Western Blot

Metodologa
Lisis celular para extraer protenas
1. Lavar las clulas con la adicin de solucin buffer salina fra
(PBS) y agitando suavemente. Desechar PBS. (Se recomienda
mantener el cultivo celular en el hielo).
2. Aadir PBS y utilizar un rascador de clulas para desalojarlas.
Pipetear la mezcla en tubos de microcentrfuga.
3. Centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos y descartar el
sobrenadante.
4. Aadir 180L de buffer frio del lisado celular con 20L de coctel
de inhibidores de proteasas.
5. Incubar durante 30 minutos en hielo, y despus aclarar el lisado
por centrifugacin durante 10 minutos a 12000 rpm a 4 .
6. Transferir el sobrenadante (o mezcla de protenas) a un tubo
nuevo y almacenar en hielo o congelados -20 o -80 .
7. Medir la concentracin de protena usando espectrofotmetro.
Preparacin de la muestra
1. Determinar el volumen de extracto de protena para asegurar
g en cada pozo.
2. Aadir 5 L de tampn de muestra a la muestra, y completar el
volumen en cada carril igualando al usar el doble de agua
destilada. Mezclar bien.
3. Calentar las muestras con placa seca durante 5 minutos a 100
C.

Preparacin del gel

1. Montar el bastidor para la solidificacin del gel despus de
preparar la solucin de gel de apilamiento 10%.
2. Aadir solucin de gel de apilamiento con cuidado hasta que le
nivel es igual a la barra que sostiene la placa, aadir agua a la
cima. Espere durante 15-30 minutos hasta que se solidifique.
3. Superposicin del gel de apilamiento con el gel de separacin,
despus de retirar el agua.
4. Insertar el peine, asegurndose de que no hay burbujas de aire.
5. Esperar a que se solidifique el ge.
Electroforesis
1. Verter el buffer de corrida en el electroforador.
2. Colocar el gel en interior de electroforador y conectar a una
fuente de alimentacin (rojo con rojoa y negro con negro).
3. Asegurarse de que el gel tampn cubre por completo y quitar el
peine con cuidado.

4. Colocar muestras, y el marcador de peso molecular.

5. Correr el gel con un voltaje bajo (60 V), para separacin en gel
usar un voltaje alto (140 V), para el apilamiento en gel.
6. Ejecutar durante una hora, o hasta que el frente de colorante se
sale de la parte inferior del gel.
Bloqueo e incubacin de anticuerpo
1. Bloquear la membrana con leche desnatada 5% en TBST
durante una hora.
2. Aadir anticuerpo primario en albmina de suero bovino 5%
(ASB), y se incuba durante la noche a 4 , con agitacin.
3. Lavar la membrana con TBST durante 5 minutos (hacerlo tres
veces).
4. Aadir segundo anticuerpo en leche desnatada 5% en TBST e
incubarse por una hora.
5. Lavar la membrana con TBST durante 5 minutos(hacerlo tres
veces).
6. Preparar mezcla de ECL, siguiendo la proporcin de solucin A y
B que brinda el fabricante. Se incuba la membrana durante 1-2
minutos.
7. Visualizar el resultado en un cuarto obscuro.
Reactivos
Solucin buffer salina fra.
Coctel de inhibidores de proteasas.
TBST
Anticuerpo primario y segundario en albmina de suero vovino 5%.
Gel de apilamiento
Gel de separacin.

BIBLIOGRAFIA
Mahmood, T., & Chang, P. (2012). Western blot: Techinique, theory,
and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences, 4
(9); 429-434.