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Cromatografa de capa delgada de analgsicos y sustancias incgnitas ,

cromatografa de columna de extractos de espinaca y cromatografa de


papel con M&M
Introduccin
La cromatografa es una tcnica empleada para separar mezclas gracias a la
exposicin de sta en un sistema bifsico que se deja llegar a equilibrio. Las dos fases
que intervienen pueden ser lquidos inmiscibles, gas y lquido, gas y slido o un lquido y
un slido, una de las fases del medio binario es estacionaria con respecto a la otra; por lo
tanto, se tiene una fase mvil (Durst. D & Gokel. G, 2007).
Cada una de las variaciones de cromatografa son capaces de ocurrir debido a las
interacciones intermoleculares de cada compuesto (mvil y estacionario) con el medio
disolvente y el medio de adsorcin, as aquellos que tengan afinidad a una o la otra
resultar en una separacin ms efectiva de los componentes o pigmentos individuales
(Durst. D & Gokel. G, 2007).
La cromatografa se puede clasificar en dos grupos, segn la fase estacionaria de
la misma. Cuando la fase estacionaria es un lquido se denomina cromatografa de
particin, en esta un material slido inerte como el gel de slice sirve para sostener una
capa fina de lquido, la cual es la capa estacionaria efectiva; a medida que la fase mvil
que contiene los solutos pasa por esta fase lquida, se produce la retencin y separacin a
causa de la solubilidad relativa de los componentes analizados en los dos lquidos segn
lo determina su coeficiente de particin (Gennaro, A. R ,2003).
El otro tipo de cromatografa es en el que la fase estacionaria es un slido, recibe
el nombre de cromatografa de adsorcin, en esta la fase mvil que contiene los solutos
disueltos pasa por encima de la fase estacionaria. La retencin de los componentes y su
consiguiente separacin dependen de la capacidad de los tomos que se encuentran en la

superficie para remover los solutos de la fase mvil y adsorberlos de manera temporal por
medio de fuerzas electroestticas (Gennaro, A. R ,2003).
La adsorcin se define como la retencin de una especie qumica en los sitios
activos de la superficie de un slido (adsorbente) que constituye la fase estacionaria,
quedando delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases. Esta ocurre en la
superficie de la partcula de la fase estacionaria y es debida a la atraccin entre soluto y
adsorbente por fuerzas intermoleculares (Lamarque, A. ,2008).
Entre los tipos de cromatografa de adsorcin se pueden mencionar el de capa fina
y el de columna. En la cromatografa de capa fina, la fase mvil asciende por capilaridad
a travs de una capa delgada de adsorbente (gel de slice) adherida a un soporte (placa de
aluminio o vidrio). Esta tcnica permite separar componentes de una mezcla, determinar
el grado de pureza de un compuesto, comparar composiciones de diferentes muestras y
relizar el seguimiento de una reaccin (Lamarque, A. ,2008).
Para realizar una cromatografa de capa fina, se coloca la muestra en el
adsorbente, se puede colocar en una lnea o un punto, luego se ubica la placa en forma
vertical en el interior de una cmara que contiene disolvente (Lamarque, A. ,2008).
Cuando el disolvente asciende por la placa, los componentes de la muestra se
distribuyen a travs de la fase estacionaria y la mvil y se separan debido a la diferencia
de velocidades, estas se definen por la solubilidad en el disolvente y el grado de retencin
del adsorbente. La placa se debe retirar cuando el disolvente alcanza el frente.
(Lamarque, A. ,2008).
Si los componentes de la mezcla no son coloreados, estos no se pueden observar a
simple vista. Existen varios mtodos de revelado para que estos se coloreen y poder
apreciarlos. Uno de ellos es la cmara de yodo, los vapores de este al entrar en contacto
con la placa, tien los componentes separados de amarillo o marrn. Otro mtodo es la
lmpara UV, esta se puede utilizar para compuestos que fluorecen y permite visualizarlos
como manchas brillantes. (Lamarque, A. ,2008).
El Rf es el factor que caracteriza el comportamiento de un soluto en un sistema
cromatogrfico plano. Este factor se define como la relacin de la velocidad de
desplazamiento del soluto y la velocidad de desplazamiento de la fase mvil. A un tiempo
2

dado, esta expresin se transforma en una relacin de espacios (Valcrcel .C & Gmez.
A, 1988).
Sus valores se encuentran entre 0 y 1. Cuando R f = 0 el soluto no migra (no es
soluble en la fase mvil), cuando es igual a 1 el soluto no es retenido por la fase
estacionaria y se mueve con el frente del disolvente (Garritz. A & Chamizo. A , 2001)
La cromatografa de columna fue descubierta por Tswett, un botnico ruso, que
coloc un extracto de pigmentos de vegetales en la parte superior de una columna de
vidrio rellena de yeso pulverizado y al agregar ter observ que de la mezcla original se
separaban, en el interior de la columna, diversas bandas de colores. En esta los
componentes de la mezcla interactan en diferente forma tanto con el disolvente que se
aade y recorre la columna, como con la sustancia empacada (gel de slice). El resultado
es que bajan ms rpidamente unos que otros y se pueden

distinguir las bandas

coloreadas en la columna (Valcrcel .C & Gmez. A, 1988).


La cromatografa en papel es una tcnica utilizada para anlisis inorgnico
cualitativo, permite llevar a cabo la separacin e identificacin de iones, trabajando con
cantidades mnimas de sustancia. Pertenece al tipo de Cromatografa de particin se
fundamenta en que las sustancias problema, pueden tener diferentes coeficientes de
reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno permanece fijo en la superficie
del papel fase estacionaria generalmente en agua, la fase mvil constituida
generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. La fase
estacionaria que se utiliza es una hoja de papel de celulosa de elevada pureza recubierta
de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase mvil, en la que ir disuelta
la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en funcin de los
componentes que se pretenden separar.(9)

Mtodo Experimental
A) Cromatografa de Capa Fina (TLC).
Se marc con un lpiz la lnea de aplicacin y los puntos de aplicacin en la placa
de cromatografa de capa fina de 6x6 (aluminio recubierto de gel de slice).
3

Se aplicaron dos muestras incgnitas asignadas y los patrones (acetaminofn,


ibuprofeno, aspirina y cafena disueltos en etanol), una en cada punto de
aplicacin de la placa de cromatografa utilizando un capilar. Se observaron las
manchas con la luz UV para asegurarse de que se encontraran concentradas. Se
coloc la placa dentro de la cmara de desarrollo que contena 10 mL de una
mezcla de 95% acetato de etilo 5% cido actico. Cuando el disolvente alcanz
la lnea marcada como frente del disolvente se sac la placa y se esper a que el
disolvente se evaporara. Se procedi a revelar con lmpara UV y se marcaron las
manchas observadas con un lpiz. Luego se revel en la cmara de yodo y se
observaron las manchas formadas(Figura 1).
B) Separacin de los pigmentos naturales de las plantas por cromatografa de
columna.
Esta parte la realiz el profesor, se realiz un extracto de
espinaca, para ello se pesaron 30 g de espinaca y se mezcl con
45 ml de etanol 95%, se agit vigorosamente, se filtr en un
embudo de espiga

con algodn , el residuo que qued en el

algodn se deposit en un beaker y se mezcl con ter de


petrleo 30-40(diclorometano) , se filtr por papel y se concentr
a 3-4 mL. Se procedi a preparar la columna, para ello se sujet
a un soporte metlico, con un agitador de vidrio se aadi una
pequea porcin de algodn en la salida de la columna,
seguidamente

se

agreg

una

capa

de

arena

fina

de

aproximadamente 1 cm de espesor. En un beaker se agreg


slica hasta una altura de 11-13 cm y se le agreg el disolvente
escogido hasta obtener una mezcla con fluidez. Se tap con el
dedo la salida de la columna y se agreg lentamente la mezcla
de slica, luego se quit el dedo de manera que el disolvente se
drenara. Se repiti el paso anterior hasta llenar la columna casi
por completo, en la ltima repeticin no se dren el disolvente
porque para la cromatografa no se puede permitir que la
columna se seque. Se agreg otra capa de arena. Se agregaron

varias gotas de extracto de espinaca y se dren hasta la capa de


arena. Posteriormente, se eluy con el disolvente y en tubos de
ensayo se fueron recogiendo los distintos pigmentos obtenidos.
C) Cromatografa de papel
Se marc con un lpiz la lnea de aplicacin y los puntos de aplicacin en la placa
de papel filtro de 8x11 .
Se aplic el colorante de cada pastilla de M&M sobre el papel filtro en el punto
previamente marcado y se esper a que el colorante fuera adsorbido, y se secaran
para luego proceder a la cmara de desarrollo del cromatograma.

Resultados

DFigura 1. Cromatografa de capa delgada de distintos analgsicos.


Cuadro I. Distancia recorrida por los componentes de los distintos patrones, las
incgnitas y el disolvente en la placa de cromatografa de capa fina.
Sustancia

Estructura

Distancia Recorrida

Rf

Incgnita 1

(cm)
1,75

0,38

Incgnita 2

0,65

Aspirina

2,9

0,63

Ibuprofeno

1,4

0,30

Acetaminofn

2,5

0,54

Cafena

1,7

0,38

Disolvente

4,6

(Acetato de etilo
95% - cido actico
5%)

Figura 2. Cromatografa de columna de extracto de espinaca

Figura 3. Cromatografa de capa delgada de espinaca con distintos eluentes (de izquierda
a derecha: B: ter de petrleo-acetato de etilo 50:50, A: ter de petrleo-tolueno-acetato
de etilo 45:1:5)

Figura 4. Colores de los pigmentos presentes en la espinaca

Figura5. Cromatografa en papel con M&M


Clculos

[1]

Por ejemplo, para la aspirina:

Discusin
Se realizaron las cromatografas de capa fina y la de columna. Estas tcnicas
difieren en la forma en la que se soporta el adsorbente. En ambas es comn utilizar gel de
slice o almina como fase estacionaria y un disolvente orgnico como fase mvil o
eluente. Sin embargo, en la cromatografa en columna el adsorbente se introduce en un
tubo de vidrio, en cambio, en la cromatografa de capa delgada esta se coloca en una
placa de vidrio, aluminio o plstico.

Otra diferencia entre estas tcnicas es que en la de columna el disolvente se deja


caer a travs de ella, la fuerza que lo mueve es la gravedad, en cambio en la
cromatografa de capa fina la fuerza motriz es la capilaridad del adsorbente.
Ambos tipos de cromatografa coinciden en que entre mayor longitud de la
columna o la placa, mejor ser la separacin, debido a que las fuerzas que ocasionan la
separacin tendrn ms tiempo para actuar sobre las sustancias (Durst. D & Gokel. G,
2007).
Las ventajas de la cromatografa de columna sobre la cromatografa de capa
delgada es que esta permite separar una mayor cantidad de muestra, se pueden realizar
cambios secuenciales en la polaridad del disolvente de elucin, lo que puede mejorar la
eficiencia de la separacin y el frente del disolvente tiene un desplazamiento ilimitado.3
Los principales usos del TLC son la determinacin del nmero e identidad de
componentes en la muestra (de gran utilidad en la industria farmacutica), monitorear el
progreso de la reaccin mediante el establecimiento de intervalos en el cual los reactivos
forman los productos, para determinar la efectividad de una purificacin y monitorear las
condiciones de una columna cromatogrfica (Williamson, K. 2011).
En el Cuadro I se tiene la cromatografa de capa delgada (TLC, por sus siglas en
ingls) para la separacin del componente activo de cada uno de los analgsicos. La TLC
es una tcnica analtica rpida, simple y barata en la que la fase estacionaria dnde se
agreg las disoluciones de las pastillas, es una placa slida adsorbente y polar como el
slice (SiO2); y la mvil, una mezcla de disolventes poco polares como los son en 95%
acetato de etilo- 5% cido actico. Para lograr el objetivo principal del TLC, segn
Lamarque, A. & Maestri. D. (2008) se debe seguir con la eleccin apropiada de
disolventes basado en que si estos son afines a la muestra, se observar un
desplazamiento mayor de los componentes o pigmentos de la misma, pues por las fuerzas
de atraccin intermoleculares se vern atradas con ste mientras asciende por la placa
debido a la leve adhesin y cohesin del disolvente en el adsorbente de slice. Es
fundamental la eleccin de un disolvente o mezcla de stos que tenga naturaleza polar
distinta a la placa de SiO2 porque sta es polar y si se agrega un solvente as, disolver el
slice y con esto no se puede continuar con la cromatografa (Beyer, H. & Wolfagang. H.

1987). El acetato de etilo, que es el compuesto mayoritario en la mezcla de disolventes


utilizada, es medianamente polar sin embargo no interacciona con el gel de slice.
Debido a que la fase estacionaria es polar, es de esperarse que los compuestos con
mayor polaridad se desplacen menos debido a que van a ser ms retenidos por el gel de
slice que aquellos con menor polaridad.
La caracterizacin de los compuestos se realiza comparando la migracin (R f) de
sustancias desconocidas con la migracin de un compuesto patrn. En un mismo sistema
de disolventes, el Rf es caracterstico de cada sustancia y es as posible identificar los
compuestos desconocidos.7 Las incgnitas asignadas 1 y 3. En el cuadro I se puede
observar que el Rf de la incgnita 1 es igual al de la cafena, por tanto la incgnita
corresponde a este compuesto y la incgnita 2 es acetaminofn debido a que sus R f son
bastante similares.

Esta cromatografa se realiz con 30g de espinaca. Para empezar, se hizo una mezcla de
esta con etanol y luego se filtr la disolucin, esto con el fin de quitarle el agua (Corts.
D, 2004), deshidratar la espinaca, ya que el etanol utilizado era de 95%, sustancia muy
fuerte que sec la espinaca. Posteriormente, se coloca lo obtenido en un bao de agua
caliente y se evapora la mezcla que contiene la filtracin, seguido se procedi a la
separacin de los pigmentos por cromatografa de columna.
Anteriormente se mencion que una de las utilidades de la cromatografa de capa delgada
es monitorear las condiciones de , una cromatografa de columna. En efecto, esta tcnica
se utiliz para determinar cual sistema de disolventes era mejor para la separacin de los
pigmentos de espinaca por medio de cromatografa de columna.
Para la extraccin de espinaca se realizaron las pruebas con ter de
petrleo:tolueno:acetato de etilo 45:1:51 y ter de petrleo: acetato de etilo 50:50 para
determinar cual era el mejor sistema de disolvente para colocar en la columna. En la
figura 3 se muestran los resultados de la cromatografa de capa delgada con cada eluente,
result mejor la elucin con ter de petrleo: acetato de etilo 50:50, se dio una mejor
separacin de los compuestos debido a que el ter de petrleo: acetato de etilo son menos
polares que la fase estacionaria que es un adsorbente polar( slice) por lo que los
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compuestos se van a desplazar ms rpidamente y separar, por otro lado en el otro


sistema de disolventes el tolueno es moderadamente polar por lo que interacta con el
slice y permanece concentrado.
Este proceso desarrolla el cromatograma en bandas que contienen los compuestos
individuales; estas bandas pueden ser eludas (arrastradas) en secuencia por adicin de
ms solvente y recolectadas en fracciones separadas. La columna se prepara y desarrolla
usando el solvente menos polar que disuelva a la muestra y que permita el movimiento de
los compuestos a una velocidad prctica. La facilidad de ser eludo ms rpidamente
depender de la menor polaridad de los grupos funcionales (8). La columna se prepara en
un tubo de vidrio que, en uno de sus extremos, lleva una llave de paso y el adsorbente se
sostiene en un disco de vidrio poroso o un tapn de algodn cubierto con una capa de
arena para retener partculas finas, columna debe ser compacta y uniforme; una columna
no uniforme, en la que haya capas disparejas de adsorbente o burbujas, no es utilizable.
Arriba del adsorbente se coloca una pequea capa de arena para prevenir que la parte
superior del adsorbente sea alternada y entonces se aade la muestra disuelta y se logra
ver la separacin de los compuestos, se ve la divisin de colores de los pigmentos
presentes en la espinaca, como se puede observar en la figura 4, la clorofila son los
pigmentos que se observan de color verde, debido a que este pigmento es de coloracin
verde y lo amarillo podran ser tanto los carotenoides o las xantofilas que estn presentes
en las espinacas y por lo general son amarillentas
En la cromatografa en papel lo que sucede es que se colocan los M&M de diferentes
colores sobre el papel filtro y se realiza el proceso para colocarlo en la cmara de
desarrollo, luego de sacar el papel filtro de la cmara de desarrollo se observa en la figura
5 que varios colores se descomponen en dos colores, el verde se separa en amarillo y
azul, el caf en naranja y rojo y el anaranjado mayoritariamente en rojo con un poco de
amarillo. Esto se basa principalmente en el hecho de que existen colores primarios y
secundarios, estos que se separan en dos colores es porque son colores secundarios, es
decir que se componen de la mezcla de colores primarios, por ello el rojo, azul y amarillo
al ser colores primarios se observa en la figura 5 que permanecen el color observado en el
M&M.

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Esto sucede porque al colocar el papel filtro con los colorantes aplicados el disolvente
(95% acetato de etilo-5% cido actico ) sube por el papel por capilaridad, a su paso va
arrastrando las molculas de los pigmentos que tena el colorante, como las molculas no
son iguales en tamao ni en composicin, no viajarn a la misma velocidad y de ah que
se separen.

Conclusiones
1. La cromatografa de capa delgada permite obtener una separacin cualitativa
con el fin de identificar los pigmentos o ingredientes activos de sustancias.
2. Los disolventes que se utilicen deben ser de naturaleza polar distinta a la del
compuesto adsorbente para evitar que se forme una disolucin entre stos.
3. El Rf es una relacin de la distancia de desplazamiento de la fase mvil sobre
la estacionaria y cunto avanza la sustancia de inters.
4. La cromatografa de columna permite separar e identificar los pigmentos
presentes en sustancias de origen vegetal.
5. La TLC sirve para identificar la mejor mezcla de disolventes que pueden ser
empleados en la columna, es decir monitorear las condiciones de este tipo de
cromatografa.
Bibliografa
1. Durst, D., Gokel, G. (2007). Experimental Organic Chemistry. 2 edicin. McGrawHill: New York
2. Gennaro, A. R. (2003). Remington Farmacia. Editorial Mdica Panamericana: Buenos
Aires
3. Lamarque, A. (2008). Fundamentos Terico-Prcticos de Qumica Orgnica. Editorial
Brujas: Crdoba
4. Garritz, A.; Chamizo, J. A. (2001). T y la Qumica. Pearson Educacin: Naucalpan de
Juarez
5. Valcrcel Cases, M., Gmez Hens, A. (1988). Tcnicas Analticas de Separacin.
Revert: Barcelona.
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6. Williamson, K. (2011). Macroscale and Microscale Organic Experiments.


2aedicin.:Cenage Learning: Boston.
7. Corts, D. 2004. Diccionario de Ciencias. Edicin. Editorial Complutense: Madrid.
Pp. 418
8. Departamento de Ingeniera y Ciencias Aplicadas de la Universidad Iberoamericana.
Laboratorio de Qumica Orgnica Aplicada. S.A. Recuperado el 31 de Octubre del 2016
de http://www.bib.uia.mx/gsdl/docdig/didactic/IngCienciasQuimicas /lqoa003.pdf.
9. Facultad de Qumica de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Qumica
analtica instrumental II. Recuperado el 31 de Octubre del 2016 de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf .

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