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QBI
TCNICAS DE
LABORATORIO
TECNICAS DE LABORATORIO
SOLUCIONES: Concentracin
Cantidades, unidades y dimensiones
El Sistema Internacional de Unidades (SI) fue creado en 1960 por la Conferencia
General de Pesos y Medidas para estandarizar las unidades de medida basadas en el
sistema mtrico. De esta manera, SI permite la comunicacin entre cientficos de
diferentes disciplinas y diferentes pases sin la necesidad de conversin de unidades de
medida. El conocimiento de las cantidades, unidades y dimensiones es esencial para
comprender cmo se llevan a cabo los clculos biomoleculares.
Una cantidad es una propiedad medible de un sistema definido (masa, temperatura,
energa). Una unidad es una cantidad de un tamao definido que se utiliza como
referencia para otras cantidades del mismo tipo (kilogramo, mol). Una dimensin es
una cantidad fsica descripta por el producto de smbolos con los exponentes apropiados
(m3, mol/dm3).
Reglas bsicas para el uso correcto de unidades y dimensiones
Indicar todos los valores con sus correspondientes unidades; la relacin de valores
que tienen las mismas unidades se deben indicar sin unidades ya que las mismas se
cancelan.
Sumar o restar slo aquellos valores que tienen las mismas unidades.
No se deben hacer comparaciones de valores con diferentes dimensiones.
Se debe asignar a una determinada variable las mismas unidades a travs de todos
los clculos.
Multiplicar o dividir unidades cuando se dividen o multiplican valores; luego incluir
el producto o cociente de las unidades con el resultado calculado.
Multiplicar o dividir unidades en cada paso de un clculo; no esperar hasta el final
del clculo para deducir cuales sern las unidades finales.
La pendiente de una curva tendr las dimensiones de y dividida por aqullas de x.
Multiplicar valores tabulados o graficados por 10 o el mltiplo ms adecuado para
evitar trabajar con nmeros muy grandes o muy pequeos.
Las dimensiones del lado izquierdo de una ecuacin deben ser iguales a aqullas del
lado derecho.
El anlisis de las unidades despus de cada paso de un clculo permite detectar
errores cometidos durante el clculo.
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Unidades de concentracin
En SI, el uso de mol l-1 y las unidades relacionadas se acepta para la expresin de
concentraciones sobre la base de cantidades de sustancia por unidad de volumen. Un
mol se define como la cantidad de sustancia que contiene las entidades elementales
equivalentes a los tomos presentes en 0.012 kg de carbono-12. Se ha demostrado
experimentalmente que 0.012 kg de carbono-12 contienen 6.02217 x 1023 tomos. Este
nmero es el nmero de Avogadro y se utiliza para definir el mol de cualquier unidad
elemental tal como tomo, molcula, in, protn o electrn. Un mol puede ser tambin
definido como el equivalente del peso molecular (ms correctamente a la masa
molecular en g) de una sustancia. Por lo tanto, el peso de una sustancia (su masa) y
moles pueden ser interconvertidos como se muestra en las siguientes ecuaciones:
nmero de moles
peso molecular =
peso en g
peso molecular
peso en g
nmero de moles
Concentracin molar, mol l-1, el nmero de moles por litro (M) puede
expresarse como una funcin de las cantidades relativas de acuerdo a las siguientes
relaciones:
Molaridad, M = moles de soluto
1 litro solucin
Nmero de moles = volumen en l x moles l-1
Peso en gramos = nmero de moles x Peso molecular
Peso molecular =
peso en g
nmero de moles
TECNICAS DE LABORATORIO
TECNICAS DE LABORATORIO
Tambin se designa A como " densidad ptica", esta magnitud vara de cero para
I = Io (absorcin nula) hasta para I = 0 (absorcin total).
La constante k es el coeficiente de extincin (o absortividad).Es una
caracterstica intrnseca de cada sustancia y depende de la longitud de onda, sus
unidades dependen de las utilizadas para c y b:
b: ancho de la cubeta (camino ptico de la solucin)
c : concentracin
.coeficiente de extincin molar
coeficiente de extincin molar especfico
cm
M (g/l)
M-1 cm-1
1 g-1 cm-1
0.01-15 nm
15-200 nm
200-400 nm
400-800 nm
800-2500 nm
TECNICAS DE LABORATORIO
ESPECTROFOTOMETRO
Instrucciones de manejo:
TECNICAS DE LABORATORIO
AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE PROTENAS
Algunas consideraciones generales:
* Cualquier clula, tanto procariota como eucariota, contiene miles de protenas
diferentes con un amplio rango de actividades biolgicas. La purificacin de una
protena individual es una cuestin central para llevar a cabo el anlisis biolgico
detallado de su estructura y funcin. No existe un nico procedimiento para poder aislar
en forma pura cada una de las protenas, pero existen metodologas que permiten
distinguir a las protenas en base a caractersticas estructurales y funcionales especficas.
Seleccionando procedimientos apropiados y aplicndolos en una determinada secuencia,
usualmente es posible obtener un alto grado de purificacin de la protena en estudio y
un aceptable rendimiento. No existe un orden estndar en la aplicacin de los diferentes
procedimientos para obtener ptimas purificaciones. Debido a las diferencias
estructurales y funcionales entre protenas, una secuencia ideal para una protena puede
no tener xito en la purificacin de otra protena. El conocimiento de las bases tericas
de cada procedimiento permite al investigador elegir una secuencia inicial de tcnicas a
aplicar para la purificacin. De todas maneras, la puesta a punto de un protocolo
involucra experimentos de ensayo y error.
Independientemente del esquema de purificacin elegido, es esencial tener
presente que la mayora de las protenas son molculas excesivamente frgiles. La
exposicin an a temperaturas moderadas (ejemplo, 37C) causa desnaturalizacin, por
lo tanto, todos los pasos deben realizarse a bajas temperaturas (0-4C). Las protenas
son tambin sensibles a pHs extremos por lo que todos los pasos de purificacin se
realizan en soluciones buffer y se evitan los pHs extremos.
Equipamiento requerido:
* Adems del equipamiento usual en la mayora de los laboratorios, tales como
pHmetros, balanzas y agitadores magnticos, la purificacin de protenas requiere un
equipamiento ms especializado.
* A los efectos de minimizar la desnaturalizacin y protelisis algunos de los
pasos de la purificacin deben llevarse a cabo a 4C. Se necesita un cuarto fro para
llevar a cabo la dilisis, precipitaciones y cromatografas. Para almacenar muestras por
perodos cortos se requiere hielo granizado, por lo tanto es necesaria una granizadora de
hielo. Para almacenar muestras y buffers son necesarias heladeras (4C), freezers (-15C
a -20C). En algunos casos, para preservar la actividad de muestras almacenadas es
necesario conservarlas en freezer a -70C.
* Espectrofotmetros que cubran un rango de 205 a 850 nm son esenciales para
cubrir un amplio espectro de protenas. En algunos casos, la medicin de actividad de
enzimas requiere contar con un registrador.
* Algunas protenas especficas requieren equipamientos tales como contador de
centelleo, lector de ELISA, HPLC, etc.
* La electroforesis se utiliza habitualmente para evaluar la purificacin de una
protena. Se requieren fuentes de poder y los diferentes equipos de electroforesis, segn
el tipo de separacin a realizar.
* Para extraer las protenas de su fuente son necesarios equipos de
homogenizacin (se discutirn mas adelante). Para clarificar los homogenatos se
necesitan centrfugas. Estas deben estar refrigeradas, y deben alcanzar fuerzas
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centrfugas de 15000 g y deben cubrir un rango de 100 ml a pocos litros. Son muy tiles
adems, las centrfugas para tubos de 1.5 ml (Eppendorf)
* Para las cromatografas se requieren, colectores de fracciones, monitores y
registradores, bombas peristlticas y columnas de diferentes tamaos. El rango de
tamao de diferentes columnas debe cubrir aquellos necesarios para intercambio inico
y cromatografas de afinidad (relativamente cortas y gordas) y las que se usan para
filtracin en gel (relativamente largas y finas).
* Dentro del equipo ms especializado necesario para estudios especficos, se
pueden mencionar los analizadores de aminocidos y secuenciadores de protenas,
FPLC, HPLC, etc.
Buffers:
* En todos los pasos de una purificacin es necesario controlar el pH de la
solucin para evitar la desnaturalizacin o inactivacin de la protena.
* Los factores que se deben tener en cuenta para la eleccin de un buffer son los
siguientes:
+ El pH deseado.
+ Si el buffer es aninico o catinico. Por ejemplo, para una cromatografa de
intercambio aninico se debe usar un buffer catinico (por ejemplo, Tris y no fosfato)
+ Variacin del pH con la fuerza inica y la temperatura.
+ La reactividad qumica. Por ejemplo las aminas primarias como el Tris pueden
interferir con el anlisis de protenas o pueden inhibir algunas enzimas.
+ Absorcin a 280 nm.
Costo. Especialmente si se utiliza en grandes escalas.
+ Solubilidad.
* Un "buen" buffer es biolgica y qumicamente no reactivo, no txico, no
absorbe en la regin del UV y tiene una mnima dependencia con la temperatura y
fuerza inica.
Mtodos de extraccin:
* Los primeros pasos en un procedimiento tpico de extraccin consisten en el
lavado del tejido y la aplicacin de un mtodo de lisis. Luego una centrifugacin
permite separar la protena soluble de las fracciones de membrana y de los restos
celulares. Finalmente, la muestra de protena puede ser analizada, purificada o
almacenada.
* El tejido se lava con una solucin salina para eliminar trazas de material
extracelular.
* El extracto obtenido luego de la lisis se denomina homogenato.
Habitualmente se centrfuga de 10 min a 15000 g a 1 hora a 100000 g. El sobrenadante
se denomina extracto crudo y el pellet contiene la fraccin de membrana.
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* Las clulas animales estn rodeadas exclusivamente por la membrana
plasmtica y mantenidas por el citoesqueleto. Por lo tanto no tienen la rigidez de las
bacterias y levaduras. Esta fragilidad y su relativo gran tamao simplifican la lisis.
* Las clulas vegetales tienen una pared compuesta por carbohidratos complejos
insolubles, ligninas o ceras que rodean la membrana plasmtica.
Microfibrillas de celulosa cubren la membrana y le dan cierta proteccin contra
la ruptura, aunque el tamao las hace algo ms vulnerables. En las vacuolas hay
compuestos fenlicos que se liberan durante la extraccin y que pueden inactivar
protenas. Por lo tanto es esencial una extraccin muy rpida de la protena en inters.
* Las bacterias tienen una pared celular constituda por un pptido glicano que le
otorga fuerza y rigidez. Se utiliza frecuentemente lizosima en un medio isotnico para
romper el pptidoglicano.
* Homogenizacin: es una de las formas ms comunes de lisarlos tejidos
blandos. Se puede llevar a cabo con una licuadora o con un homogenizador PotterElvenhjem. Es un mtodo rpido y relativamente poco daino para las protenas. Las
principales precauciones que hay que tener se relacionan con la liberacin de proteasas
de otros compartimientos celulares y con la liberacin de calor.
* Sonicacin: un sonicador lisa tejidos generando vibraciones que causan
ruptura mecnica de la pared celular. Se utiliza generalmente para bacterias.
* French Press: este mtodo permite la lisis de las clulas sometiendo la
muestra a alta presin e inmediatamente liberarla a presin atmosfrica. El rpido
cambio de presin causa la ruptura celular. Se utiliza fundamentalmente para bacterias y
levaduras.
* Moler con arena: La molienda de clulas con abrasivos se utiliza
frecuentemente para organismos unicelulares y tejidos vegetales. Los materiales son
econmicos (mortero, arena u otro abrasivo).
* Tratamiento enzimtico: la digestin de la pared celular con enzimas
(lisozima, por ejemplo) se utiliza generalmente para microorganismos ya que las clulas
en suspensin permiten un tratamiento relativamente uniforme.
* Otros mtodos de lisis: + lisis de clulas animales en cultivo con detergentes.
+ Lisis por shock osmtico, sometiendo a las clulas a una solucin hipotnica. Se
utiliza comnmente para glbulos rojos y otras clulas sin pared celular. + Lisis por
congelado y descongelado: se puede lograr la lisis mediante la aplicacin de varios
ciclos de congelado y descongelado. Este mtodo se puede aplicar si la protena es
estable y resiste la desnaturalizacin. Se debe proteger contra la protelisis.
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Fraccionamiento subcelular:
El fraccionamiento subcelular implica dos procesos:
a- ruptura de la estructura celular
b- separacin de las distintas
centrifugacin diferencial.
subestructuras
con
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Determinacin de la concentracin de protenas:
* Muchas veces es til, aunque no esencial, determinar la concentracin total de
* Es importante recordar que todos los mtodos empleados para la
determinacin de la concentracin de protenas son semicuantitativos. La respuesta de
las protenas, por ejemplo en el desarrollo del color en un ensayo espectrofotomtrico,
vara con la composicin de aas y puede ser influenciado por la presencia de grupos
prostticos no proteicos, tales como carbohidratos. De tal forma que, si bien la
seroalbmina bovina (BSA) se utiliza universalmente como protena standard para las
cuantificaciones, es preferible, cuando esto es posible, calibrar el ensayo usando una
muestra de la protena purificada o una protena que rinda una coloracin similar.
* Absorbancia a 280nm: La mayora de las protenas exhiben un mximo de
absorcin a 280nm que se atribuye al grupo fenlico de la tirosina o al grupo indlico
del triptofano. El coeficiente de extincin a 280 nm vara de protena en protena en el
rango de 0.4 a 1.5 dependiendo de la composicin de aas. Existen casos extremos en el
que el coeficiente de extincin es 0 (protenas que ligan calcio) y 2.5 (lisozima). Se
trata, por lo tanto, de un mtodo poco preciso. Esta tcnica es relativamente poco
sensible y requiere entre 0.05 y 2 mg de protena. Es particularmente sensible a las
interferencias de otros compuestos que absorben a 280 nm, especialmente cidos
nucleicos. La ventaja de ste mtodo es que es muy rpido y no destructivo, por lo tanto
la muestra puede ser usada para otras determinaciones. Se requieren cubetas de cuarzo.
* Mtodo de Biuret y Biuret: bajo condiciones alcalinas el in cobre (II) se une
al nitrgeno del enlace peptdico de protenas y pptidos desarrollando una coloracin
violeta con un mximo de absorcin a 540-560 nm. No da interferencia con aas libres y
tiene poca dependencia de la composicin de aas. Ya que el reactivo de cobre reacciona
con el enlace peptdico y no con las cadenas laterales de los aas la mayor desventaja del
mtodo es su baja sensibilidad (1-10 mg/ml de protenas). Algunos buffers (Tris, por
ejemplo) pueden interferir con la reaccin.
* Se logra ms sensibilidad leyendo a 330 nm (rango 0,1-1 mg)
* Mtodo de Lowry: es el mtodo ms utilizado. El fundamento del mtodo se
basa en la reduccin del reactivo de Folin por la oxidacin de aas aromticos en una
reaccin catalizada por cobre. La reaccin da una fuerte coloracin azul y es ms
sensible que el mtodo de Biuret (0.1 a 1 mg/ml). La eaccin depende del pH (10-10.5).
La reaccin tiene una moderada dependencia con la composicin de aas pero tiene
muchos compuestos que interfieren (aas, buffers, lpidos, azcares, cidos nucleicos).
* Mtodo de Bradford: Bajo apropiadas condiciones, los grupos acdicos y
bsicos de las protenas interaccionan con grupos disociados de colorantes orgnicos
para formar precipitados coloreados. En ste mtodo se utiliza el colorante Coomasie
Blue G-250. La unin del colorante a la protena causa un cambio en el mximo de
absorcin del colorante de 465 nm (rojo) a 595 nm (azul). Es un mtodo rpido y
simple. Es muy sensible (5-100 g/ml). Tiene una significativa dependencia con la
composicin de aas debido a la unin primaria a grupos bsicos (especialmente
argininas) y a residuos aromticos.
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Eleccin de los mtodos de purificacin:
* Hay numerosos mtodos de purificacin disponibles, aunque algunos se
utilizan mucho ms frecuentemente que otros. A continuacin se mencionan algunos
criterios para la aplicacin de una determinada secuencia de los mtodos.
a) Los primeros pasos en un esquema de purificacin son frecuentemente
aquellos que tienen menor poder de resolucin tales como la precipitacin con sulfato
de amonio o para algunas protenas, la desnaturalizacin por calor. Estos mtodos tienen
la ventaja de reducir notablemente la cantidad de protena total en la muestra.
Los mtodos de alta resolucin pero baja capacidad (ejemplo isoelectroenfoque) se
aplican en la parte final del esquema de purificacin, cuando la cantidad de protena
total es baja y las protenas contaminantes estn en muy bajas concentraciones.
b) En general es ms eficiente utilizar una serie de mtodos que exploten
propiedades fsicas y funcionales de las diferentes protenas, ms que una serie de
mtodos que exploten las mismas propiedades. As, cuando se utilizan tcnicas
cromatogrficas, se debe incluir al menos un fraccionamiento por peso molecular
(filtracin en gel) y al menos un paso de fraccionamiento por carga (cromatografa de
intercambio inico).
c) Durante la cromatografa es comn sacrificar algo de rendimiento para
aumentar la pureza. En otras palabras, no hay que tratar de recuperar toda la protena en
estudio si esto significa incluir cantidades relativamente grandes de protenas
contaminantes.
d) Algunas tcnicas, en particular SDS-PAGE (electroforesis en geles de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes), isoelectroenfoque y geles
bidimensionales, no se emplean comnmente como mtodos preparativos para la
purificacin de protenas, sino que usualmente se emplean para analizar el progreso de
la purificacin. Son tcnicas analticas de gran resolucin.
Procedimientos experimentales:
Desnaturalizacin por calor: La purificacin de protenas se lleva a cabo
habitualmente a bajas temperaturas ya que la mayora de las protenas son estables entre
0 y 4C. A medida que la temperatura se incrementa desde 0 a 37-40C su estabilidad
decrece significativamente. Sobre los 40C la mayora de las protenas son altamente
inestables, se desnaturalizan y usualmente precipitan. Sin embargo, cada protena
individual difiere en la sensibilidad al calor. La estabilidad a la temperatura de una
enzima se determina experimentalmente en extractos despus de la incubacin a
diferentes temperaturas a varios tiempos. Si la protena en estudio es resistente a
relativamente altas temperaturas, este tratamiento podr ser utilizado como paso de
purificacin.
Precipitacin con sulfato de amonio: La solubilidad de las protenas vara de acuerdo
a la fuerza inica y por lo tanto de acuerdo a la concentracin de sales de la solucin. Se
pueden observar dos efectos diferentes. A bajas concentraciones de sales, la solubilidad
aumenta cuando se incrementa la concentracin de sales. Este fenmeno se denomina
"salting-in". Sin embargo cuando la concentracin de sales aumenta mucho la
solubilidad de las protenas decrece y en un punto determinado toda la protena
precipita. Este fenmeno se denomina "salting-out". Las bases tericas del "Salting-out"
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son complejas pero un factor es probablemente la competencia entre la protena y los
iones por el agua disponible. A altas concentraciones de sales, no hay suficientes
molculas de agua disponibles para una completa solvatacin de las protenas y por lo
tanto las interacciones protena-protena son predominantes sobre las interacciones
agua-protena y ocurre la precipitacin. Ya que las protenas difieren marcadamente en
su solubilidad a alta fuerza inica, salting-out es un procedimiento muy til para la
purificacin de protenas. La precipitacin con sulfato de amonio se emplea
frecuentemente como uno de los primeros pasos en el esquema de purificacin.
Filtracin en gel: Un amplio rango de biomolculas pueden separarse sobre la base de
sus diferencias de tamao y forma. Este procedimiento se conoce con el nombre de
cromatografa de exclusin molecular o filtracin en gel. Se pueden utilizar una amplia
gama de matrices formadas por bolitas porosas de material inerte y altamente hidratado.
Las matrices comerciales ms comunes son Sephadex (bolitas de dextrano), Sepharosa y
Bio Gel A (agarosa) y Bio Gel P (poliacrilamida). Cada matriz tiene un rango de de
fraccionamiento que est determinado por el tamao del poro de las bolitas. As por
ejemplo, Sephadex G-50 tiene un lmite de exclusin de 30.000, lo que significa que
todas las protenas cuyo PM sea superior a 30.000 no podrn penetrar en el interior de
las bolitas y sern eludas primero, en lo que se denomina volumen muerto de la
columna. Las protenas de menor PM quedarn incluidas en la matriz. Cuanto menor
sea su PM tendrn mayor facilidad para penetrar en el interior de gel lo que determinar
un mayor nmero de intercambio y una menor velocidad de elusin. Se denomina
volumen de elusin al volumen en el que eluye una protena en particular.
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Vo
Vo-Vt
Vt
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Cromatografa de intercambio inico: una resina de intercambio inico es una matriz
insoluble con grupos cargados unidos covalentemente. Se disponen comercialmente de
matrices cargadas positiva y negativamente. Las matrices cargadas negativamente ligan
iones cargados positivamente (cationes). Las resinas pueden ligar un tipo de catin
pero, ante la presencia de un segundo tipo de catin lo desplazan o intercambian con el
primero. De manera similar, las resinas de intercambio aninico estn cargadas
positivamente y ligan (e intercambian) iones cargados negativamente. El
fraccionamiento de protenas por columnas de intercambio inico depende de la
diferencia en las cargas de las distintas protenas. La carga de una protena depende del
nmero y tipo de grupos ionizables. Para cualquier protena al pH correspondiente a su
punto isoelctrico no se unir a ningn tipo de intercambiador aninico. Por encima de
ese pH la protena estar cargada negativamente y se unir a un intercambiador
aninico. Por debajo de ese pH, estar cargada positivamente y se unir a un
intercambiador catinico. Para eluir las protenas retenidas en la matriz se puede
modificar el pH del medio o bien modificar la fuerza inica aumentando la
concentracin de sales. Esta ltima es la condicin frecuentemente utilizada.
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Cromatografa de afinidad: este tipo de cromatografa es la ms especfica. La matriz
es usualmente agarosa, poliacrilamida o dextrano, a la cual se une covalentemente un
ligando especfico. La naturaleza qumica del ligando est determinada por alguna
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Muestra
Homog.
Paso de
Purificacin
(PP)
A:
Activdad total
Masa de Protenas
C:
Actividad total PP
Actividad total Homog
B:
Actividad especfica PP
Actividad especfica Homog
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ESPECTROMETRA DE MASAS
La espectrometra de masas (MS) permite analizar la composicin de diferentes elementos qumicos e
istopos atmicos, separando los ncleos por su relacin masa-carga. En el caso de la identificacin de la
estructura primaria de las protenas, la MS presenta numerosas ventajas frente al mtodo de Edman: es
ms sensible, permite analizar directamente las mezclas proteicas y ofrece un mayor rendimiento por
muestra. Por ello, es el mtodo utilizado en las dos tcnicas de identificacin de protenas ms comunes:
la identificacin por huella peptdica y el anlisis MS/MS (solo veremos el primero).
Identificacin por huella peptdica
Se puede partir de protenas separadas en gel o protenas en solucin. En cualquiera de los casos, se aade
una proteasa con un patrn de corte conocido (tpicamente, tripsina), generndose una coleccin o
conjunto de pptidos. Habitualmente, esta coleccin de pptidos ser lo suficientemente especfica como
para poder identificar la protena con la que estamos trabajando.
Los pptidos trpticos son analizados por MS en un equipo denominado MALDI-TOF (MALDI por sus
siglas en ingls Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization y TOF por el nombre en ingls del detector:
time of flight). En este equipo cada pptido tiene un tiempo de permanencia o tiempo de vuelo
inversamente proporcional a su masa.
Por ltimo se realiza la comparacin del espectro de masas con la informacin almacenada en bases de
datos de secuencias conocidas, como Swiss-Prot o nr-GenBank. Para ello existen motores de bsqueda
como MASCOT (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html) que ordenan las protenas
identificadas asignndoles puntos en funcin del nmero de coincidencias entre las masas de los pptidos
de la protena a identificar, con la masa de los pptidos trpticos tericos de las protenas de la base de
datos.
TECNICAS DE LABORATORIO
ESTRUCTURA DE PROTENAS
Amino cidos - Notas claves
Amino cidos Todas las protenas estn formadas por el mismo juego estndar de 20
aas. Un aa tpico tiene un grupo amino primario, un grupo carboxilo, un tomo de
hidrgeno y una cadena lateral (grupo R) unidos a un tomo de carbono central (C).
La prolina es la excepcin a esta regla por poseer un grupo amino secundario.
Enantimeros Los 20 aas, excepto la glicina, tienen cuatro grupos diferentes ordenados
tetradricamente alrededor del tomo de C y por lo tanto pueden existir en
configuracin D o L. Estos dos enantimeros son imgenes especulares que slo pueden
distinguirse sobre la base de su diferente rotacin de la luz polarizada en el plano. Slo
los ismeros L se encuentran en las protenas.
TECNICAS DE LABORATORIO
Disociacin de grupos ionizables de aminocidos
GRUPO
- carboxilo (Ct)
- amino (Nt)
- carboxilo (Glu,Asp)
- amino (Lys)
- OH fenlico (Tyr)
- Imidazol (His)
- Guanidinio (Arg)
- Sulfidrilo (Cys)
aa libre
1.8-2.5
8.9-9.7
3.8-4.3
10.5
10.1
6
12.5
8.3
RANGO de pK
En polipptido
1.8-2.5
7.5-8.5
3.0-4.7
9.4-10.6
9.8-10.4
5.6-7.0
11.6-12.6
9.4-10.8
Notas claves
Termodinmica
Energa de activacin y estado de transicin
Cambio en energa libre: La diferencia en el nivel de energa entre sustratos y productos se
denomina cambio en la energa libre de Gibbs (G). Un G negativo indica que la reaccin es
termodinmicamente favorable en la direccin indicada, mientras que un G positivo indica
que la reaccin no es termodinmicamente favorable y requiere la entrada de energa para que
la reaccin proceda en la direccin indicada.. Si el cambio en energa libre (G) de una
reaccin es negativo, dicha reaccin puede ocurrir espontneamente. Una reaccin
energticamente desfavorable es conducida frecuentemente por el acoplamiento a una
reaccin energticamente favorable, como por ejemplo la hidrlisis de ATP.
TECNICAS DE LABORATORIO
V0 =
Vmax [S]
Km + [S]
Aldosas y cetosas
Estereoismeros
Estructuras cclicas
Disacridos
Derivados
Nomenclatura
Polisacridos y oligosacridos Notas claves
Polisacridos
Glucgeno
Almidn
Dextrano
Celulosa
Oligosacridos
Mtodo de identificacin y secuenciacin
TECNICAS DE LABORATORIO
Determinacin de azcar reductor
O
C
OH
OH
Aldosa
OH
OH
OH
Enodiol
OH
OH
Cetosa
Los azcares con el grupo carbonilo libre son los capaces de formar el enodiol intermediario
en medio alcalino, y por ende son reductores ya que es ese intermediario la forma reactiva de
los azcares en una reaccin de xido-reduccin.
Uno de los mtodos ms utilizado para la determinacin de azcar reductor es el de SomogyNelson.En este mtodo se produce la reduccin del ion Cu2+ a Cu2O por accin de los
azcares en medio alcalino y caliente. Luego por accin del Cu2O sobre el reactivo de Nelson
(arsenomolbdico) se forma un complejo coloreado, en el que el Mo se ha reducido. Este
complejo se determina espectrofotomtricamente a 540 nm.
SECUENCIACIN DE OLIGOSACRIDOS
Para analizar un oligosacrido se deben tener en cuenta los siguientes puntos:
a) composicin de azcares.
b) sitios de unin glicosdica.
c) configuracin anomrica de los enlaces glicosdicos.
a) Composicin
El primer paso en la secuenciacin es determinar la composicin de monosacridos. Para
hidrolizar la cadena de oligosacridos se utilizan principalmente dos mtodos:
1) Se puede utilizar una solucin acuosa cida para liberar los monosacridos (ClH 2-4 N
durante 3-6 horas a 100 C).Luego de la hidrlisis cida, los monosacridos liberados se
transforman en derivados (acetatos) y se los analiza por cromatografa gaseosa con
espectrometra de masas.
2) Un mtodo alternativo al mtodo anterior es utilizar cloruro de metilo anhidro, que es
menos destructivo.
TECNICAS DE LABORATORIO
b) Uniones glicosdicas
H2 COH
OH
H2 COH
+
H3 COH H
OH
OH
OH
-D-glucopiranosa
OH
OH
OCH 3
OH
Metil--D-glucopiransico
(CH3)SO4
NaOH
H COCH
2
3
(a)
OMe
MeO
O
OMe
OMe
H2COMe
H CL
diluido
(b)
MeO
OMe
O
OH
OMe
TECNICAS DE LABORATORIO
1
1
mol oligosacrido
mol fomaldehdo
H2 COH
O
OH
O
O
OH
O
H
O
H
OH
N
C
OH
H2 COH
O
O
3H
OH
+7 HIO4
H2COH
O
CH
OH
OH
O
OH
H2COH
O
O
H2 COH
OH
H2 COH
O
OH
O
+1 HC
+ 7 HIO3
Si las uniones fueran diferentes hay que analizar los sitios de accin del periodato y los
productos obtenidos
Determinacin de la estructura de mono- di - y polisacridos
Mtodo
Uso de enzimas especficas:
Maltasa (uniones alfa)
Emulsina (uniones beta)
Informacin obtenida
Uniones alfa o beta
Aldosa libre
Reduccin de Cu 2+ o Ag +
Azcar reductor
Metilacin exhaustiva
Tratamiento con IO4H
Hidrlisis cida (H+ /H2O)
Estudio de las unidades
Por separado
TECNICAS DE LABORATORIO
METABOLISMO ENERGTICO:
TECNICAS DE LABORATORIO
Figura 2
Figura 3
TECNICAS DE LABORATORIO
LPIDOS
Estructura y funcin de los cidos grasos
Notas claves
Estructura y propiedades
Nomenclatura
Funciones
Prostaglandinas
Introduccin
Los lpidos son compuestos primarios en las clulas, donde funcionan como elementos
estructurales de las membranas y de tejidos especializados como el nervioso, reserva
energtica, activadores especficos de enzima, transportadores de restos carbohidratos
en la sntesis de glicoprotenas y como reguladores de funciones orgnicas (vitaminas
liposolubles o el grupo de hormonas esteroides).
Con el nombre de lpidos se agrupan compuestos biolgicos qumicamente
heterogneos caracterizados por la presencia, en su estructura, de compuestos
parafnicos como son principalmente los cidos grasos o cadenas similares, que por su
carcter hidrofbico les confieren la caracterstica solubilidad en solventes neutros
/orgnicos) y la insolubilidad en agua. Tambin integran la estructura de distintos
lpidos compuestos tan variables como el glicerol, aminoalcoholes (etanolamina),
aminocidos (serina), cido fosfrico, monosacriodos y oligosacridos, que introducen
en los lpidos grupos polares hidroflicos que les imparten propiedades qumicas y
fsicas caractersticas. Con estructuras tan diferentes la solubilidad de los lpidos es muy
variada ofreciendo las bases para su fraccionamiento.
Preparacin de extractos lipdicos
1) Extraccin: Debido a las caractersticas estructurales de los lpidos su extraccin de
diferentes materiales biolgicos se realiza con mezclas de solventes orgnicos
adecuadas.
Un mtodo general para extraer lpidos de tejido hmedo consiste en el uso de la mezcla
cloroformo:metanol en proporcin 2:1, seguido de una filtracin y posterior lavado.
2) Particin: La fraccin no lipdica se remueve particionando con un solvente polar. El
filtrado obtenido se mezcla con 0,2 volmenes de agua o una solucin salina (Cl2Ca
0,003 N). Se obtienen entonces dos fases que se separan por centrifugacin . La fase
superior con el material contaminante no lipdico se descarta y la fase inferior que
contiene los lpidos se lava con una mezcla de solventes.
Una vez obtenida la fraccin lipdica se procede a su concentracin por evaporacin del
solvente bajo una atmsfera de nitrgeno.
3) Separacin: uno de los principales mtodos utilizados para separar e identificar las
distintas clases de lpidos es la cromatografa en capa delgada (TLC). Con este mtodo
se pueden separar sustancias hidrfilas y sustancias hidrfobas (lpidos).
TECNICAS DE LABORATORIO
La TLC usa generalmente slica gel como adsorbente, esta fase fija se suspende en agua
y deposita sobre placas de vidrio ( o metlicas o plsticas) que luego de secarse queda
adherida como una capa delgada de 0,1 a 2 mm de espesor. El disolvente o fase mvil
es en general una mezcla de solventes elegido de acuerdo a los lpidos que se vaya a
separar.
Se deja correr el cromatograma y los compuestos presentes en el extracto estarn a
distintas distancias desde el origen. Esto depender de su estructura qumica, de la
naturaleza del adsorbente y la composicin del solvente.
Dado que los compuestos separados son incoloros, el cromatograma se revela con algn
reactivo especial de manera de detectar las manchas.
Se deben sembrar en el mismo cromatograma compuestos standard para comparar la
posicin (Rf) de estos compuestos con las distancias de las manchas correspondientes a
los compuestos del extracto.
Rf : Relacin de frente: Movimiento relativo de un compuesto con respecto al frente
alcanzado por el solvente. Es una propiedad caracterstica y reproducible.
d) Revelado: uno de los reactivos ms utilizado para revelar los lpidos es el vapor de
iodo, debido a su propiedad de unirse a los dobles enlaces de los cidos grasos
insaturados. (Aparecen manchas marrones sobre un fondo amarillo). FIG. 1
e) Densitograma: Una vez realizado el anlisis cualitativo del cromatograma se realiza
su cuantificacin mediante un densitograma.
Luego de identificar los compuestos se puede raspar la zona de la mancha del
cromatograma y eluirla para su posterior cuantificacin.
Cromatografa de cido silcico
Otra tcnica ampliamente usada para la separacin de los compuestos lipdicos de un
extracto es la cromatografa en columna de cido silcico.
Segn este mtodo los lpidos estn generalmente ms fuertemente adsorbidos a medida
que la polaridad aumenta, desde hidrocarburos hasta los fosfolpidos.
Para elurlos de la columna se va incrementando la polaridad del solvente. FIG 2
Cromatografa en fase gaseosa
La cromatografa en fase gaseosa es particularmente apropiada para la separacin de
gases y lquidos voltiles o slidos en estado gaseoso. se emplea para analizar cuali y
cuantitativamente mezclas de cidos grasos de esteroles, de hidrocarburos as como de
otros compuestos que son voltiles o pueden convertirse qumicamente en derivados
voltiles. La cantidad de muestra necesaria para el anlisis est en el orden de los
microgramos.
Las separaciones son funcin distribucin diferencial de las molculas del soluto entre
el flujo de gas inerte (nitrgeno, argn) que es la fase mvil y un slido o un lquido
dispuesto sobre un slido que constituye la fase estacionaria. Los compuestos que van
siendo separados abandonan la columna a determinados y diferentes tiempos (tiempo de
retencin de cada componente) y son medidos a la salida de la columna por un detector.
El detector ms empleado y de mayor sensibilidad es el detector de ionizacin de llama.
TECNICAS DE LABORATORIO
Fig.1
Fig.2
TIPOS DE CENTRIFUGACIN
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Centrfugas preparativas
a) De uso general mxima: 6.000rpm (6.000 g). Los rotores pueden ser de ngulo
fijo o de ngulo mvil. Difieren solamente en su capacidad de carga (tubos de 10,
50 y 100 ml).
b) De alta velocidad: velocidad mxima 25.000rpm (89.000 g). La cmara del rotor
est refrigerada para eliminar el calor producido por la friccin entre el aire y el
rotor.
c) Ultracentrfuga preparativa: velocidad mxima 75.000rpm (510.000 g). Las
cmaras del rotor estn a la vez refrigeradas y evacuadas para as minimizar la
produccin de calor por friccin.
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MTODOS DE SECUENCIACIN
Mtodo de Maxam y Gilbert (Mtodo Qumico): Este mtodo usa reactivos qumicos
que reaccionan con bases especificas para romper el ADN preferencialmente en
determinados nucletidos. Primeramente las cadenas de ADN se marcan
radiactivamente en el extremo 5, y se separan (solamente una se va a secuenciar).
Luego, la cadena a secuenciar se trata con cuatro reactivos qumicos diferentes que
tienen la capacidad de cortar la cadena en uno o dos nucletidos especficos. El
tratamiento no es exhaustivo, de manera que reacciona un solo residuo de la/s base/s
susceptibles. Por consiguiente, en cada mezcla de reaccin, se generan un conjunto de
fragmentos radiactivos. Finalmente, estos fragmentos son separados por tamao
utilizando una electroforesis en gel de poliacrilamida. El revelado del gel por
autorradiografa, permite visualizar las bandas radiactivas correspondientes a los
distintos fragmentos, y a travs de ellos se va armando la secuencia.
TECNICAS DE LABORATORIO
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TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE
La Tecnologa del ADN recombinante constituye una mezcla de tcnicas, entre las que
podemos citar:
1) Corte especfico del ADN mediante nucleasas de restriccin 2) Amplificacin y
clonado del ADN que posibilita integrar un fragmento especfico de ADN en un
elemento gentico de replicacin rpida (plsmido) para que pueda ser reproducido en
bacterias o levaduras 3)Secuenciacin del ADN 4) Hibridizacin de los cidos
nucleicos, que permite identificar secuencias especficas de ADN o ARN con gran
exactitud, debido a la capacidad de los cidos nucleicos de unirse a secuencias
complementarias.
1)Nucleasas de Restriccin
Muchas bacterias producen estas enzimas, que son capaces de cortar al ADN en sitios
determinados, ya que reconocen secuencias especficas de cuatro o seis nucletidos.
Una nucleasa de restriccin determinada cortar cualquier doble hlice de ADN en una
serie de fragmentos conocidos como fragmentos de restriccin.
Muchas nucleasas de restriccin producen cortes escalonados, que dejan fragmentos
cortos de una sola hebra en ambos extremos. Estos extremos se denominan "extremos
cohesivos", ya que son complementarios con cualquier otro extremo producido por la
misma enzima.
Cuando los dos extremos se han unido gracias al apareamiento de bases
complementarias, pueden sellarse por la accin de una enzima conocida como ligasa,
que forma enlaces fosfodiester covalentes entre los extremos opuestos de cada hebra de
ADN.
2) Amplificacin y clonado del ADN
La obtencin de fragmentos especficos de ADN para diversos fines (secuenciacin,
clonado, expresin) se ha simplificado enormemente a partir del desarrollo de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Este proceso permite obtener grandes
cantidades de ADN sin necesidad de clonar. La PCR requiere un par de cebadores que,
por lo general, son fragmentos cortos de ADN sintetizados qumicamente
(oligonucletidos) que tienen secuencias de nucletidos especficamente
complementarias a aquellas en las hebras opuestas que flanquean la regin blanco. Estos
cebadores definirn los extremos del segmento de ADN que se duplicar. La fuente
original del molde o templado de ADN no tiene que estar altamente purificada y aun
una cantidad muy pequea del templado puede servir como iniciador de la PCR. La
muestra de ADN se calienta, permitiendo que las hebras complementarias se separen.
Entonces se aaden los cebadores junto con una enzima polimerizante del ADN. Los
cebadores se unen a las cadenas de una sola hebra durante la fase de enfriamiento, y la
enzima polimerizante extiende al cebador a lo largo del resto del fragmento, creando
molculas de ADN doble hebra. Entonces el proceso se repite, es decir se calienta la
mezcla nuevamente y durante las sucesivas fases de enfriamiento, los cebadores
sobrantes se unen a las hebras molde y se alargan mediante la enzima polimerizante
para producir mas molculas de doble hebra. Tericamente, despus de 20 de estos
ciclos una molcula sencilla de ADN puede amplificarse a un milln de copias. Con
esta cantidad de ADN se pueden fabricar sondas, realizar secuencias, etc.
Fragmentos de ADN procedentes de cualquier fuente tambin pueden ser amplificados
mas de un milln de veces insertndolos en un plsmido o en un virus bacteriano
(bacterifago) y luego cultivndolo en clulas bacterianas o de levaduras. Este proceso
se denomina clonado del ADN. Los plsmidos son pequeas molculas circulares de
TECNICAS DE LABORATORIO
TECNICAS DE LABORATORIO
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Rayos beta: son electrones. Un neutrn nuclear se convierte en un protn nuclear y un
electrn. la emisin de una partcula beta (electrn) resultar e un istopo estable con un
N atmico mayor en una unidad y un peso atmico idntico al radioistopo original.
0
14
Ej.: 146 C
-1 7N
Las partculas son emitidas en una escala continua de energa desde cero hasta el valor
mximo (E max). Dicho valor es caracterstico de cada radioistopo.
Los rayos beta recorren distancias mayores que los alfa, tienen mayor poder penetrante
que los anteriores ya que atraviesan fcilmente el papel y de acuerdo a sus energas,
hasta unos mm del aluminio. Cuando las partculas beta atraviesan la materia, su energa
se disipa principalmente por ionizacin y/o excitacin de los tomos con los que
chocan. Estas interacciones se detectan con los contadores Geiger-Muller (ionizacin) y
de centelleo (excitacin).
Rayos gamma: son ondas electromagnticas como la luz visible o los rayos X pero de
menor longitud de onda. Tienen valores discretos de energa y no es una escala
continua. No vara ni el nmero atmico ni el msico. El nucleido simplemente sufre
una transicin desde un estado ms alto de energa hasta uno ms bajo. Un rayo gamma
no presenta carga y por lo tanto no ioniza directamente tomos en su trayectoria.
Los rayos gamma son penetrantes y para detenerlos se precisa una pared gruesa de
plomo o cemento.
La mayora de los radioistopos usados en estudios bioqumicos son emisores beta y/o
gamma.
De los istopos producidos artificialmente los que se emplean ms frecuentemente son:
3
H, 14C, 24Na, 32P, 35S, 40K, 59F, 131I. Todos ellos emiten radiaciones de partculas beta
cargadas negativamente y los istopos 24 Na, 59Fe y 131I emiten al mismo tiempo
radiaciones gamma.
La radiactividad es la transformacin atmica en la que un elemento se convierte en
otro, con la emisin de radiaciones. La desintegracin radiactiva obedece a las leyes de
la probabilidad y es independiente de influencias externas como presin, gravedad,
temperatura, campos elctricos o magnticos y tratamientos qumicos.
La intensidad de la radiactividades proporcional a la masa del nucleido
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dN = -
N
ln No = t
N
ln N = - t
N0
dt
to
2,3 log No = t
N
Periodo de semidesintegracin.
Es el tiempo necesario para que el nmero inicial de tomos disminuya a la mitad.
N = No / 2
t = ln No/N
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Donde:
a2: actividad especfica en el diluyente + radiactivo agregado
x1: masa radiactiva agregada
x2: masa del diluyente (compuesto no marcado)
z: actividad (cpm) del radiactivo agregado
La actividad especfica del radiactivo agregado (a1) ser:
Luego, se reaisla una pequea cantidad del compuesto y se mide la radiactividad del
mismo. De la actividad especfica del mismo y conociendo el nmero total de cuentas
originariamente agregado, se puede calcular la cantidad del compuesto no marcado
presente desde un principio en la mezcla.
Aplicaciones de radioistopos en biologa y bioqumica.
Un gran nmero de los anlisis bioqumicos requieren la deteccin de cantidades
mnimas (10-14 a 10-6 moles) de material. Ahora bien, las pruebas qumicas rara vez son
sensibles a cantidades menores de 10-7 moles. Esta limitacin se ha superado por el
desarrollo de una tecnologa de marcadores radiactivos, cuya extraordinaria sensibilidad
en la deteccin de material marcado con istopos radiactivos ha permitido que los
estudios con muchas sustancias en cantidades del orden de 10-12 moles sean de rutina.
Adems el uso de radiactividad ha permitido el desarrollo de aproximaciones
experimentales de gran alcance a diversos tipos de problemas.
Estas aproximaciones emplean la tcnica de marcado doble, que permite el
seguimiento de dos sustancias al mismo tiempo, la tcnica de un seguimiento de un
pulso radiactivo y el anlisis de intercambio.
En una molcula marcada al menos un tomo esta presente como radioistopo.
Este radioistopo no modifica las propiedades qumicas de la molcula. Los
radioistopos se pueden utilizar para seguir las actividades de molculas marcadas dado
que estos tomos pueden detectarse cuando emiten partculas.
Se
encuentran
disponibles comercialmente aminocidos y nucletidos marcados con 14C o 3H, as
como cientos de intermediarios metablicos marcados. El 125I puede estar unido en
forma enzimtica o qumica a una protena si afectar la macromolcula. La metionina
marcada con 35S se utiliza para marcar protenas ya que posee una alta actividad
especifica. La magnitud de la actividad especfica depende de la relacin de tomos
inestables (potencialmente radiactivos) a tomos estables (no radiactivos), y de la
probabilidad de decaimiento de los tomos inestables, indicado por su vida media.
Existen principalmente dos mtodos para detectar la radiactividad incorporada. I) En la
autorradiografa se marca una clula o componente celular y lego se cubre con una
emulsin fotogrfica sensible a la radiacin. El desarrollo de la emulsin revela la
distribucin del material marcado. Por ejemplo la incorporacin de 3H timidina
identifica el ncleo como el mayor sitio de sntesis de ADN. En oposicin, la
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