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OBJETIVOS

- El objetivo principal de este laboratorio es aprender a visualizar las hebras


de ADN.
-Conocer los diferentes mtodos que se llevan a cabo para la extraccin de
las hebras de material gentico.
INTRODUCCIN
El cido desoxirribonucleico (ADN) es una macromolcula larga de aspecto
filamentoso, que en las clulas eucariotas se encuentra en el ncleo y en
pequeas cantidades en la mitocondria y el cloroplasto. Esta molcula est
formada por un gran nmero de nucletidos cada uno de ellos compuesto
por una base nitrogenada, un azcar y un grupo fosfato. Las bases son las
portadoras de una informacin gentica en tanto que el azcar y el fosfato,
tienen una funcin estructural. Las bases (purinas y pirimidinas) adems,
son de naturaleza aromtica lo que les permite absorber luz ultravioleta;
esta propiedad ha sido de gran utilidad en la detencin y cuantificacin del
ADN.
El estudio de esta biomolcula es importante para analizar el contenido y
funcin gentica mediante la aplicacin de tcnicas de biologa molecular;
esto comienza con la extraccin del DNA cuyo objetivo principal es lisar las
membranas celular y nuclear, y eliminar las protenas para obtener un DNA
puro e intacto. Como material gentico, el ADN proporciona un patrn que
dirije todas las actividades celulares y determina el plan de desarrollo de los
organismos multicelulares. Por lo tanto, entender la estructura gentica y su
funcin resulta fundamental para obtener una visin de la biologa
molecular de las clulas. El desarrollo de la clonacin de genes ha supuesto
un gran paso hacia estos objetivos, permitiendo a los cientficos diseccionar
genomas eucariotas complejos y probar las funciones de los genes
eucariticos.
En algunos aos el diagnstico de mltiples enfermedades depender de
anlisis moleculares, en esto radica la importancia de conocer la estructura
y funcin de esta molcula, por lo tanto este laboratorio presenta la
metodologa de Salting out para la extraccin de ADN genmico. Sin
embargo existen otros mtodos que se pueden utilizar, para obtener
muestras de ADN de diferentes tamaos y provenientes de diferentes
fuentes:
Reactivos orgnicos fenol-cloroformo: Es un mtodo convencional que
utiliza productos qumicos orgnicos para aislar el ADN genmico, se
prefiere en la extracin de manchas biolgicas que contienen pequeas
cantidades de ADN o de ADN degradado, por emplear reactivos orgnicos es
peligroso y por ser un procedimiento de multiples pasos se puede presentar
contamicacin de las muestras. El procedimiento se puede describir en
cuatro pasos: Solubilizacion de los componentes de la mancha,
desnaturalizacin e hidrlisis se las protenas, eliminacin de las protenas
desnaturalizadas y la purificacin del ADN.
Resina Chelex 100 al 5%: Es un proceso de extraccin por ebullicin de la
resina quelante en una solucin de pH alcalino en el proceso de ebullicin se
alteran las membranas de las clulas destruyendo las protenas y

desnaturalizando el ADN. Posteriormente se centrifuga la suspensin, se


separa la resina y los restos celulares como precipitando, y en el
sobrenandante contiene el ADN desnaturalizado. El ADN extrado es de
cadena sencilla por lo tanto no es muy conveniente para el anlisis por
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP)
Mtodos comerciales: Se caracterizan porque requieren poco volumen de
muestra, extraen ADN de alta pureza y tienen pocos pasos aspecto que
evita la contaminacin de las muestras.
Aunque el objetivo de esta prctica es aislar ADN genmico es importante
aclarar que cuando hablamos del ADN hemos de diferenciar el ADN
genmico, que se encuentra en el ncleo y contiene la mayora de los
genes, de los ADNs extranucleares, que se encuentran en la mitocondria y
el cloroplasto y contienen la informacin de ciertas protenas necesarias
para el funcionamiento de ciertas protenas necesarias para el
funcionamiento de esos orgnulos celulares.
El mtodo ``Salting out``: Permite extraer ADN genmico y consta de
varios pasos, el primero de los cuales es la homogeneizacin del material
empleado de manera mecnica en presencia de detergentes. Mediante esta
combinacin de accin mecnica y detergentes se rompen las distintas
membranas de la clula (citoplsmica y nuclear) y se libera el ADN al medio
de lisis. Los detergentes, adems, tienen una actividad inhibidora sobre
algunas protenas de tal manera que impiden la accin de las enzimas que
degradan el ADN liberadas al romperse los lisosomas de la clula. A
continuacin, se eliminan los grandes fragmentos de tejido y clulas por
medio de una centrifugacin, recuperndose el ADN y las protenas en la
solucin acuosa. Finalmente se recupera el ADN por medio de una
precipitacin alcohlica con etanol o isopropanol.

MATERIALES

Timer
Agitador
Centrifuga para tubos de ensayo
Vortex

Un tubo con anticoagulante EDTA (tapa lila)


Dos tubos de polipropileno de 15mL
Un tubo eppendorf de 1.5mL
Micropipeta de 200 y 1000 uL
Puntas para micropipetas
Recipientes para desechar tubos y material biolgico
Centrifuga
Gradillas
Guantes
Tapabocas

BUFFER DE LISIS I

Sucrosa 0.3M
Tris HCl 10 nM ph7.5
Cloruro de Mangnesio 5nM
Triton 100x

BUFFER DE LISIS II PH 8.0

EDTA de sodio ph 8
NaCl
SDS 10% (sodio dodecil sulfato)
Perclorato de sodio 5M
NaCl 6M
Etanol 70%
Isopropanol
Agua destilada

METODOS
1. Usar guantes y tomar 1mL de sangre de un voluntario
(estudiante) en un tubo con EDTA y homogenizar
rpidamente para evitar coagulacin.
2. Pasar la muestra de sangre a un tubo de polipropileno,
agregar 4mL de buffer de lisis hasta 5mL tapar y mezclar
suavemente por inversin hasta 10 veces.
3. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm
4. Retirar el tubo, descartar el sobrante dejando escurrir
bien los tubos sin desprender el botn celular que se
encuentra en el fondo del tubo.
5. Adicionar 450 uL de buffer de lisis II, 13 uL de SDS 10% y
100 uL de perclorato de sodio 5M. Tapar el tubo y
mezclar en vortex durante 10 segundos.
6. Agregar 200 uL de NaCl 6M, tape el tubo y mezclar
fuerte en vortex (10 segundos). Centrifugar durante 5
minutos a 3000 rpm
7. Pasar el sobrenadante (contiene el ADN disuelto) a otro
tubo sin dejar pasar el precipitado en el cual quedan, los
restos de membranas, protenas, etc.
8. Agregar 700 uL de isopropanol, tape el tubo y mezclar
suavemente por inversin hasta visualizar las fibras de
ADN
9. Tomar un tubo epperidorf de 1,5 mL con 100 uL de agua
destilada. Marcarlo con el respectivo nombre.
10.Tomar el tubo que contiene el ADN y con las ayuda de
una punta envolver las fibras para retirarlas del tubo.
11.Colocar el ADN que est en la punta e introducirlo en la
bala que contiene el etanol al 70% y lavar el ADN con
esta solucin.

12.Colocar el ADN en el tubo eppendorf; donde se deposit


el agua destilada. Asegurarse que se desprenda de la
punta y quede depositado en el agua.
13.Tapar el tubo y guardarlo en refrigeracin (2-8C), o
proseguir con su identificacin mediante electroforesis
en gel de agarosa al 1.5% o por espectrofotometra.
RESULTADOS
En la actividad realizada pudimos notar la importancia que se debe tener a
la hora de manipular los implementos de laboratorio (micropipetas,
probetas, etc.) y tambin el conocimiento de cada uno de los reactivos a
utilizar; ya que alguna equivocacin en la medicin de estos conllevar un
resultado errado y por ende la prdida de todos los pasos realizados hasta
ese momento.
De este laboratorio pudimos obtener y visualizar una hebra de ADN

INVITACIN AL ESTUDIANTE
Qu mtodos de extraccin de ADN existen, explique cada
uno?
Fenol cloroformo:
- Tcnica organica (solventes).
-

ADN de muy buena calidad y cantidad.

Peptidos y protenas son extraidas en la fase organica (fenol),


despus se realiza digestin con proteinasa K.
-

El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado.

DESVENNTAJAS: Reactivos altamente toxicos. Perdidas


significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.

Resina Chelex:
-

Tecnica inorgnica

Previene la degradacin del ADN por quelacin de los iones


metlicos durante la ebullicin al 5%
-

Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- iones iminodiacetato.

Los reactivos no son txicos y no se pierde ADN.

DESVENTAJAS: El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizando


en PCR pero no en RFLPS.

Salting- out:
-

Tcnica de tipo inorgnica

Utiliza reactivos bajos en toxicidad

Permite visualizar la malla de ADN

DESVENTAJAS: Requiere una mayor cantidad de muestra.

Qu papel cumple el SDS, el isopropanol, etanol 70%,


solucin de lisis y solucin precipitante y que sucede a nivel
bioqumico en los componentes celulares con cada uno de los
reactivos o soluciones usadas para la prctica?

Qu aplicaciones tiene el ADN en medicina?


La medicina usa diferentes herramientas para el mejoramiento de la
salud de los individuos. Hoy en da, el ADN en el campo de la
medicina se utiliza para curar enfermedades mediante el reemplazo
de un mal gen por uno bueno. Sin embargo, el uso de la modificacin
del ADN, tan comn en plantas y animales, sigue teniendo problemas
ticos importantes cuando se intenta aplicar en seres humanos.

DISCUSIN
Despus de la realizacin de la prctica de laboratorio y la obtencin de los
resultados pudimos lograr el estudio del ADN por medio de mtodo de
extraccin Salting out, el cual nos muestra un menor grado de toxicidad,
siendo as uno de los ms sencillo y l nico que permite obtener una mayor
cantidad de ADN con respecto a los dems; sin embargo ste mtodo
demanda mucho tiempo debido a que para su completa realizacin se
necesita de llevar a cabo una gran cantidad de pasos, trayendo consigo un
mayor contenido de impurezas en la muestra.
CONCLUSIONES

El ADN es el material gentico a travs del cual se transmite la


informacin obtenida en los genes de generacin en generacin.

Es de gran importancia conocer las condiciones para la toma de la


muestra y la con esto la extraccin del ADN.

El Salting out es uno de los mtodos de extraccin de ADN ms


utilizados por su fcil implementacin, baja toxicidad de los reactivos
y permite la visualizacin del ADN.

BIBLIOGRAFA
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UK; Malden, MA, Blackwell Pub. 2006.
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Panamericana. 2005. 776p. ISBN 8479035056.