Tpicos en Biofsica Molecular

2do Cuatrimestre de 2011

Docentes: La Pietrasanta y Catalina von Bilderling

Prctica de laboratorio n 4: Cultivo Celular

OBJETIVOS
Familiarizarse con el cultivo de lneas celulares, su mantenimiento y divisin. Analizar
cultivos con diferentes grados de confluencia. Utilizar la cmara de Neubauer para el
recuento de clulas. Preparar una placa de cantidad de clulas conocidas a partir del
cultivo provisto.
INTRODUCCIN
1. Cultivos celulares
La mayora de las clulas animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e
incluso presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plstico
y con medios de cultivo adecuados. As, las clulas pueden ser observadas
continuamente bajo el microscopio o analizadas bioqumicamente, para estudiar los
efectos del agregado o remocin de molculas especficas, como hormonas o factores de
crecimiento. Adems, se pueden estudiar las interacciones entre clulas, cultivando en la
misma placa ms de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con cultivos
celulares, se los denomina ensayos in vitro (en vidrio), para diferenciarlos de
aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o experimentos in vivo (en
organismo viviente) [1].
Los cultivos se establecen principalmente a partir de suspensiones celulares generadas
por disgregacin de tejidos. A diferencia de las bacterias, la mayora de las clulas que
forman parte de tejidos no pueden vivir en suspensin, y requieren una superficie slida
sobre la cual crecer y multiplicarse. Este soporte generalmente es la base de una placa o
frasco de plstico, aunque a veces los requerimientos son ms complejos y el plstico
debe antes recubrirse con componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea y
contiene a las clulas en los tejidos, y con la cual interactan), como por ejemplo el
colgeno y la fibronectina.
Cultivos primarios
Se denominan as a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u
rgano. Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos
tipos celulares. En estos cultivos las clulas estn vivas, conservan sus caractersticas
originales y su proliferacin es limitada. Pueden ser removidas del recipiente de cultivo
para formar cultivos secundarios (Figura 1).

Figura 1. Esquema cultivo celular: cultivo primario y cultivo secundario. Tomado de [2].

Cultivos secundarios
En estas condiciones las clulas suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie del
recipiente de cultivo, formando una monocapa (capa de una clula de espesor). Como
consecuencia del contacto entre las clulas se detiene temporalmente su proliferacin,
hasta que se las subcultiva a un recipiente con medio fresco. As, podrn subcultivarse
durante semanas o meses. En este estado, las clulas frecuentemente mostrarn
distintas propiedades segn su origen. Por ejemplo, los fibroblastos (clulas que
sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos animales)
secretarn colgeno, las clulas derivadas de tejido muscular esqueltico se fusionarn
para generar fibras musculares con capacidad contrctil espontnea, las clulas
nerviosas extendern prolongaciones (axones) elctricamente excitables que podrn
conectarse (establecer sinapsis) con otras clulas nerviosas, las clulas epiteliales
formarn largas capas con varias propiedades de un epitelio intacto (Figura 2). Gracias
a que estos fenmenos ocurren en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes
metodologas, a veces no aplicables a tejidos intactos.

Figura 2. Clulas en cultivo. (a) Micrografas de contraste de fase de fibroblastos en cultivo. (b)
Micrografas de mioblastos en cultivo mostrando las clulas fusionadas para formar clulas musculares
multinucleadas. (c) Clulas precursoras de oligodendrocitos en cultivo. (d) Clulas de tabaco en cultivo.
Tomado de [1].

Cultivos contnuos o lneas celulares

La mayora de las clulas de los vertebrados dejan de dividirse luego de un determinado
nmero de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por
ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces
en cultivo, antes de detenerse. La capacidad limitada de proliferacin puede ser el
resultado de un acortamiento progresivo de los telmeros (porcin de ADN que se
encuentra en los extremos de los cromosomas), o puede ser una consecuencia de la
activacin de mecanismos denominados puntos de control (check points) del ciclo
celular.
No todas las clulas humanas se inmortalizan de la misma manera. A los fibroblastos
humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el gen que
codifica para la telomerasa. Otras requieren para inmortalizarlas que se logre la
inactivacin de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos
oncogenes (genes promotores del cncer) que pueden obtenerse de virus que causan
cncer, como algunas cepas del virus del papiloma humano, adenovirus, etc.
Las lneas celulares son muy tiles en la investigacin celular, como fuente de un gran
nmero de clulas uniformes, que pueden ser conservadas y almacenadas en nitrgeno
lquido (a -196 C) por un perodo muy largo de tiempo, reteniendo su viabilidad y
siendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de una investigacin.
A pesar de la gran similitud que las clulas de una lnea tienen entre s, no son idnticas.
La uniformidad gentica en una lnea celular puede mejorarse por clonado celular, a
travs del cual se asla una sola clula, la que prolifera para formar una colonia de
clulas clonales (idnticas).
Algunas de las lneas celulares ms utilizadas se presentan en la Tabla 1.
LINEA CELULAR
3T3
BHK21
MDCK
HeLa
PtK1
L6
PC12
SP2
COS
293
CHO
R1
E14,1
H1, H9
S2
BY2

TIPO Y ORIGEN
Fibroblastos (ratn)
Fibroblastos (Syrian hamster)
Clula epitelial (perro)
Clula epitelial (humano)
Clula epitelial (rata canguro)
Mioblasto (rata)
Clula cromafin (rata)
Clula plasmtica (ratn)
Hgado (mono)
Hgado (humano) transformado con adenovirus
Ovario (Chinese hamster)
Embrionic stem cells (ratn)
Embrionic stem cells (ratn)
Embrionic stem cells (humano)
Macrophage-like cells (Drosophila)
Undifferentiated meristematic cells (tabaco)

Tabla 1. Lneas celulares: tipo y origen.

*Muchas de estas lneas celulares son derivadas de tumores. Todas son capaces de replicarse
indefinidamente en cultivo, y expresar algunas de las caractersticas especiales de sus clulas de origen.
Las lneas BHK21, HeLa y SP2 son capaces de crecer eficientemente en suspensin. La mayora de las
otras lneas celulares necesitan de un sustrato slido para multiplicarse. Tomado de [1].

2. Medios de Cultivo
Para el cultivo celular se utilizan placas con medios lquidos que contienen pequeas
cantidades de una serie de molculas necesarias para la supervivencia y multiplicacin
celular: sales, glucosa, aminocidos y vitaminas. Adems, la mayora de los medios
incluyen una mezcla poco definida de macromolculas adicionadas bajo la forma de
suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo. Dichos medios se
utilizan en la actualidad para los cultivos de rutina (Tabla 2), y por lo tanto es difcil
saber qu macromolculas requiere un determinado tipo celular para funcionar y
multiplicarse. Como consecuencia, se han desarrollado numerosos medios
qumicamente definidos, denominados libres de suero, que poseen, adems de las
pequeas molculas mencionadas, varias protenas especficas necesarias para la
supervivencia y proliferacin, como los factores de crecimiento. As, gracias a estudios
que buscaban establecer las condiciones mnimas de cultivo para un comportamiento
celular adecuado, se descubrieron muchas molculas de sealizacin extracelulares
esenciales para la supervivencia, desarrollo y proliferacin de determinados tipos
celulares.
Los medios de cultivo son generalmente tamponados para mantener un pH alrededor de
7,4 y tienen, adems, indicadores de pH, como el rojo fenol, que cambian de color a
medida que aparecen catabolitos cidos como resultado del metabolismo celular. Suelen
agregarse tambin antibiticos y antimicticos para impedir la contaminacin con
microorganismos.
Los cultivos crecen usualmente en contenedores de plstico o vidrio con una superficie
apropiada para la adhesin celular, y se mantienen en una estufa a 37C en una
atmsfera de 5% de CO2, 95% aire.
Aminocidos

Vitaminas

Sales

Otros Compuestos *

Arginina
Cistena
Glutamina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina

Biotina
Colina
Folato
Nicotinamida
Pantotenato
Piridoxal
Tiamina
Riboflavina

NaCl
KCl
Na H2PO4
NaHCO3
CaCl2
MgCl2

Glucosa
Penicilina
Estreptomicina
Anfotericina
Rojo fenol
Suero fetal bovino

Protenas
requeridas en
medios definidos
libres de suero
Insulina
Transferrina
Factores de
crecimiento
especficos

Tabla 2. Composicin de medios de cultivo para clulas de mamfero.

* La penicilina y la estreptomicina son antibiticos y la anfotericina es un antimictico,
se adicionan para impedir el crecimiento de bacterias y hongos contaminantes,
respectivamente. El rojo fenol es un indicador de pH. Tomado de [1].

3. Recipientes para el cultivo de clulas

Existen numerosos contenedores y recipientes para cultivar clulas y tejidos,
dependiendo de las caractersticas de las clulas a cultivar y de la escala deseada.
Cuando se cultivan clulas para hacer experimentos, se hacen cultivos a pequea escala.
En esta escala, las clulas de multiplican en frascos que tienen una base de 25 a 175 cm2
(Figura 3). En un recipiente tpico de 175cm2 pueden obtenerse aproximadamente 107
clulas adheridas, y unas 108 clulas cuando se trata de lneas que crecen en suspensin.
En las botellas de cultivo estndares no es posible producir cantidades mayores de
clulas, dada la cantidad de tiempo insumida para los repetidos pasajes necesarios a
medio fresco, la demanda de espacio en un incubador (que controla la composicin de
gases, la temperatura y la humedad del entorno) y el costo de los insumos.
Una vez que las clulas llegan a confluencia (forman una monocapa que cubre todo el
recipiente de cultivo), el cultivo se divide en nuevos cultivos de menor cantidad de
clulas que pueden seguir reproducindose. Para lograrlo, la muestra es tratada con
diversas enzimas proteolticas (como tripsina y colagenasas) que degradan las protenas
de la matriz extracelular; y tambin se utilizan agentes (como el EDTA -cido
etilendiaminotetraactico-) que secuestran al in calcio, del cual depende la adherencia
celular. De esta forma, y mediante una suave agitacin, se obtiene una suspensin
celular de la cual se pueden hacer diluciones.

Figura 3. Distintos recipientes para cultivo de clulas. Tomado de

http://www.dwscientific.co.uk/whitley_workstations.php

4. Recuento de clulas: cmara de Neubauer

En Biologa Celular es comn el encontrarse con la necesidad de conocer el nmero de
clulas que presentes en un volumen dado; por ejemplo, cuando se realizan cultivos
celulares se precisa saber cuantas clulas se encuentran en un momento con respecto al
nmero de clulas que inicialmente se sembraron. En tales casos se requiere de un
instrumento que permita contar directamente, o bien, calcular la concentracin celular
en un medio. Para resolver el problema de conteo celular, se ha optado, en algunos
casos, por calibrar sistemas espectrofotomtricos, cuyo fundamento se basa en las
propiedades de absorcin de la luz por parte de las clulas; sin embargo, tales sistemas
son poco exactos y los resultados que se obtienen son difciles de repetir. Una
alternativa a este problema es el contar directamente el nmero de clulas presentes en
un volumen conocido. Esto puede resultar un gran trabajo considerando el tamao de
algunas clulas, sin embargo, la cmara de Neubauer permite contar clulas de
distintos tamaos de manera muy prctica.

Figura 4. Cmara de Neubauer (izquierda) y esquema de la cuadrcula utilizada para el recuento de

clulas (derecha). Tomado de http://dk.cryosinternational.com/clinics/products/counting-chamber.aspx

La cmara de Neubauer tiene la apariencia de un portaobjetos grueso; en una cara

tiene una placa muy delgada de metal grabada con dos cuadrculas muy finas de
medidas definidas (Figura 4), y separadas una de otra por una ranura. El fondo de la
cmara del campo central es usualmente 0,1 mm ms bajo (= profundidad cmara) que
ambos campos adyacentes. Entre campo central el cubreobjetos que se coloca sobre la
misma existe por tanto una ranura de 0,1 mm. La limitacin lateral del volumen a contar
se establece mediante la cuadrcula de recuento. De esta manera, es posible conocer el
volumen de muestra celular que se coloca en la cmara, y slo es necesario contar el
nmero de clulas presentes en ese volumen. La concentracin de la suspensin de
clulas estar dada entonces por la cantidad de clulas contadas sobre el volumen de la
cuadrcula (superficie contada * profundidad de la cmara).
DESARROLLO DE LA PRCTICA
1. Reconocimiento del equipamiento y materiales necesarios para el cultivo: flujo
laminar, estufa de cultivo, bao trmico, pro-pipetas automticas, placas y botellas de
cultivo. Discusin de las pautas para el trabajo en esterilidad.
2. Observacin de lneas celulares en cultivo, con distintos grados de confluencia.
Analizaremos las lneas celulares HC11 (epiteliales mamarias de ratn) y HeLa (clulas
de cncer cervical humano).
3. Preparacin de una suspensin de clulas mediante su incubacin con tripsina.
4. Recuento de clulas utilizando la cmara de Neubauer.
5. Preparacin de un subcultivo para continuar la lnea. Preparacin de placas con una
cantidad controlada de clulas.

REFERENCIAS
[1] Molecular Biology of The Cell. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith
Roberts, Peter Walter. Publisher: Garland Publishing Inc.
[2] Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de clulas animales). Lic. Mara Eugenia Segretn.
INGEBI-CONICET - Dpto. FBMyC, FCEyN-UBA
[3] http://www.brand.de/fileadmin/user/images/products/Clinical_Lab/Counting_Chambers/counting-s.pdf