PRCTICA N 15

ACTIVIDAD ENZIMATICA EN TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES

I.

OBJETIVO(S):
o
o
o
o
o

II.

Estudiar el efecto de una enzima presente en tejidos animales y

vegetales.
Comparar la accin de la peroxidasa (catalizador presente en tejidos
orgnicos) y del MnO2 (catalizador inorgnico) sobre un mismo sustrato
(agua oxigenada)
Estudiar el efecto de la temperatura en la intensidad de la reaccin
Medir la actividad cataltica por medio del desprendimiento de burbujas
y la produccin
de calor.

MARCO TERICO:
Las enzimas son protenas especficas que actan como catalizadores de
las reacciones bioqumicas de todos los seres vivos. La actividad enzimtica
puede comprobarse experimentalmente mediante la identificacin y
cuantificacin de los productos formados de la reaccin que ellas regulan.
La actividad celular depende completamente de que en la clula ocurran
una serie de reacciones qumicas de naturaleza compleja. Las molculas de
los compuestos no reaccionan unas con otras a menos que sean activadas
de alguna manera. Una forma de activar las molculas es aplicando calor.
El cambio en temperatura hace que unas molculas aumenten su
movilidad, choquen con otras y reaccionen entre s. La energa que se
requiere para provocar esa activacin se conoce como energa de
activacin (Ea). En los sistemas biolgicos, es imposible calentar a
temperaturas muy altas, por lo que dichos sistemas dependen de las
enzimas. Las enzimas son generalmente protenas cuya funcin es reducir
la energa de activacin en los sistemas biolgicos, por lo que se dice que
son catalizadores orgnicos.
Para que ocurra una reaccin enzimtica, es necesario que estn presentes
la enzima y el sustrato, que es la sustancia que reacciona con la enzima
para formar productos finales. Bajo condiciones especficas, las enzimas
acomodan el sustrato, formando un complejo enzima-sustrato. La reaccin
entre la enzima y el sustrato ocurre en un lugar especfico de la enzima,
que se conoce como el sitio activo. Cuando el sustrato es el adecuado
para la enzima se dice que hay afinidad entre la enzima y el sustrato. Las
enzimas de por s no resultan afectadas por mucho tiempo durante la
reaccin. Intervienen por el tiempo necesario, luego del cual el complejo
enzima-sustrato se disocia, generndose los productos y la enzima
nuevamente. La enzima est entonces lista para ser reutilizada en otra
reaccin.

Las enzimas funcionan generalmente bajo condiciones especficas y

controladas. Tanto el pH, como la temperatura deben mantenerse en
condiciones ptimas para que la enzima pueda funcionar adecuadamente.
Los cambios extremos en cualquiera de esos dos parmetros pueden
resultar en la desnaturalizacin de la enzima. El proceso de
desnaturalizacin puede resultar en cambios reversibles o irreversibles en
la estructura qumica de la enzima. Esos cambios alteran la estructura del
sitio activo y se dice que la enzima est inactiva.
Otros factores que pueden afectar la actividad de una enzima son la
concentracin de sustrato, la concentracin de producto y la presencia de
inhibidores.
En esta prctica se disean experimentos utilizando un catalizador
inorgnico (MnO2) y otro orgnico (peroxidasa); esta ltima, se encuentra
tanto en tejidos animales como vegetales y acta sobre el perxido de
hidrogeno o agua oxigenada (H2O2). El perxido es un producto de la
actividad celular y el acumularse en exceso intoxica la clula por lo cual
debe ser degradado por una enzima especfica. La reaccin en la cual
interviene la peroxidasa se presenta de la siguiente manera:

2 H2O2 2 H2O + O2
Esta reaccin puede visualizarse por la formacin de burbujas, las cuales se
producen debido al desprendimiento de oxgeno. La cantidad de burbujas
en una medida cualitativa proporcional a la intensidad de reaccin y puede
utilizarse para evaluar la dinmica de la reaccin.
III.

MATERIA PRIMA, EQUIPOS Y REACTIVOS:

o
o
o
o
o
o
o
o

Hgado de res
Papa blanca
Agua destilada
Agua oxigenada de 30
volmenes
Dixido de manganeso
Balanza analtica ( 0,0001
g)
Pipetas de 2 cc
Tubos de ensayo

o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

Gradilla
Licuadora
Tabla de picar y cuchillo
Placas petri
Esptula
Bao de agua caliente
Balanza analtica
Cronometro
Soporte universal
Termmetro

IV.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Accin de un catalizador inorgnico sobre el H2O2: Marque cuatro tubos de
ensayo con los nmeros 1, 2,3, 4 agregue a cada tubo lo que pueda tomar
con la punta de una esptula dixido de manganeso (procure que las
cantidades sean constantes para todos los tubos) y proceda de la siguiente
manera:

tubo 1 MnO2 2 ml H2O2. Observar la reaccin

Como podemos observar al agregar agua oxigenada hubo un intenso
burbujeo debido al desprendimiento de oxgeno.

tubo 2 MnO2 bao mara x 10 mn. 2 ml H2O2. Observar la reaccin

como podemos observar aqu la temperatura no influye tanto en el

desprendimiento de oxgeno.

 tubo 3 MnO2 bao en hielo x 10 mn. 2 ml H2O2. Observar la reaccin

una vez al ser sometida al hielo y al agregarle agua oxigenada la
reaccin resulta ser la misma q la anterior en cual podemos decir
que todo catalizador inorgnico ,la variacin de temperatura no
afecta la actividad enzimtica en la cual el agua oxigenada se
transformara en agua y oxgeno.

tubo 4 MnO2 4 ml H2O2. Observar la reaccin

Aqu la reaccin es ms intensa debido a que se agreg ms agua
oxigenada.

 Accin de un catalizador de origen vegetal sobre el H2O2: Marque cuatro

tubos de ensayo con los nmeros 1, 2, 3, 4 agregue a los tubos 1, 2,3 un
pedazo de papa (procure que las cantidades sean constantes para todos
los tubos); Para el tubo 4, realice un licuado de papa y agregue al tubo
una cantidad similar al de los tubos anteriores, luego proceda de la
siguiente manera:

tubo 1 trozos de papa 2 ml H2O2. Observar la reaccin

tubo 2 trozos de papa mara x 10 mn. 2 ml H2O2. Observar la
reaccin
tubo 3 trozos de papa en hielo x 10 mn. 2 ml H2O2. Observar la
reaccin
tubo 4 licuado de papa 2 ml H2O2. Observar la reaccin
En este experimento como podemos observar aqu si influye de
manera considerable la variacin de temperatura , en la cual en el
tubo 1 y 4 si hubo reaccin con el agua oxigenada en la cual hubo un

burbujeo intenso debido al desprendimiento de oxgeno. Ms aun en

el tubo 4 ya que fue licuado hubo ms reaccin.
En cambio en el tubo 2 y 3 al disminuir y aumentar su temperatura
afecto considerablemente la reaccin por poseer un catalizador
organico al inactivar la actividad enzimtica.

Medicin de la accin de una enzima en trminos de la produccin de

calor: Haga el montaje de tal manera que pueda proceder como se
indica a continuacin: Coloque un tubo de ensayo en una gradilla y
adicione una cantidad constante de muestra homogenizada (papa e
hgado, un tubo para cada muestra), inserte en cada tubo un
termmetro con la escala de tal forma que pueda leer los valores (el
termmetro debe dejarse descansar libremente). Tome la temperatura
inicial. Posteriormente proceda de la siguiente manera:
Muestra con papa
Tiempo en seg.
0
30
60
90

Temperatura
C
20
22
24
25

Aqu en esta experimentacin podemos observar q la accin de un enzima

aumenta con la temperatura.

100
90
80
70
60
tiempo ( s)

50
40
30
20
10
0
20

22

24

25

temperatura C

V.

DISCUSIN DE RESULTADOS

Segn nuestras observaciones la muestra que reaccion ms rpido en

el sentido de la liberacin de espuma y calor que se obtena por entrar
en contacto con el H2O2 descomponindola a la vez en H2O y O2 fue la
muestra del dixido de manganeso
, por poseer un catalizador
organico ,seguidos por las muestras de papa en la cual hubo resultado
en los q no fueron sometidos a variacin de temperatura.

Este catalizador llamado enzima es una protena. La enzima catalasa

que se encuentra en los tejidos de las clulas animales y vegetales,
acelera la reaccin de descomposicin del H2O2. Los Perxidos de
Hidrgeno son los productos de oxidacin de muchas de las reacciones
que ocurren en nuestro cuerpo y dems seres vivos, estos son txicos.
Por lo tanto, deben ser eliminados rpidamente, y es ah donde acta la
enzima catalasa, donde pudimos observar claramente en las distintas
muestras.

Debido a la accin de la enzima catalasa, el agua oxigenada o perxido

de hidrgeno agregado se transformar en agua y oxgeno. El

desprendimiento de oxgeno se pone de manifiesto como un intenso

burbujeo.
VI.

VII.

CONCLUSIONES

Al plantear una hiptesis y ponerla a prueba por medio de la

experimentacin, hemos podido concluir que todas las clulas vivas, ya
sean clulas que conformen tejidos animales o vegetales, cuentan con
catalizadores especficos, denominados enzimas, los cuales sirven para
ayudar a acelerar la velocidad de los procesos metablicos, como los son
la obtencin de energa y la obtencin de los componentes necesarios
para la supervivencia de estas clulas.

Todos estos procesos se llevan a cabo a travs de un gran nmero de

reacciones qumicas que transcurren de forma constante y ordenada.
Adems, como cualquier catalizador las enzimas recuperan su estado
inicial despus de cada ciclo cataltico. Tambin podemos concluir que
las reacciones de las enzimas pueden ser afectadas en su funcin, tanto
por
factores
de
temperatura
denominado
el
proceso
de
desnaturalizacin y cuando las clulas han dejado de ser orgnicas, es
decir, que forman parte de la materia muerta o se les considera clulas
muertas, en las cuales todas sus reacciones qumicas y metablicas ya
no responden a ninguna reaccin ni proceso.

Esto se pudo comprobar haciendo experimentos adicionales que nos

aclararon las dudas, adems de la informacin recopilada que pudo
hacer valer nuestra hiptesis.

CUESTIONARIO:
1. Cul es la funcin de un catalizador sobre la velocidad de
reaccin?
El catalizador funciona proporcionando un camino de reaccin
alternativo al producto de reaccin. La velocidad de la reaccin aumenta
a medida que esta ruta alternativa tiene una menor energa de
activacin que la ruta de reaccin no mediada por el catalizador. La
dismutacin del perxido de hidrgeno para dar agua y oxgeno es una
reaccin que est fuertemente afectada por los catalizadores:
2 H2O2 2 H2O + O2

Esta reaccin est favorecida, en el sentido de que los productos de

reaccin son ms estables que el material de partida, sin embargo, la
reaccin no catalizada es lenta. La descomposicin del perxido de
hidrgeno es de hecho tan lenta que las soluciones de perxido de
hidrgeno estn disponibles comercialmente. Tras la adicin de una
pequea cantidad de dixido de manganeso, el perxido de hidrgeno
reacciona rpidamente de acuerdo a la ecuacin anterior. Este efecto se
ve fcilmente por la efervescencia del oxgeno.4 El dixido de
manganeso puede ser recuperado sin cambios, y volver a utilizarse de
forma indefinida, y por lo tanto no se consume en la reaccin. En
consecuencia, el dixido de manganeso cataliza esta reaccin.
2. Diagrame el mecanismo de accin enzima-sustrato soportado
sobre las nuevas teoras existentes?
En la elucidacin de los mecanismos de reaccin de las enzimas, y
principalmente
aquellas
que
involucran
un
ion-metlico
o
metaloenzimas, se requiere conocer: 1) La afinidad de los reactantes, las
coenzimas y los cofactores; 2) Las constantes de velocidad para cada
paso; 3) Las relaciones geomtricas tridimensionales entre los
reactantes, las coenzimas en relacin a los sitios catalticamente
importantes de la enzima; y 4) el mecanismo de cada paso, es decir los
arreglos atmicos y electrnicos. El mecanismo qumico est
determinado por el tipo de rompimiento y formacin de enlaces que
lleva a cabo la enzima. Se ha propuesto que las enzimas contienen en
sus "centros activos" cidos (AH) o bases (B) de manera que se puede
calcular su fuerza cida o bsica. As la pepsina, enzima que cataliza la
hidrlisis de ciertos enlaces ppticos en el estmago, tiene un valor de
fuerza cida (pK) de 2.2. El nico grupo orgnico que puede dar este
valor es el COOH-. Tambin hay enzimas con caracter bsico como la
quimotripsina y la colinesterosa con un pK=7.2.
El hecho de que puedan existir esos dos tipos de grupos cidos y bsicos
al mismo tiempo es posiblemente la explicacin qumica del efecto tan
selectivo observado en la catlisis por enzimas, ya que el ataque
simultneo por las dos especies cida y bsica debe traducirse en una
mejora muy notable de la velocidad y la selectividad, con un mecanismo
que podra llamarse de "estira y afloja". El equivalente en catlisis
heterognea podra ser un mecanismo bifuncional (que comprende dos
funciones con dos tipos de sitios diferentes), con la salvedad de que en
la enzima los dos activos pueden actuar sobre la misma molcula al
mismo tiempo y en la heterognea esto no es posible.
La complejidad de la estructura de las enzimas se puede comprender al
observar la estructura bsica de la carboxipeptidosa A, que es una
molcula relativamente simple con un peso molecular de 36 400
(existen enzimas de peso molecular de 600 000), su estructura obtenida

por microscopa electrnica se muestra en la figura 4. La enzima es

ligeramente elipsoidal de dimensiones 50 X 42 X 38 Angstroms. En esta
estructura se pueden ver un enlace azufre-azufre en el extremo derecho,
y un tomo de zinc (Zn2+) en el centro, alrededor del cual se sita el
"sitio activo". El ion Zn2+es absolutamente esencial para la actividad
enzimtica de la carboxipeptidosa A. Sin embargo se puede cambiar ese
ion por otros iones metlicos como Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, etc.,
cambindose tanto la actividad como la selectividad de la enzima.
Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas son en
general proporcionales a la primera potencia de la concentracin de la
enzima (son de primer orden respecto a la enzima). Sin embargo, es
frecuente encontrar una dependencia de la concentracin del sustrato
(sobre el que acta la enzima), como se muestra en la figura 5. La
velocidad vara linealmente con la concentracin de sustrato a
concentraciones bajas (primer orden respecto al sustrato) y se hace
independiente de la concentracin de ste (orden cero) a
concentraciones elevadas. Este tipo de comportamiento fue explicado
por Michaelis y Menten en funcin del mecanismo siguiente:
1. Interaccin de la enzima con el substrato (reactivo), para formar un
complejo intermediario
k1
E+S
ES
k-1
2. Descomposicin del complejo intermediario para dar los productos y
regenerar la enzima
k2
ES
E+P
E es la enzima, S el sustrato, ES un complejo y P es el producto.
Aplicando el tratamiento cintico denominado del estado estacionario,
en el que se asume que la concentracin del complejo intermediario es
constante obtenemos
K1[E] S - k_1 [ES] K2[ES] = 0

Si la concentracin total de la enzima [E]o es igual a la suma de la

concentracin en enzima libre [E], ms la concentracin de enzima que
forma el complejo [ES]:

I
I

[E]o = [E] + [ES]

Introduciendo [E] de la ecuacin II en la ecuacin I, tenemos:

K1 ([E]o - [ES]) [S] - (K_1 + K2)[ES] = 0
de donde podemos obtener la concentracin de enzima que est
formando el complejo:

Se asume que la etapa determinante de la reaccin es la

descomposicin del complejo, entonces la velocidad de la reaccin es
v=k2[ES] en donde se substituye [ES]

que rearreglando nos da:

III

donde km =

se denomina constante de Michaelis.

De la ecuacin III se deduce que cuando [S] es suficientemente

pequea,

lo que indica primer orden respecto

a la concentracin de sustrato. Por
el contrario, cuando [S] es mucho
mayor que Km, v = k2 [Eo]
y la cintica es orden cero respecto
al sustrato. En ambos casos el
orden es 1 para la concentracin de
enzima. La ecuacin III da cuenta
entonces
del
comportamiento
observado en la figura 1.

Figura 1. Dependencia tpica de la velocidad de una reaccin

enzimtica como funcin del sustrato S
Muchas reacciones obedecen la ley de Michaelis (ecuacin III), sin
embargo, el mecanismo queda an en la duda ya que a travs de otro
mecanismo complejo es posible llegar a la misma ecuacin cintica. El
efecto del cambio de pH en las velocidades de las reacciones
catalizadas por enzimas se puede observar en la figura 6. Se tiene un
mximo y la primera explicacin de este hecho fue dada por Michaelis.
La idea bsica es que el centro activo de la enzima puede existir en tres
estados de ionizacin dependiendo de la fuerza cida,
Kb

ka

EH2

EH
E

Las constantes de disociacin se representan por kb y ka. Cada una de

las tres formas de la enzima puede interaccionar con el sustrato,
Kb

ka

EH2
ES

EHS

Si se postula que slo EHS puede dar productos, el esquema de reaccin

queda entonces

EH2

EH
2S

EH

EH
S

E
S
K2

EH

+P

As, en solucin cida, la enzima estar en la forma EH2 y formar con el

reactivo el complejo EH2; este complejo se descompone para dar otro
complejo EHS, el cual a su vez se descompone para dar los productos y

luego entonces la velocidad ser

pequea (lado izquierdo de la figura
6). Si
la solucin
es bsica
predominan las formas E y ES y la
velocidad ser tambin pequea. A
cierto pH intermedio, llamado pH
ptimo,
se
observar
la
concentracin mxima de EHS y ser
por lo tanto el mximo de la
velocidad.
Los
estudios
sobre
velocidades
de
reacciones
catalizadas por enzimas a diversos valores de concentraciones y pH han
permitido obtener los valores de las constantes de disociacin ka, kb,
k'a y k'b.

Las dos primeras corresponden a informacin sobre la naturaleza del

centro activo. Por ejemplo, la pepsina, enzima que cataliza la hidrlisis
de ciertos enlaces peptdicos en el estmago tiene un pK = 2.2, siendo
el nico grupo orgnico conocido que puede dar este valor el grupo
carboxilo (-COOH), concluyndose que esta enzima trabaja en
condiciones muy cidas equivalentes a las de un cido actico (principal
constituyente del vinagre).
Figura 2. Variacin de la velocidad en funcin del pH, para una
reaccin enzimtica
Los valores de k'a y k'b proporcionan informacin respecto de la forma
en que los grupos ionizantes del centro activo tienen interaccin con el
sustrato. La influencia de la temperatura en la velocidad ha suministrado
informacin valiosa acerca de los mecanismos enzimticos. Sin
embargo, una complicacin surge del hecho de que las enzimas por s
mismas experimentan un proceso de desactivacin que tiene una
energa de desactivacin muy alta, por lo que a 35C o ms
(dependiendo de la enzima) se puede observar una desactivacin muy
rpida. Por ello es frecuente encontrar que las velocidades catalizadas
por enzimas pasan por un mximo al ir subiendo la temperatura. A 60C
por ejemplo, muchas propiedades de la enzima se alteran, algunas de
ellas irreversiblemente. Estos cambios se conocen con el nombre de
desnaturalizacin y son los responsables del decrecimiento de la
actividad de la enzima.TABLA 1. Efecto cataltico de algunas
enzimas para diferentes reacciones

En la tabla 1 se dan los valores de las constantes de velocidad, energas

de activacin y factores preexponenciales de tres reacciones catalizadas
por enzimas y se incluyen a ttulo de comparacin los valores de otros
catalizadores.