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MATERIALES
Timer
Agitador
Centrifuga para tubos de ensayo
Vortex
BUFFER DE LISIS I
Sucrosa 0.3M
Tris HCl 10 nM ph7.5
Cloruro de Mangnesio 5nM
Triton 100x
EDTA de sodio ph 8
NaCl
SDS 10% (sodio dodecil sulfato)
Perclorato de sodio 5M
NaCl 6M
Etanol 70%
Isopropanol
Agua destilada
METODOS
1. Usar guantes y tomar 1mL de sangre de un voluntario
(estudiante) en un tubo con EDTA y homogenizar
rpidamente para evitar coagulacin.
2. Pasar la muestra de sangre a un tubo de polipropileno,
agregar 4mL de buffer de lisis hasta 5mL tapar y mezclar
suavemente por inversin hasta 10 veces.
3. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm
4. Retirar el tubo, descartar el sobrante dejando escurrir
bien los tubos sin desprender el botn celular que se
encuentra en el fondo del tubo.
5. Adicionar 450 uL de buffer de lisis II, 13 uL de SDS 10% y
100 uL de perclorato de sodio 5M. Tapar el tubo y
mezclar en vortex durante 10 segundos.
6. Agregar 200 uL de NaCl 6M, tape el tubo y mezclar
fuerte en vortex (10 segundos). Centrifugar durante 5
minutos a 3000 rpm
7. Pasar el sobrenadante (contiene el ADN disuelto) a otro
tubo sin dejar pasar el precipitado en el cual quedan, los
restos de membranas, protenas, etc.
8. Agregar 700 uL de isopropanol, tape el tubo y mezclar
suavemente por inversin hasta visualizar las fibras de
ADN
9. Tomar un tubo epperidorf de 1,5 mL con 100 uL de agua
destilada. Marcarlo con el respectivo nombre.
10.Tomar el tubo que contiene el ADN y con las ayuda de
una punta envolver las fibras para retirarlas del tubo.
11.Colocar el ADN que est en la punta e introducirlo en la
bala que contiene el etanol al 70% y lavar el ADN con
esta solucin.
INVITACIN AL ESTUDIANTE
Qu mtodos de extraccin de ADN existen, explique cada
uno?
Fenol cloroformo:
- Tcnica organica (solventes).
-
Resina Chelex:
-
Tecnica inorgnica
Salting- out:
-
DISCUSIN
Despus de la realizacin de la prctica de laboratorio y la obtencin de los
resultados pudimos lograr el estudio del ADN por medio de mtodo de
extraccin Salting out, el cual nos muestra un menor grado de toxicidad,
siendo as uno de los ms sencillo y l nico que permite obtener una mayor
cantidad de ADN con respecto a los dems; sin embargo ste mtodo
demanda mucho tiempo debido a que para su completa realizacin se
necesita de llevar a cabo una gran cantidad de pasos, trayendo consigo un
mayor contenido de impurezas en la muestra.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
1. BROWN, T.A Gene cloning and DNA analysis: an introduntion. Oxford,
UK; Malden, MA, Blackwell Pub. 2006.
2. COOPER, G. M. and. R. E, Hausman. The cell: a molecular approach.
Washington, D.C Sunderland, Mass, ASM Press; Sinauer Associates.
2004.