Estructura y Funcin de los cidos nucleicos

Estructura de los acidos nucleicos

Estructura secundaria del ADN: Caractersticas Principales

Diferencias estructurales del ADN y el ARN

Porque Timina en el ADN y uracilo en el ARN?

Dos cadenas polinucleotdicas

enrrolladas en una doble hlice
dextrgira

H20
La Citosina se deamina espontaneamente
formando Uracilo

Las hebras son antiparalelas

Las enzimas reparadoras reconocen estas

"mutaciones" y reemplazan Us por Cs
NH3

Los esqueletos azucar-fosfato en el

exterior de la doble hlice

Porque 2-dideoxi en el ADN ?

Pares de base planares a trav s de

puentes de hidrgeno, en el centro
de la estructura
A T (2 H)
GC (3H)

Si no hubiera Timina (5-metil-U) como distinguir las

U normales de las resultantes de deaminacin?

Dos grupos OH en el ARN lo hacen ms

suceptible a hidrlisis.

Pares de base separados 3.4 A. Una

v uelta de hebra (3.4 nm) tiene
aprox. 10 pares de base

El ADN sin OH en 2 es ms estable a hidrlisis.

La posicin de los esqueletos

azucar-fosfato definen surco mayor
y menor.

Reglas de sntesis de molculas informativas

Odio ser una

molcula de
ADN!!

Acidos nucleicos y protenas

Hay tanta
informacin
que debo
recordar!!

Formados por un nmero

limitado de subunidades
Las unidades son
agregadas
secuencialmente formando
cadenas lineales

Flujo de informacin en
la clula

Cada cadena tiene un

punto de inicio, avanza en
una nica direccin y tiene
un punto de finalizacin
Los productos de la sntesis
primaria son modificados
previamente a cumplir su
funcin

Reconocimiento de ADN por protenas

Seales en el ADN

Seales

Donde comienza y termina un gen?

Donde comienza y termina una protena?

Como leer estas seales?

Legibilidad

Legibilidad de secuencias de ADN

La estructura de los cidos nucleicos no es rgida

Accesibilidad a la secuencia
(surcos mayor y menor)

Enlaces mvil es

Variacin con

Enlace N-glicosdico
Enlace Fosfo-di-ster

movimientos de pares de base

Formas alternativas del ADN

Movilidad de las bases

dependiendo de la secuencia v ara el
ngulo entre los pares de base

Ladeado

Abertura

Giro

Propulsor

10

Propiedades fisico-qumicas de los cidos nucleicos

Formas alternativas del ADN
forma A
condiciones de baja humedad
hbridos
ADN- ARN
ARN- ARN
11pb/vta
bases inclinadas
surco mayor profundo
surco menor angosto, mas expuesto

1. Desnaturalizacin de los cidos

nucleicos

forma Z
alternancia de purinas y pirimidinas
(CGCGCG)
lev gira
12 pb/vta
surco mayor muy profundo y cerrado
surco menor muy expuesto

Desnaturalizacin Parcial del ADN necesaria

para procesos de copiado

Aumento de Temperatura
Regiones ricas en AT se disocian primero

Experimental
Por temperatura
Se analiza mediante espectroscopa
Aumento de Temperatura
Disociacin cooperativa de las hebras

Separacin de hebras y
formacin de ovillos
Tm : un reflejo de la composicin promedio de un ADN
Depende del contenido de GC
Tm

Temperatura de disociacin
T a la que la mitad del ADN est disociado

11

12

Denaturalizacin de los cidos nucleicos: Tm

2. Renaturalizacin del ADN

Tm : un reflejo de la composicin promedio de

un ADN
Se analiza mediante espectroscopa
Depende del contenido de GC
Tm

Temperatura de disociacin
T a la que la mitad del ADN est disociado

Reaccin Bimolecular
Encuentro de hebra complementaria
Zipping de complementarias
depende del tiempo y de la concentracin de reactantes

Aplicaciones
Complejidad del genoma
Bsqueda de secuencias especficas

13

14

Reasociacin de ADN: complejidad del genoma

Cintica de reasociacin del ADN genmico humano

Permite analizar complejidad

de un genoma

Co t1/2 = 1 / k 2

k 2 = constante de segundo orden

Co = concentracin de ADN
t1/2 = tiempo medio de reaccin

Secuencias repetidas
reasocian rapidamente
Secuencias nicas
reasocian lentamente

50

rpido(repetidos)
intermedio
(repetido)

Co t1/2
Co t1/2

% DNA reasociado

% DNA reasociado

Fracciones obtenidas:
reasociacin rpida
reasociacin intermedia
reasociacin lenta

Co t1/2

100

50

Cot1/2
Cot1/2

lento (copia nica)

Cot1/2

log Co t

log Cot
15

intermedio
(repetido)

100

lento (copia nica)

16

Fracciones obtenidas:
reasociacin rpida
reasociacin intermedia
reasociacin lenta

rpido(repetidos)

3. Hibridacin de cidos nucleicos

3. Hibridacin de cidos nucleicos
Bsqueda de secuencias especficas
en mezclas complejas de cidos
nucleicos

En soportes slidos
Southern Blot
Northern Blot
Dot blot
Micro-arrays

ADN
ARN

En solucin
En soportes slidos

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Southern Blot
Northern Blot
Dot blot
Micro-arrays

ADN
ARN
18

Estructura terciaria de los cidos nucleicos:

palndromes, horquillas y cruciformes

19

20

Acidos nucleicos monocatenarios:

Estructura secundaria y terciaria

Topologa y funcin

Los ARN suelen adoptar distintas conformaciones, muchas de

ellas estables y mantenidas por regiones autocomplementarias

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Superenrrollamiento necesario para la compactacin del ADN y su funcin

In vivo la mayora del ADN est superenrrollado negativamente

Esto favorece la disociacin local de las hebras, importantes durante la

duplicacin y transcripcin

Enzimas topoisomerasas regulan los niveles de superenrrollamiento celular

Es posible que se formen estructuras alternativas debido a desenrrollamientos

locales generados por superrollamiento

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Topologa del ADN

Estructuras complejas de ARN

Como hace el ADN para caber en los limitados volumenes intracelulares?

Superenrrolamiento
Asociacin con protenas
El ADN relajado en forma B tiene 10 pb/vta.
Un ADN superenrrollado tiene mas o menos pb/vta.
(superenrrollamiento positivo o negativo)

Torsin (Twist)
Superenrrollamiento
o Retorcimiento
(Writhe)
Topoismeros
23

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Torsin y superenrrollamiento

Organizacin del material hereditario

Al superenrrollar el ADN se genera tensin, que se expresa en un desenrrollamiento

local del ADN (v ariando la torsion).
Al separar las hebras, se genera tensin que se resuelv e enrrollando sobre si misma la
molcula de ADN (v ariando el superenrrollamiento).

Lk = Tw + Wr

Volumen limitado
Neutralizacin de cargas del ADN

Ligazn (Linking number)

Torsin (Tw ist)
Superenrrollamiento o Retorcimiento (Writhe)

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Necesidad de compactacin

Organizacin funcional del ADN

mecanismos de segregacin en duplicacin
accesibilidad de protenas reguladoras de la expresin gnica

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El nucleoide bacteriano

El ncleo eucariota

El genoma bacteriano incluye un cromosoma circular

y molculas pequeas circulares (plsmidos)

10,000 nm

No existe ncleo definido

El genoma nuclear humano comprende

46 molculas de ADN lineales

ADN en regin nucleoide

El largo sumado de este ADN es mas de
1.5 metros
El dimetro del ncleo es aprox. 10 nm

Varios dominios de 40-80 Kb superenrrollados

asociado a ARN y protenas

27

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El ciclo celular

El nucleo interfsico

Durante la divisin se visualizan

cromosomas individuales
Los cromosomas metafsicos son
la forma ms condensada de la
cromatina

Cromatina
complejo compuesto por ADN y protenas
Eucromatina zonas menos condensadas
Heterocromatina zonas ms condensadas

Toda la cromatina se condensa previamente

a la divisin celular

Los cromosomas son herramientas de

segregacin del material hereditario
Cules son los pasos de compactacin?

29

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La cromatina: microscopa

La cromatina: bioqumica
Anlisis bioqumico

A partir de ncleos aislados se puede aislarse cromatina

Cantidades similares de ADN y protenas

Al microscopio electrnico se observan fibras de 30 nm y collar de cuentas de 10 nm

Digestin de ADN con nucleasas

repetidos de 160-200pb
Protenas bsicas HISTONAS

31

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Las histonas

Protenas bsicas pequeas

Altamente conservadas
Centro globular y colas ricas en Lys y Arg
Sitios de acetilacin de Lys en colas N terminales (+)
Sitios de fosforilacin en Ser en colas de H1

El octmero de histonas
Las histonas H2A y H2B forman un dmero
H1

Dos H3 y dos H4 forman un tetrmero

H2A

H2B

Dos dmeros H2A-H2B y un tetrmero H3-H4

forman un octmero con forma de disco
aplanado
hlice

variable

H3
Histone Fold

H2A/H2B Dimer handshake

H4

33

conservado

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El nucleosoma

Las colas de las

histonas del core

Sobre el octmero se enrrolla el ADN

Cada octmero organiza 145 pb en 1 vuelta
48 nm ADN en un disco de 6x11nm
Sitios distantes en el ADN se aproximan (accesibilidad)
Otros sitios quedan cubiertos (en la cara interna)

Cargadas positivamente
Pasan entre las vueltas de ADN
Contactan con el ADN adayente y
del octmero prximo

35

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El solenoide

La histona H1

No forma parte del

octmero
Organiza el ADN a la
entrada y salida del
octmero

Hlice nucleosomal
6 nucleosomas por vuelta

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Correlacin estructura funcin

Protenas no histonas en la cromatina

La modificacin de histonas es VITAL en la expresin gnica

La acetilacin y desacetilacin de histonas es cclica

Eliminacin de histonas
(Tratamiento con detergentes leves o altas
concentraciones salinas)

Colas cargadas +
Se unen al ADN de
nucleosomes adyacentes
Alto nivel de histona H1

Matriz nuclear proteica y bucles de ADN

unidos a la matriz

Colas acetiladas
NO se unen al ADN
Bajo nivel
de histona H1

Matriz nuclear
+ 2M NaCl

NO es posible la transcripcin

Fibra de 30 nm

39

DNA loops

Existe transcripcin gnica

histonas

Cuentas 10 nm

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El andamiaje (scaffold)

Bucles de cromatina

Igual tratamiento en cromosomas metafsicos revela un esqueleto proteico del

cromosoma (scaffold) del que salen bucles de ADN de 30 a 100 Kb

Existen regiones de ADN que se unen al

scaffold
SARs (scaffold attachment regions)
MARs (matrix attachment regions)
SARs=MARs

La matriz nuclear proteica es el scaffold durante la interfase

Loops of 30 90 kb

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42

Bucles como dominios de cromatina

Visualizacin in vivo de niveles superiores de

compactacin: cromosomas plumulados

Cada bucle fijado al scaffold puede presentar una estructura diferente, mas o
menos condensada.

A. Lampbrush chromosomes.

Cromosomas meiticos apareados parcialmente condensados y

pausados durante la profase meitica para sintetizar ARNs y proteinas a
ser almacenadas para el desarrollo temprano del huevo.

Pueden ser dominios funcionalmente independientes

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El cromosoma metafsico

Dominios condensados

Forma de mxima compactacin de la cromatina

Los bucles de ADN fijados al scaffold se pliegan formando una superhlice

Unidad estructural segregacional de la

informacin hereditaria

1m

Constriccin secundaria
Regin organizadora
nucleolar
Con genes ribosomales

Cromosoma mittico

10 m

radial loop
chrosomosom e model

Centromero
Constriccin primaria
Sitio de unin de protenas
que forman cinetocoro
Brazos
Porciones del cromosoma
entre el centrmero y el
telmero

cromtide

cromtide
45

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El cromosoma

Citogentica: tcnicas de estudio de los cromosomas

Unidad funcional de la informacin hereditaria

La CITOGENETICA analiza la cantidad y
morfologa de los cromosomas
Los cromosomas se pueden describir en
base a la posicin del centromero

Telmeros
Regiones terminales de los cromosomas
Secuencias repetidas particulares
Mecanismo de duplicacin particular
Funcin = Integridad cromosmica

Bandeo cromosmico
Tratamiento desnaturalizante o
enzimtico del cromosoma y posterior
tincin
Cada cromosoma revela un patrn
especfico de bandas claras y oscuras,

Orgenes de replicacin
ARS (secuencias de replicacin autnomas)
Varios por cromosoma
Funcin = replicacin
Centrmero
Constriccin primaria
Rico en secuencias repetidas
Sitio de unin de protenas que forman
cinetocoro
Funcin = segregacin

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Tcnicas de localizacin cromosmicas

Tcnicas de bandeo cromosmico

FISH

Revelan diferencias estructurales en la cromatina que constituye cada banda

Hibridacin in situ sobre cromosomas con

sondas fluorescentes

Tratamiento desnaturalizante o enzimtico y tincin

Bandas oscuras y claras (1-10 Mb)
Bandeo G
tratamiento con tripsina
Bandas claras
zonas activas
replicacin temprana
Bandas oscuras zonas inactivas
replicacin tarda
Bandeo R
patrn opuesto a Bandeo G
Bandeo C
heterocromatina constitutiva
pericentromrica

Cariotipo Espectral
Multiple FISH con sondas especficas de
cada cromosoma marcadas con un
fluorocromo diferente

49

50

Correlacin
estructura
funcin

Niveles de
compactacin
mecanismos de segregacin
en duplicacin

Dominios topolgicos independientes

( Regulacin independiente)
Compactacin

Compactacin debida al scaffold / matriz nuclear

Represor transcripcional

Compactacin debida a histonas

Tamao compacto

51

DNA

longitud

2 x 23 = 46 cromosomas

92 molculas ADN

10 m esfera

12,000 Mbp

4 m DNA

400,000 x

Cromosma mittico

2 cromtides, 1 m espesor

2 molculas ADN

10 m forma X

2x 130 Mbp

2x 43 mm DNA

10,000 x

Dominio de ADN

Bucle de AND anclado

1 replicn ?

60 nm x 0.5 m

60 kbp

20 m DNA

35 x

Fibra de cromatina

approx. 6 nucleosomas por vuelta of 11 nm

30 nm dimetro

1200 bp

400 nm DNA

35 x

nucleosoma

disco 1 vueltas de ADN (146 bp) + ADN linker

6 x 11 nm

200 bp

66 nm DNA

6 - 11 x

1 bp

0.33 nm DNA

1x

Par de bases

0.33 x 1.1 nm

Problemas

compactado

Ncleo (humano)

neutralizacin de cargas del ADN

52

Que sucede durante la

duplicacin y la
transcripcin?