Aportaciones del laboratorio en el

diagnstico y el tratamiento del

paciente intoxicado.

Dpto. Toxicologa y Legislacin Sanitaria, Fac. Medicina

Universidad Complutense de Madrid

Dra. Ana Mara Lpez Parra

Esquema

Introduccin.

Muestras.

Envasado, conservacin y almacenamiento.

Anlisis qumico-toxicolgico.

Mtodos de extraccin.

Deteccin e identificacin del txico:

tcnicas espectrofotomtricas
tcnicas cromatogrficas
tcnicas inmunoqumicas

Introduccin
La investigacin toxicolgica es
el conjunto de procesos
analticos que tienen por objeto
el aislamiento, identificacin y
determinacin cuantitativa de
los txicos, tanto en el vivo
como en el cadver, con el fin
de permitir el diagnstico de la
intoxicacin.

Muestras

Contenido gstrico
Sangre
Orina
Pelo
Saliva
Meconio

Muestras
Contenido gstrico
-Vmito, aspirado gstrico y lavados estomacales.
-En el caso de los lavados estomacales, primer
lavado.
-Un volumen de aproximadamente 20 ml.
-Puede ser necesario procedimientos de
homogenizacin, filtracin y/o centrifugacin.
-No representa grado de intoxicacin.

Muestras
Sangre
-Es una de las muestras ms tiles para la identificacin y
especialmente para el anlisis cuantitativo.
-La sangre total y el plasma son las muestras ms
representativas.
-Recoger la muestra en tubos con heparina o EDTA como
anticoagulante.
-Si se sospecha de intoxicacin con etanol, utilizar fluoruro
sdico como conservante. Y la extraccin deber
efectuarse desinfectando la zona con cloruro mercrico.

Muestras
Orina
-Ensayos preliminares en el screening de txicos.
-Para drogas de abuso.
-La concentracin de un txico puede llegar a ser
100 veces mayor que en la sangre.
-Se debe de tomar antes del tratamiento.
-Como mnimo 50 ml.

Muestras
Pelo
-Txicos minerales
-Deteccin de drogas de abuso.
-Refleja el estado promedio de los elementos
minerales del organismo durante su crecimiento.

Muestras
Saliva.
-Correlacin de los anlisis
sricos con drogas de abuso y
psicofrmacos.
Drager DrugCheck Kit
Meconio.
-Meconio: lquido amnitico, moco, lanugo, bilis y
clulas que se han desprendido de la piel y del tracto
intestinal.
-Identificacin de drogas durante la gestacin.

Muestras
Hgado

-Niveles de txicos superiores

a los de la sangre.
-Especialmente til cuando no
se puede disponer de sangre.
-Evitar contaminacin por bilis.
-Evitar aadir conservantes.

Envasado y conservacin
Tapones PTFE
(polytetrafluoroethylene)
Conservantes:
Azida sdica (0,1%, p/v)
Fluoruro sdico (1%, p/v)
Anticoagulante:
- Heparina
- EDTA
- Oxalato potsico (0,5%, p/v).

Almacenamiento
Factores que intervienen:
Luz

Temperatura

Hidrlisis

Oxidacin

Descomposicin
biolgica

Anlisis
qumico-toxicolgico
1. Separacin o extraccin del txico de la
muestra.
2. Deteccin e identificacin del txico.
3. Cuantificacin.

Mtodos de extraccin
Finalidad:
Aislamiento y purificacin del txico
Concentracin del txico en el extracto obtenido
Parte de la muestra se reserva ntegra

Desde el punto de vista analtico los txicos se

dividen en:

Txicos voltiles
Txicos gaseosos
Txicos orgnicos fijos o extrables
Txicos inorgnicos o minerales

Mtodos de extraccin de
txicos voltiles

Aquellos que se volatilizan por debajo de los

100C, por lo cual son arrastrados por el vapor
de agua cuando sta destila (alcohol etlico,
alcohol metlico, benceno, fenoles, ...).

Mtodos de extraccin de
txicos voltiles
Las tcnicas son:
-Destilacin simple.
-Destilacin fraccionada.
-Destilacin directa al vaco.
-Destilacin por arrastre en corriente de vapor.
-Microdifusin.
-Tcnica de espacio de cabeza ("head space" ).

Destilacin simple

Muestra
problema

Txico
voltil
extrado

Destilacin fraccionada

Separacin segn puntos

de ebullicin

Microdifusin
Anlisis

Muestra

Acetaldehdo

3 ml de sangre
5 ml de tejido
3 ml de sangre
5 ml de tejido
1 ml de sangre

Acetona
Monxido de
carbono
Cianuro
Etanol

Formaldehdo
Hidrocarburos
halogenados
Isopropanol

Camara
de
Conway

Metanol
Fenoles
Sulfuro

2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
0,8 ml de sangre
4 ml de tejido
3 ml de sangre
5 ml de tejido
1-4 ml de sangre
1-4 ml de tejido
2 ml de sangre
5 ml de tejido
2 ml de sangre
5 ml de tejido
2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
2-4 ml de sangre
5 ml de tejido

Agente
liberador
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
1 ml de SO4H2 al
10%
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
1 ml de CO3K2 al
10%
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
1 ml de CO3K2
1 ml de CO3K2
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%

Compartimento
interior
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
2 ml de cloruro
de paladio
3,3 ml de NaOH
0,1N
2 ml de
dicromato
potsico
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
1 ml de tolueno
3,3 ml de SO4H2
al 10%
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
3,3 ml de NaOH
0,1N
3,3 ml de NaOH
0,1N

Tiempo de
difusin
3 horas
3 horas
1 hora
3 horas
3 horas

3 horas
3 horas
3 horas
3 horas
3 horas
3 horas

Tcnica de espacio de cabeza

1.

2.
3.

La muestra se deposita en un vial

cerrado con tapn perforable, en el
que se deja una cmara de aire.
Se calienta a 60C durante 30 min.
Se extrae con una jeringa para
gases una muestra de la parte
superior del frasco para inyectarla en
un cromatgrafo de gases.

Mtodos de extraccin de
txicos gaseosos
Se denominan txicos gaseosos a todas
aquellas sustancias que a temperatura ambiente
se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo:
CO, HCN, SH2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br2.

Mtodos de extraccin de
txicos gaseosos
Las tcnicas son:
-La extraccin de gases en sangre se basa en leyes
fsicas, segn las cuales su solubilidad disminuye
elevando la temperatura o disminuyendo la presin.
-Mediante las mismas tcnicas que para los txicos
voltiles.
-Cromatografa de gases

Tcnicas cromatogrficas
Volatilizacin

Cromatografa
de gases (GC)

Tcnica de separacin.
Se basa en la diferente velocidad con que se
mueven los solutos a travs de un medio poroso
arrastrados por un disolvente en movimiento.

Cromatografa de gases

*Line Base
*Pico Cromatogrfico
*Base del Pico
*rea del Pico

*Altura del Pico

*Anchura del Pico
*Anchura del Pico a la mitad de la altura

Cromatografa de gases
Ventajas e inconvenientes
Costoso.
Personal especializado.
Tcnica muy sensible, fiable y rentable para
determinaciones cualitativas (casi la totalidad de
los txicos) y cuantitativas (lmite de sensibilidad
1-5 g/ml.) .
Posibilidad de derivacin (obtener un
compuesto intermedio a partir de una sustancia
no voltil) hace su aplicacin prcticamente
universal.

Mtodos de microextraccin
en fase slida

Mtodos de extraccin de
txicos orgnicos fijos
Sustancias orgnicas y no voltiles.
Se incluyen:
*Txicos de origen vegetal (glucsidos,
aceites esenciales, alcaloides, etc)
*Productos de sntesis (medicamentos).

Mtodos de extraccin de
txicos orgnicos fijos
Las tcnicas son:
-Con disolvente polar (etanol): tcnica de Stas-Otto.
- Con disolventes apolar: los ms frecuentes son: ter etlico,
cloroformo y diclorometano. Puede ser:
*Directa: slo aplicable a muestras biolgicas limpias
como la orina
*Previa purificacin de la muestra (eliminacin de
protenas).
Fraccionamiento del extracto antes de su anlisis:
Debido a la gran variedad de txicos orgnicos conocidos es
necesario un fraccionamiento del extracto.

Mtodos de extraccin de
txicos orgnicos fijos
Clasificacin de txicos orgnicos en:
1. cidos: dbiles (por ejemplo barbitricos) o fuertes (por
ejemplo salicilatos), unos y otros extrables con disolventes
orgnicos en medio cido.
2. Bsicos: extrables con disolventes orgnicos en medio bsico
(alcaloides, antidepresivos tricclicos, etc.)
3. Neutros: extrables con disolventes orgnicos en medio cido
o bsico.

Mtodos de extraccin de
txicos orgnicos fijos
Las tcnicas son:
-Mtodo de electrodilisis: se basa en la propiedad que
tiene la corriente elctrica de descomponer las sales de
los txicos orgnicos, yendo la base hacia el polo
negativo y el resto al polo positivo.
-Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgnicas
son absorbidas por la resina y luego son eluidos con
solventes apropiados.

Mtodos de extraccin de
txicos orgnicos fijos

Extraccin en fase slida

Mtodos de extraccin de
txicos minerales o
inorgnicos
Estos txicos se encuentran en el organismo
firmemente unidos a albmina, lpidos o glcidos,
siendo requisito la destruccin de la materia
orgnica para poder realizar su anlisis.

Mtodos de extraccin de txicos

minerales o inorgnicos
1. Mineralizacin: proceso por el cual se produce la destruccin
de la materia orgnica y la consiguiente liberacin del txico.
a) Destruccin oxidativa por va hmeda de la materia orgnica empleando
cido ntrico o mezclas de c. ntrico-agua oxigenada, etc.
b) Destruccin de materia orgnica por va seca (calcinacin).
c) Formacin de complejos y posteriormente se separa con disolventes
orgnicos.

Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos

mtodos, para obtener una muestra ms apropiada.

Mtodos de extraccin de txicos

minerales o inorgnicos
Existen mtodos que no precisan la destruccin de la
materia orgnica como:
*Dilisis.
*Ultrafiltracin.
*Electrodilisis.
*Desproteinizacin.
2. Marcha posterior de extraccin

Deteccin e identificacin
del txico
Dos etapas:
1. Rastreo o deteccin rpida:
-Tcnicas de inmunoensayo
-Cromatografa en capa fina
2. Tcnicas de confirmacin:
-Tcnicas espectrofotomtricas.
-Tcnicas cromatogrficas.

Tcnicas inmunoensayo
Fundamento:
Reacciones antgeno-anticuerpo.
Se aplica especialmente para drogas de abuso y
psicofrmacos.

Txico libre

+ AC

Txico libre-AC

Txico marcado
Txico marcado

Tcnicas inmunoensayo
1. Radioinmunoensayo (RIA): istopo radioactivo.
2. Enzimoinmunoensayo: enzima.
-ELISA: ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzimas
-EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas
3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluorforo.
4. Inmunoanlisis por interaccin cintica de partculas
(KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar
agregados de micropartculas.

Tcnicas inmunoensayo

Su aplicacin es cualitativa y cuantitativa (con patrones de

concentracin).
Tcnicas rpidas, y sensibles.
Posibilidad de reacciones cruzadas.

Tcnicas cromatogrficas
Cromatografa en capa fina (CCF)

Fase movil
Cloroformo/acetona
80:20
Isopropanol/cloroformo
Cloroformo/acetona
90:10

Fase estacionaria
Silica gel G activada a 120C/30 min
Desarrollo: 30 min/10 cm
Silica gel G activada a 120C/30 min
Desarrollo: 30 min/10 cm
Silica gel G activada a 120C/30 min
Desarrollo: 30-45 min

Aplicaciones
Todos los tipos
Barbitricos
Anticonvulsionantes
Sedantes no
babitricos

Deteccin e identificacin
del txico
2. Tcnicas de confirmacin:
-Tcnicas espectrofotomtricas.
-Tcnicas cromatogrficas.

Tcnicas espectrofotomtricas
Fundamento: capacidad que tienen las molculas y los
tomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda
utilizando la energa de dichas radiaciones para producir cambios
energticos en su estructura (en los tomos transiciones
electrnicas y en las molculas movimientos electrnicos)

Tcnicas
Espectrofotometra UV visible
Espectrofluorimetra
Espectrofotometra infrarroja
Espectrofotometra de absorcin atmica
Espectrometra de masas

Aplicaciones
Compuestos
Orgnicos
Orgnicos
Orgnicos
Metales
Orgnicos

Anlisis
Cuali/cuantitativo
Cuali/cuantitativo
Cualitativo
Cuali/cuantitativo
Cualitativo

Espectrofotometra de absorcin
atmica (EAA)

E*
Luz
incidente

Fluorescencia
emitida

Espectrofotometra de
absorcin atmica

Lmpara de
ctodo hueco

Sistema
atomizador

Sistema
monocromador

Sistema
detector

La emisin de una energa electromagntica de longitud de onda determinada,

se hace incidir sobre un tomo libre en estado fundamental, este tomo
absorbe la energa y con lo que pasa a un estado excitado.

Espectrofotometra de absorcin
atmica
Ventajas e inconvenientes
Costoso.
En la interpretacin de resultados considerar:
contaminacin en la toma y mantenimiento de
las muestras, etc.
Personal especializado.
Tcnica muy sensible, fiable y rentable. Su
sensibilidad permite identificar y cuantificar
metales en niveles de traza.

Espectrofotometra de emsin
atmica (EEA)

E*

Luz emitida

Volatilizacin
Ionizacin

2.Aceleracin
iones

Espectrofotometra
de masas (EM)

3. Separacin

4. Deteccin

Tcnica cualitativa y cuantitativa.

Separa partculas moleculares o atmicas segn su masa.

Espectrofotometra de masas

Tcnica cualitativa y cuantitativa.

Anlisis de fragmentos moleculares. Determinacin de la estructura
molecular.
Su principal aplicacin es la identificacin de sustancias desconocidas

Espectrofotometra de masas
Ventajas e inconvenientes
Costoso.
Personal especializado.
Acoplamiento a GC (o HPLC): mtodo
ms efectivo para la identificacin de
txicos y sus metabolitos.
ICP-MASAS

ICP-Masas

ICP: Plasma de
acoplamiento inducido

Tcnicas cromatogrficas
Cromatografa de lquidos
Cromatografa de gases

Tcnicas cromatogrficas
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)

Cromatografa lquida de alta

resolucin (HPLC)
Ventajas e inconvenientes
Costoso.
Personal especializado.
No destruye la muestra, lo que permite la deteccin por
distintos sistemas en serie.
Requiere mnima preparacin y pequeas cantidades.
Mayor precisin que GC. En general se aplica a
compuestos de alto peso molecular y polar mientras que
GLC se aplica a gases permanentes y sustancias
voltiles.
Mejor resolucin y menor tiempo de anlisis.

Gracias por su atencin