FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGA

Licenciatura en Biotecnologa

Laboratorio de Procesos Biotecnolgicos

Prctica 2
Mtodos para el rompimiento celular

Equipo
Arellano Perdomo Paulina
Prez de Len Winter Jorge Emmanuel
Valladares Tovar Jos Miguel

6 semestre

M en C. Ral Reyes Bautista

23 de febrero de 2016

Introduccin
Algunos

productos

biotecnolgicos

producidos

escala

industrial

son

extracelulares y no requieren ser extrados de la clula. Cuando el producto de

inters es intracelular, una vez realizada la cosecha de clulas una operacin
necesaria para la liberacin del producto es el rompimiento de la clula misma.
Una gran variedad de tcnicas de rompimiento celular son utilizadas en laboratorio
para garantizar la obtencin de productos citosolicos, estos mtodos se pueden
dividir en qumicos, mecnicos, y enzimticos. La recuperacin ptima de
productos intracelulares requiere del conocimiento de la estructura de las capas
externas que protegen a la clula, la membrana y la pared celular (Huerta, 2010)
El rompimiento por choque osmtico se fundamenta en el conocimiento del
fenmeno de smosis. Cuando una membrana semipermeable separa dos
soluciones de diferente concentracin, se produce un movimiento neto de agua
atraves de la membrana hacia el compartimento que contiene el soluto ms
concentrado. La presin osmtica es la fuerza que debe aplicarse para
contrarrestar la fuerza de flujo osmtico producido. La presin osmtica es una
propiedad coligativa de las soluciones; depende del nmero de partculas de
soluto por unidad de volumen pero es independiente de la naturaleza molecular
del soluto y de la forma de sus partculas. La factibilidad del uso de este mtodo
depende de la resistencia mecnica de las clulas de inters (Tejeda, 2009)

Otro mtodo utilizado para el rompimiento de las clulas, es el uso de

enzimas que daan la pared. Una de las enzimas ms utilizadas es la lisozima que
rompe enlaces B 1-4 entre el cido N-acetilmurmico y la N-acetil glucosamina de
la capa de peptidoglucano de la parred celular, provocando el rompimiento de la
pared y consecuentemente la ruptura de la clula. A pHs menores de 5 la clula
no se rompe aun cuando la pared celular haya sido destruida por digestin. Esto
se debe a la baja solubilidad del protoplasma a estos niveles de pH. El alto costo
de las enzimas no permite que esta tcnica sea usada ampliamente en el
rompimiento celular a nivel industrial a pesar de ser ampliamente selectiva.
(Andrews et al, 1990)
Objetivos
Objetivo General
Determinar la concentracin de protena total y protena liberada por los mtodos
de ruptura celular como choque osmtico y por mtodos enzimticos como el uso
de lisozima en comparacin a la ruptura sin tratamiento.
Objetivos especficos
Comprender el mecanismo de accin de la lisozima utilizada durante el proceso de
ruptura celular por mtodos enzimticos
Comprender el mecanismo de osmosis que se lleva a cabo en la clula para lograr
la ruptura de forma eficiente
Utilizar el mtodo de Bradford para realizar la determinacin de protenas
extradas durante el rompimiento de las clulas.
Material y mtodo
Obtencin de suspensiones celulares en medio libre de protenas.
Se cuantifico el porcentaje de protenas citoslicas celulares liberadas en el medio,
para lo que fue

necesario obtener suspensiones celulares en medios que no

contuvieran protenas. La mayora de

los medios de crecimiento de clulas

contienen protenas como fuente de N y C, por lo tanto fue necesario lavar las
suspensiones celulares de la siguiente forma:
-

La suspensin de E.coli se centrifugo a 8.000 rpm durante 5 min

La sangre se centrifugo a 2.000 rpm 10 min
Descarto el sobrenadante y resuspendi el pellet en medio A.

Choque Osmtico
Tras la incubacin a 37 C se distribuy el volumen de cada muestra en 2 tubos
eppendorf rotulados (- choque) y (+ choque)
Se centrifugaron los tubos a 14.000 rpm durante 10 min, despus se
resuspendieron los precipitados en 1 ml de medio A, las muestras rotuladas (choque) medio B, las muestras rotuladas (+ choque)
Se incubaron a 10 min y despus se centrifugaron de nuevo a 14.000 rpm, durante
30 min se recuperaron y guardaron los sobrenadantes en tubos previamente
etiquetados.
Eritocitos
Escherichia coli
(-) Choque (+) Choque (-) Choque (+) Choque

Se repiti el lavado 3 veces y resuspendi finalmente las clulas en 2 ml de medio

A.
Determinacin de la concentracin de protena total y protena liberada por cada
mtodo de ruptura celular: eficacia de la ruptura.
La concentracin de protena se determin por el mtodo de Bradford. Se midi la
cantidad de protena en el sobrenadante de las 8 muestras que se describieron.
Resultados
Tabla 1. Datos de la curva patrn de la albmina.

Curva patrn albmina

1
f(x) = 0.09x + 0.04
R = 1

0.8
0.6

Abs

0.4
0.2
0

10

12

Albmina (mg/mL)
Abs

Linear (Abs)

Figura 1. Curva patrn de la albmina, esta se toma como referencia para sacar la
concentracin de protenas del experimento.
Tabla 2. Muestra de sangre A con choque osmtico (-), representa la
concentracin de protena que hay en el medio y la absorbancia.

Tabla 3. Muestra de sangre B con choque osmtico (+), representa la

concentracin de protena que hay en el medio y la absorbancia.

Tabla 4. Muestra de E. coli con choque osmtico A (-), representa la concentracin

de protena que hay en el medio y la absorbancia.

Tabla 5. Muestra de E. coli

con choque osmtico B (+), representa la

concentracin de protena que hay en el medio y la absorbancia.

Discusin de resultados
El mtodo de Bradford se fundamenta en que la unin de las protenas al
colorante azul brillante Coomassie G-250 provoca un desplazamiento del mximo
de absorcin de este compuesto, las medidas de absorbencia del complejo
protena colorante es a 595 nm (Roca, Oliver & Rodrguez, 2003). En nuestros
resultados la sangre daba un complejo de color azul brillante y las muestras de E.
coli tenan un color azul fuerte, esto es debido a que no se detect protena ya que
hay muy poca concentracin en comparacin a la sangre que si se detect en la
disolucin de 1:20 midiendo la absorbancia.
Uno de los mtodos enzimticos de ruptura celular ms importantes es el
empleo de la lisozima, esta es una protena cida que hidroliza los enlaces -1-4

entre el cido N- acetilmurmico y el N- acetilglucosamina, en la capa

peptidoglucana de la pared bacteriana. Est accin enzimtica incrementa la
permeablidad de las membranas celulares bacterianas resultado en cambios
osmticos y electroltico, esto se da especialmente en las bacterias gram +
(Gutirrez, 2006). Est parte del experimento no se pudo realizar debido a que no
se encontraba esa enzima en el laboratorio pero los resultados en la sangre no se
lisarian a los eritrocitos debido a que en la sangre hay lisozima que protege al
cuerpo de las bacterias Gram +, en la bacteria E.coli tampoco hidrolizara los
enlaces debido a que esta es una bacteria Gram y estos enlaces -1-4 entre el
cido N- acetilmurmico y el N- acetilglucosamina se encuentran en la capa
petidoglucana de la pared bacteriana de Gram.
Las protenas que se encuentran en las clulas estudiadas se separan
mediante centrifugacin en el cual las protenas deseadas permanecern en el
sobrenadante. Las protenas citoplasmticas primero deben liberarse de las
clulas para esto es necesario la rotura de las clulas como el choque osmtico
con disoluciones hipotnicas (Mller, 2008). En el choque A haba una misma
concentracin de sales por dentro y por fuera de las clulas el cual no produce
ninguna lisis celular y por consecuente no hay alta concentracin de protenas en
el medio como se puede ver en los resultados dela tabla 2 que si hay
concentracin de protenas en la sangre en la disolucin 1:20, esto quiere decir
que comparando esos resultados con la grfica 1 este si entro en la curva patrn
indicando presencia de albmina en el medio, en comparacin con las dems
disoluciones estn no entraron en la curva patrn debido a que se realizaron mal
los lavados y se perdi concentracin de protena en el medio. En la tabla 4 se
supone que deba dar baja concentracin de protena pero entrar en la curva
patrn de la figura 1 pero estas muestras no se lavaron correctamente lo cual
hubo perdida de protena y no resulto como deba.
Los choques B haba diferentes concentraciones salinas en el medio y en la
clula, esto hizo que estallara y sacara las protenas al ncleo, el cual en la tabla 2
se puede observar que tuvo una menor concentracin de protenas que en el

choque B y este resultado es errneo debido a que en la lisis celular se esperaba

una mayor concentracin de protenas en el medio, el dato 1:20 si entro en la
curva patrn de la albumina y los dems no entraron debido a que los lavados no
se hicieron de manera correcta y hubo perdida de protenas. En la tabla 5 se
puede observar que tambin hubo una menor concentracin de protenas las
cuales no entraron en la curva patrn de la albmina lo que quiere decir que hubo
prdida de protenas al realizar el lavado celular pero este tena que tener mayor
concentracin de protenas presentes en el medio que el de la tabla 4.

Conclusiones
-

Estudiar

la

estructura

funciones

metablicas

de

los

distintos

compartimentos celulares, requiere primero aislarlos del interior de la celula

y esto se logra mediante la ruptura de la pared y membrana celular

Se esperaba obtener una mayor cantidad de protenas en las clulas

lisadas por choque osmtico que en aquellas que no fueron sometidas a la
solucin debida a que la pared celular de Escherichia coli y la membrana de
los eritrocitos no iba a resistir los cambios en la presin.

Existen ciertos mecanismos de osmoregulacin en las clulas que les

permiten adaptarse a los cambios en su medio, ya sea por la saturacin de
ciertos compuestos (solucin hipertnica) o por la disminucin de este
mismo (solucin hipotnica).

La lisozima se utiliza nicamente para la ruptura de la pared celular de

Bacterias, por lo que no es recomendable usarse si se desea romper algn
otro tipo de clula.

Referencias
Andrews, B. A., Huang, R. B. y Asenjo, J. A. 1990. Differential product release from
yeast cells by selective enzymatic lisis. En: Separations for Biotechnology. Pyle,
D.L. (Ed.). Elsevier Aplied Science. England. 21-28
Gutirrez, S. (2006). Fundamentos de ciencias bsicas aplicadas a la odontologa.
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2016

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Tejeda y cols., (2011) Bioseparaciones. Recuperado el 21 de febrero de 2016 en:

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