REPASO DE PROTENAS

M. En C. Martha R. Hidalgo Morales

JERARQUA DE LA ORGANIZACIN DE
PROTENAS
Primaria
Motivos de secuencia

Secundaria
Motivos estructurales

Dominios
Terciaria
Cuaternaria

ESTRUCTURA PRIMARIA DETERMINA 3D

Geometra molecular est determinada por:
Distancias de enlaces
ngulos de separacin
ngulos diedros (torsin)
Entre 2 planos

The CORN rule

Excepto gly todos son L-aas

EL ESQUELETO EST PREFERENTEMENTE

UBICADO EN GEOMETRA TRANS
Depende de la posicin en la que queden los C subsecuentes

NGULOS DIEDROS Y ESTRUCTURAS

SECUNDARIAS
Estructura secundaria est definida por
Fzas de repulsin de van der Waals
Torsiones permitidas del esqueleto

Diagrama de Ramachandran
Probabilidad de formar estructuras
Puntos fuera
Alta energa (locales)
2-5% conformaciones alta energia
normal

DIAGRAMAS DE SOLUBILIDAD
Diagrama bsico de solubilidad
a T cte.
Zona soluble
Zona metaestable
Solucin supersaturada de
protena
Nucleacin de cristales
Precipitacin

Zona de descomposicin

TEMODINMICA VS CINTICA
Termodinmica
Cintica

determinar si puede ocurrir

si realmente pasa

Cristalizacin: separacin de fases

Una solucin termodinmicamente metaestable bajo el control de parmetros
cinticos

MTODOS Y TCNICAS DE ESTUDIO

DE PROTENAS
M. En C. Martha R. Hidalgo Morales

CRISTALOGRAFA
Historia
Fundamento
Geometras de cristales
Cristalografa de rayos X
Equipos de cristalografa
Interpretacin de estructuras proteicas

DESCUBRIMIENTO
1880s
placas fotogrficas con sombras cerca de
tubos Crookes
1877

Puyui tubos de descarga al vaco

1895

Rntgen estudio sistemtico

"On a new kind of ray: A preliminary communication"

Rayos X

cantidad/origen desconocidos

Rayos Rntgen

DESCUBRIMIENTO
1880s
placas fotogrficas con sombras cerca de
tubos Crookes
1877

Puyui tubos de descarga al vaco

1895

Rntgen estudio sistemtico

"On a new kind of ray: A preliminary communication"

Rayos X

cantidad/origen desconocidos

Rayos Rntgen

Wilhelm Conrad Rntgen

DIFRACCIN DE RAYOS X
Cristal de sulfuro de zinc
Rayos X son ondas
electromagnticas
Max Laue

Construccin espacial de los

cristales en forma de red
Ewald discute tema con Laue

sugiere idea

Friedrich y Knipping

experimentan

Separacin ptos de la red a distancia

adecuada para interferir rayos X a

COMIENZA LA HISTORIA
Laue puntos de difraccin causados por rayos X que
inciden en una matriz regular de dispersores
Policromtica
Estructura de ZnS arreglo 3D de pequeos cubos
Zn y S alternan esquinas

Los Bragg
Reflexin de rayos X por planos de tomos dentro del
cristal arreglo 3D
Sir William Henry
Bragg and Sir William
Lawrence Bragg

LEY DE BRAGG
Propuestas de Lawrence:
Reflexin de rayos X por planos de tomos dentro del
cristal arreglo 3D
Ley de difraccin de rayos X de Bragg

tomos no estn slo en orillas en arreglo 3D, tambin

al centro de las caras de cada cubo
Resolucin de la primera estructura
The Specular Reflection of X-rays, Nature 1912

http://www.iycr2014.org/timeline

Sir William Henry

Bragg and Sir William
Lawrence Bragg

QU ES UN CRISTAL?
Slido homogneo
Simetra

Alto grado de orden interno

Sist. que exhiben orden 3D
Enrejados
Celdas unitarias

Orden en dimensiones atmicas

Silica

cuarzo o cristal

Composicin qumica estequiomtrica *

CELDAS UNITARIAS
Pequea caja que contiene tomos
arreglados en 3D
Puntos y parmetros de red:
longitudes de separacin (a,b y c)
ngulos (, y )
Posiciones atmicas (xi, yi, zi)

Calculada a partir de la representacin ms

simple posible
Unidad asimtrica

14 CELDAS UNITARIAS
Auguste Bravais (1850)
La celda unitaria es la unidad de
repeticin de un cristal
Caras opuestas de la celda
unitaria son paralelas
El borde de la celda unitaria
conecta puntos equivalentes

TIPOS DE CRISTALES
7 Sistemas cristalinos
Triclnico
Monoclnico
Ortorrmbico
Tetragonal
Trigonal

Redes
Primitivas
Un punto de la red por celda
unitaria

No primitivas
Ms de 1 punto de la red por
celda unitaria

Hexagonal
cbico

14 tipos de redes de Bravais

Arreglo geomtrico de los puntos de red y la
simetra translacional del cristal

CLASIFICACIN POR PROPIEDADES

FSICO-QUMICAS
Covalentes
Enlaces covalentes entre todos los tomos del cristal
Ejemplo: diamante, son cristales grandes

Metlicos
tomos de metales en la red, electrones externos flotan alrededor de la red
Altos puntos de fusin y densidades

Inicos
tomos unidos por fuerzas electrostticas (NaCl)
Son duros y tienen altos puntos de fusin

Moleculares
molculas reconocibles, estructura unida por interacciones no covalentes o puentes de H
Son suaves y con bajo punto de fusin (azcar)

FORMACIN DE CRISTALES
Empacamiento
Lento

compacto y termodinmicamente favorable (estable)

cristales ms estables

Nucleacin
No asistida
Tamao crtico

fzas. de atraccin fuertes

Asistida
Ayuda de S2 slida

protocristal

protocristal (agregados)

The great complexity of proteins

make it unlikely that a complete
structure determination for a protein
will ever be made by X-ray methods
alone.
Linus Pauling (1939)

DIFRACCIN DE RAYOS X
Tcnica experimental que aprovecha la difraccin de rayos X por los
cristales
No genera imagen patrn de difraccin por nubes electrnicas
Mapa 3D que muestran la distribucin de electrones en la estructura
Reconstruccin de densidad electrnica
Modelo experimental

modelo estructural

Dispersin elstica
Misma , slo hay cambio de direccin
10- 0.01 nm, tpica es 0.1 nm escala de enlaces covalentes
Rayos X monocromticos ms estudiado
Laue policromtico

DIFRACCIN DE RAYOS X PARA

BIOMOLCULAS
Braggs y el sper equipo
Max Perutz y Rosalyn Franklin

1962

mioglobina de esperma de ballena (Kendrew & Perutz)

86817 estructuras: protenas, cidos nucleicos y otros (grandes)

NMR

9561 estructuras (pequeas > 70kDa)

POR QU NECESITAMOS UN CRISTAL?

Tamao de las molculas no apto para microscopios
Orden tridimensional de molculas (cristal) para magnificar la seal
Informacin de estructura y comportamiento dinmico
Cristal proteico

billones de molculas

La resolucin de la estructura est en funcin del orden interno del cristal

Red tridimensional de difraccin
Interferencias constructivas y destructivas

puntos discretos (reflexiones)

Info de la estructura
Cada tomo contribuye a la intensidad de cada reflexin
Slo se registra la amplitud

problema de fase

Resolver la estructura implica resolver el problema

Protein crystallography is a very hot field in the biosciences these

days. Protein crystallography is a very hot field in the biosciences
these days.

WORKFLOW FOR PROTEIN STRUCTURE DETERMINATION

BY X-RAY DIFFRACTION

RESPECTO A LA PURIFICACIN
Purificarla o expresar en un vector
Est pura y homognea la muestra
Est soluble y plegada
Es una muestra monodipersa
La protena est activa
Es estable la muestra

CRISTALIZACIN
Diagramas de solubilidad
Ensayos empricos para encontrar las mejores condiciones

Diagrama de fases tpico de

protenas

EXISTE UNA BARRERA ENERGTICA PARA

LA CRISTALIZACIN
Por qu una protena no cristaliza o precipita en cuanto se alcanza la
saturacin?
Barrera energtica para romper el equilibrio del sistema
Ncleo crtico
Intermediario de alta energa

Barreras energticas altas

Menor velocidad nucleacin

Diagrama de energa para cristalizacin

MTODOS DE CRISTALIZACIN DE
PROTENAS
Mtodo de difusin de vapor
Difusin de vapor de agua
Super-saturacin inestable
Cristalizacin y precipitacin
Competencia
Condiciones ptimas

EN SUS MARCAS, LISTOS .

Crystallisation proceeds in two phases:
nucleation and growth.
After nucleation metastable
zone,
best conditions are found for
the growth of large wellordered crystals.
protein concentration in the
supersaturated state:
(I) crystallization, (II) precipitation

DIAGRAMAS DE FASE PARA CRISTALIZACIN

POR DIFUSIN DE VAPOR

CRISTALES PROTEICOS
Cristales proteicos frgiles, suaves y sensibles (variaciones amb)
50% de solvente
Interacciones dbiles mayora
Comenzar con altas concentraciones
2-50 mg/mL
Screening inicial

optimizacin sistemtica

Robots;. Phoenix/IMAX
nL, T cte, no vibraciones

OTROS MTODOS PARA CRISTALIZAR

PROTENAS
Gota colgante
Gota en sndwich

Tarea

En lote
Dilisis

Buscar fundamento
Disear un experimento sencillo
Buscar o hacer diagramas de fase
Explicacin experimental prxima clase
Equipos de 5 (1 de 6)

UNA VEZ QUE TENGO EL CRISTAL

Colectar datos
Montaje del cristal
En capilares con el licor madre
Ceras, aceites, fibra de vidrio
Loop de nylon o plstico
crioprotector

Enfriamiento
Nitrgeno lquido
Disminuye dao por radiacin
Ruido

INSTRUMENTACIN
Espectrmetro de Rayos X (Braggs)
Difractmetros
Gonimetros
Sincrotones

DESPUS DE TENER EL CRISTAL

DIFRACCIN DE RAYOS X SIMPLE

Difractmetros
Un solo rayo golpea al cristal
Produccin de rayos difractados
Patrn de difraccin en pelcula
Longitud y ngulos grabador mientras
rota el cristal