre alteraciones en los cromosomas


Existen cuadros clnicos asociados a un nmero diferente de 46 en la especie
humana, por ejemplo (probablemente los ms conocidos):

47,XX,+21 o 47,XY,+21 est asociado al sndrome de Down.


45,X Sndrome de Turner.
47, XXY Sndrome de Klinefelter.
47,XX,+13 Sndrome de Edwards
47,XX,+18 Sndrome de Patau
Existen alteraciones en la morfologa de los cromosomas que tambin estn
asociadas a otros cuadros clnicos, por ejemplo, el Sndrome de Lejeune (cri du chat
/maullido de gato). Las personas con este sndrome presentan una delecin
(prdida) de una parte del brazo p de uno de los cromosomas 5 (46,XX,5p-
46,XY,5p-).
Un espectro amplio de alteraciones numricas y estructurales de los
cromosomas son frecuentemente observadas en clulas cancergenas.

En la especie humana, no todas las alteraciones en la morfologa de los


cromosomas estn, asociadas a un cuadro clnico. Por ejemplo, la regin
pericntromrica (alrededor del centrmero) de los cromosomas 1, 9 y 16, as como
el brazo q del cromosoma Y suelen tener diferencias de tamao entre los individuos.
Estas variantes se encuentran en un porcentaje mayor al 1% en la poblacin por lo
que se definen como polimorfismos cromosmicos.

El bandeo cromosmico

Con la tcnica convencional de tincin con Giemsa los cromosomas se tien


intensamente y de forma homognea y se los puede contar y agrupar por su
aspecto general y eso era lo nico que se poda hacer en los primeros cariotipos.
La identificacin de cada cromosoma vino posteriormente con las tcnicas de
bandeo. Estas tcnicas que generan bandas transversales permiten definir a cada
cromosoma y estudiar su estructura. Cada cromosoma tiene del patrn de bandas
caracterstico y existen varias tcnicas de tincin con fines especficos (Tabla I).
El bandeo G es el ms utilizado en citogentica clnica.
El bandeo G se logra con un tratamiento controlado con tripsina antes de la
coloracin con Giemsa y produce bandas claras y oscuras en los cromosomas.
Las bandas oscuras contienen ADN rico en bases A-T que replica tardamente y
son pobres en genes constitutivos y las bandas claras contienen ADN rico en G -C
que replica tempranamente y tienen muchos genes constitutivos. Cuando un
cromosoma est ms elongado puede mostrar un mayor nmero de bandas y
esto se aprovecha para estudiarlo con mayores detalles. Esta metodologa que
permite buscar alteraciones estructurales mnimas se conoce como bandeo de
alta resolucin y se logra sincronizando el cultivo y con preparaciones hechas en
profase o prometafase, es decir, antes que los cromosomas alcancen su
compactacin mxima.

Figura 1. Cromosomas humanos con tincin homogenea de Giemsa (a) y tincin


por Bandas G (b).
Observacin microscpica

Una vez colocada la lmina portaobjetos en la platina del microscopio, desplace la


misma de manera que el objetivo de 10X (16X en algunos microscopios) permita la
observacin de la primera gota desde la izquierda de la lmina como se muestra
en la figura siguiente.

= Lugar aproximado para iniciar la observacin microscpica

Mueva el revlver del microscopio para el uso del objetivo de 40X. Observe a travs
de los oculares y desplace la platina cuidadosamente como se indica a
continuacin con la finalidad de encontrar placas metafsicas.

Una vez encontrada una placa metafsica, desplace el revlver del microscopio de
tal manera que lo que desea observar en la lmina portaobjetos se encuentre
entre los objetivos de 40X y 100X. Coloque una gota mnima de aceite de inmersin
en la zona que se desee visualizar. Mueva el objetivo de 100X hacia la gota y
enfoque moviendo suavemente el tornillo micromtrico.

Cuente el nmero de c romosomas.


Identifique la morfologa de los cromosomas observados al microscopio
usando como gua la descripcin de la Figura 1 Morfologa de los cromosomas
metafsicos.
Figura 2. Morfologa de los cromosomas metafsicos

p
s

Metacntrico Submetacntrico Acrocntrico

cro: c romtida. (Cada cromosoma metafsico presenta dos cromtidas hermanas)


p: brazo p
q: brazo q
c: centrmero (cada cromtida presenta una secuencia centromrica)
s: satlite. Los satlites corresponden a regiones involucradas en la organizacin
del nucleolo. Estas regiones se condensan tardamente por lo que es posible
observar una fibra de cromatina en cromosomas metafsicos.
Bibliografa

- Lewis (2003) Human Genetic: Concepts and Applications, 5th Edition. The
McGrawHill.
- Guerra, MS. Reviewing the chromosome nomenclature of Levan et al. Rev. Bras.
Genet. 1986, 9: 741-743.
- ISCN 2009: International System for Human Cytogenetic Nomenclature:
Recommendations of the International Standing Committee on Human Cytogenetics
Nomenclature. Lisa G. Shaffer (Author, Editor), Marilyn L. Slovak (Editor), Lynda J.
Campbell (Editor)
- Harper, Peter S. First years of human chromosomes: the beginnings of human
cytogenetics. Bloxham: Scion, 2006