ARTCULO ORIGINAL

JBMR
Clula de razDerivado Endochondral el cartlago Estimula Curacin de Hueso
por Transformacin de Tejido
Chelsea S Bahney,1,2 Diane P Hu,1 Aaron J Taylor,1 Federico Ferro,1 Hayley M
Britz,3 Benedikt Hallgrimsson,4 Brian Johnstone,4 Theodore Miclau,1 y Ralph S
Marcucio1
1Universidad de California, San Francisco (UCSF) y San Francisco Hospital
General (SFGH), Orthopaedic Instituto de Trauma, San Francisco, CA, EE.UU.
2Departamento de Bioengineering y Ciencia Material, Universidad de California,
Berkeley, CA, EE.UU.
3Departamento de Biologa de Clula y Anatoma, Universidad de Calgary,
McCaig Hueso e Instituto de Junta, Calgary, Canad
4Departamento de Ortopedias y Rehabilitacin, Universidad de Ciencia & de
Salud de Oregn, Portland, O, EE.UU.

Introduccin
Aqu es
un signicant unmet necesidad clnica para desarrollar mejor
estrategias para promover vascularized regeneracin de hueso. La Carga
Global de Enfermedad 2010 informe recientemente publicado en La Lanceta
determin enfermedades musculoesquelticas para ser la segunda causa ms
grande de incapacidad en todo el mundo,(1) y en
los Estados Unidos la
cargade coste de cuidado de salud asociada con el trauma ha superado que
de enfermedad cardiovascular.(2) Hueso grafting es un interventional la tcnica
utiliz para restaurar integridad estructural y promover reparacin de hueso en
un conjunto diverso
de condiciones musculoesquelticas. Indicaciones
comunes para hueso grafting incluye los daos traumticos sostuvieron en
accidentes de vehculo del motor y
Guerra, fractura nouniones, fusiones espinales, osteotomies de tumor
resection, arthrodesis, y alrededor sustituciones de junta. El hueso es el
segundo ms tejido trasplantado generalmente (detrs sangre) con un
estimado 1.6 millones grafting los procedimientos actuaron anualmente.(3) El
patrn oro grafting trasplante de restos de la tcnica de morsalized autologous
hueso. Aun as, autologous grafting est asociado con un nmero de clnico
shortcomings, incluyendo disponibilidad limitada de tejido de donante, sitio de
donante morbidity, y potencial aumentado para cirugas adicionales.
Allografted Hueso, hueso graft sustitutos, e ingeniera de tejido del hueso
representa tcnicas para dirigir limitaciones inherentes de autografts. A pesar
de progreso reciente en estos
Tecnologas, pobres graft integracin y osteonecrosis queda
Recibido en abril de forma original 2, 2013; octubre de forma revisada 25,
2013; noviembre aceptado 12, 2013. Manuscrito aceptado noviembre on-line
21, 2013. Correspondencia de direccin a: Chelsea S Bahney, PhD,
Departamento
de Orthopaedic Ciruga, Universidad
de California, San
Francisco (UCSF) y San Francisco Hospital General (SFGH), Orthopaedic

Instituto de Trauma, 2550 23. Calle, Edificio 9, 3. Piso, San Francisco, CA

94110, EE.UU.. ECorreo: bahneyc@orthosurg.ucsf.edu la informacin De apoyo
Adicional puede ser encontrada en la versin on-line de este artculo.
Revista de Hueso y Bsqueda Mineral, Vol. 29, Nm. 5, mayo 2014, pp 1269
1282 DOI: 10.1002/jbmr.2148
2014 Sociedad americana para Hueso y Bsqueda Mineral
Problemtico,(4) y el fracaso clnico asociado con hueso allografts est
estimado para ser entre 16% y 35%. (5)
En este estudio, exploramos la idea de utilizar tejido de cartlago como
mtodo para estimular reparacin de hueso a travs de endochondral
ossicatin. Nosotros speculated que un problema de fondo con hueso actual
grafting las tecnologas es que promueven regeneracin de hueso a travs de
directo osteogenesis. Aun as, formacin de hueso largo y la fractura que se
cura tpicamente proceder va un cartlago intermedio, sugiriendo que un
endochondral terapia de tejido puede ser
un ms clnicamente y
biolgicamente
tratamiento apropiado. El cartlago es fisiolgicamente
adaptado para funcionar bien bajo avascular condiciones, y hypertrophic
chondrocytes dentro de endochondral el cartlago estimula vasculogenesis.
Estas caractersticas biolgicas inherentes de cartlago propound que lo puede
ser una estrategia teraputica mejor para regeneracin de hueso. Nosotros
hypothesized que por promover endochondral ossiel catin que utiliza tejido
de cartlago grafts podramos dirigir el clnicos shortcomings de tecnologas
actuales para producir un bienvascularized el hueso regenera aquello integra
con el tejido anfitrin.
Los detalles moleculares de endochondral ossiel catin est entendido
predominantemente en el contexto de desarrollo de hueso largo.(6) Primero,
mesenchymal las clulas condensan y experimentar chondrogenesis para
formar un modelo cartilaginoso de el hueso futuro. Chondrocytes Dentro de
este anlagen organizar a morfolgicamente y funcionalmente mbitos distintos
que corresponde a su maturation estado (descansando, proliferando,
hypertrophic) y dejar para crecimiento longitudinal. Hypertrophic chondrocytes
Est credo
Para ser el terminal maturation estado del chondrocyte. A maturation,
chondrocytes experimentar apoptosis, la matriz de cartlago est degradada y
reemplazado por la cavidad de meollo, y formas de hueso en el pericondrio
adyacente para formar el diaphysis de los huesos largos.(7) Hypertrophic
chondrocytes es distin- guished por su forma de ronda ampliada y expresin
de tipo X colgeno, matricial metalloproteinase13 (MMP13), y vascular
endothelial factor de crecimiento (VEGF). Estas protenas son esenciales en
recruiting osteoblast precursores del tejido circundante,
Promoviendo vascularization, y mineralizing de el extracellular
El donante y el tejido anfitrin revelaron que el hueso regenera es cartlago/de
donante deriv, sugiriendo que chondrocytes directamente puede transformar
a osteoblasts. Este mecanismo de reparacin signicantly contrasta
endochondral ossicatin durante desarrollo de hueso largo, requiriendo que
nosotros reevaluate el mecha- nisms de endochondral reparacin para mejorar
estrategias de regeneracin del hueso.

Materiales y Mtodos
Fracturas
Todo los estudios animales estuvieron aprobados por el UCSF IACUC. Adulto,
ratones machos (10 a 14
semanas viejas) estuvo anestesiado, y un
estandarizado, cerr nola fractura estable estuvo hecha enel mid diaphysis de
la tibia que utiliza un aparatoconstruido hecho dise para entregar un
reproducible trespunto que dobla fractura por controlar el peso (460 g) y
distancia (14 cm) de la fuerza. Las fracturas no fueron estabilizadas para
promover endochondral reparacin, y los animales estuvieron proporcionados
con analgsicos cuando necesit.
Tejido grafts al modelo de defecto de la tibia
Un 2mm segmental el defecto estuvo creado por un osteotomy en el mid
tibial diaphysis de immunocompromised ratones (Ratones Desnudos, Nu/J
#2019; El Jackson Laboratorios, Sacramento, CA, EE.UU.) (Higo. 1C). Uno de
cuatro tejido diferente grafts estuvo trasplantado a
el defecto: cartlago
grafts, viviendo cortical hueso grafts (isograft), devitalized cortical hueso
grafts (allografts), o clula de razpelotitas de cartlago derivado (ve abajo).
Como control, el crticosized el defecto qued vaco. Cartlago grafts estuvo
aislado de la porcin central de un da 7 callo de fractura (Higo. 1B) ex vivo
por utilizar un microscopio para diseccionar fuera del cartlago y sacar todo
noncartilaginous tejidos de partidario y el pericondrio. Isografts Estuvo creado
por sencillamente reemplazando el osteotomized hueso al defecto, y allografts
estuvo creado por lavar osteotomized hueso en 70% EtOH y congelando en
80C cuando
(911)
Matricial. Reparacin de nonstabilized las fracturas tambin ocurre a travs de
un.
Anteriormente describi.
Una 8.0 sutura soli asegura el
El cartlago intermedio,(8) en un proceso que es presumed para seguir
endochondral ossicatin durante skeletogenesis. En un murine fractura de
tibia, un avascular callo de cartlago (~da 5) precede invasin vascular,
mineralizacin, y remodelacin a hueso.
graft En sitio por cerrar el msculo. Las tibias eran externally
Estabilizado con un personalizado circular xator constando de dos 2cm los
anillos circulares aguantaron concentrically por tres varillas roscadas (Higo.
1C). Este dispositivo proporciona rgido xation cuando describi
(12,13)
(~Das 1028).

Anteriormente.
Los animales sobrevivieron para 1 a 6 semanas, con un
A pesar de muchas semejanzas entre endochondral ossicatin durante
desarrollo y reparacin, la aplicacin teraputica de tejido de cartlago para
promover regeneracin de hueso no ha sido establecida experimentalmente. El
objetivo global de este estudio era para utilizar un translational murine
modelo de segmental defectos de hueso para validar cartlago grafts como
estrategia de tratamiento potencial para reparacin de hueso. Ms all, por
estudiar los detalles moleculares durante curarse, apuntamos para entender
cmo el cartlago graft (tejido de donante) y el tejido anfitrin contribuye al
proceso de reparacin. Una valoracin cuidadosa de cmo cartlago grafts
facilita regeneracin de hueso es una fundacin necesaria para construir una
estrategia clnica eficaz para promover endochondral reparacin. Diseo de
scaffold material, fuente/de tejido de la clula, y bioactive reactivos todo
depende de el destino de el chondrocytes, fuente de osteoblasts, y funcin
de el vasculature durante el proceso de reparacin.
El dato presentado en este estudio demuestra que cartlago grafts producir un
bienvascularized y el hueso integrado regenera en murine segmental defectos
tibiales, implicando que el cartlago puede ser un efector teraputico mejor
para modular regeneracin de hueso que hueso l. Ms all, etiquetado
gentico de
El mnimo de 5 animales analiz histologically en cada vez.
El punto y 8
animales analizaron en 4 semanas por microtomografa
computada (mCT) y biomechanical testaje.
mCT Y biomechanical testaje
Un Scanco Mdico AG (Bruttisellen, Suiza) mCT soli escner tanto el grafting
rea y callo de fractura. Las muestras eran rotated a travs de 360 y los X
encuadres de rayo estuvieron estandarizados a 70 kV y 114 mUn, con un
tiempo de exposicin de 0.14
segundos por enmarcar para ceder una
resolucin nominal de 10.5 mm. Un 0.5mmaluminio grueso lter estuvo
empleado para minimizar artefactosde endurecimiento de la viga. Tiempo de
escner para cada muestra era aproximadamente 50 minutos. Hueso la
densidad mineral estuvo analizada de 200 trozos dentro del sitio de integracin
o callo de fractura, utilizando un guin hecho hecho. Briey, hueso densidad
mineral (BMD) estuvo medido por normalizar contenido mineral de el Xrayo
attenuation por volumen de hueso. La integracin estuvo puntuada (0
ninguna integracin;
1 integracin) bas en m CT imgenes para indicar
incidencia de integracin. Despus de escanear,
las tibias estuvieron
sometidas a tres punto que dobla utilizando un ElectroForce 3200 mquina de
testaje (Bose

Higo. 1. Cartlago grafts de callo de fractura. (Un) Ximagen de rayo de

unstabilized middiaphysial fractura de tibia (flecha) cre por trespunto que
dobla.
(B) SafraninO staining De callo de fractura 7 das despus de que dao.
Grafts Estuvo aislado ex vivo; la regin boxeada representa el rea aproximada
de donde grafts estuvo cosechado. (C) Grafts estuvo trasplantado a 2 mm
segmental deserta creado en el mid diaphysis de externally estabiliz murine
tibia. (D) SafraninO staining de
el cartlago graft (superior), seguido por
CAVARsonda in situ hibridacin para sox9, col2, col10, y osteocalcin (oc). (E)
Cuantitativo RTPCR muestra expresin de gen en el cartlago graft (n 6)
pariente a el callo de fractura entero (n 5). El dato representa malo T 95%
condence, con signicance (m) de < p 0.005.
Corp., Eden Prairie, MN, EE.UU.) para medir la fuerza de integracin. Slo grafts
que haba integrado ambos proximally y distally estuvo probado mechanically.
Las tibias estuvieron colocadas en su superficie lateral en los soportes ms
bajos del doblando jig con los soportes localizaron bajo la tibiabula cruce y la
cresta tibial. Un preload de 1 N estuvo aplicado de arriba en el midpoint entre
los dos soportes ms bajos para estabilizar el hueso. La carga aplic al hueso
estuvo medido por un 450N clula de carga en un ndice de cubicaje de 2
mm/min. Una curvade cubicaje de la carga estuvo generada para cada hueso
y utilizado para determinar carga definitiva. Las diferencias estadsticas para
xito de integracin estuvo probada utilizando un pairwise comparacin entre
cartlago, isograft, y allograft utilizando el Fisher prueba exacta. BMD Y dato de
fracaso definitivo estuvo comparado utilizando un ANOVA sigui por Tukey
honestamente signicant diferencia (HSD) pairwise comparacin. Cualquier p
valores
< 0.05 estuvo considerado signicant.
Tejido de hueso embedding e histologa
Tibias de euthanized ratones o en vitro cartlago grafts estuvo recogido y xed
en recientemente hizo 4% paraformaldehyde (PFA, pH 7.2 a 7.4) para 24 horas
en 4C. Las tibias eran decalcied en
19% EDTA (pH 7.4) para 14 das en 4C y entonces procesados para parafn o
histologa congelada. Histologa staining para visualizar hueso y tejidos de
cartlago estuvo completado: Modied Milligan Trichrome (el hueso azul),
SafraninO/verde rpido (rojo de cartlago), o Sala y Brunt mancha de
Cudruplo (HBQ, rojo de hueso, el cartlago azul).
Immunohistochemistry Encima tejido de hueso
Xgal staining soli detecta bgalactosidase secciones congeladas encima que
era correoxed en 0.2% glutaraldehyde para 15 minutos, y entonces
expuestos a X gal staining solucin por la noche en 37C.
Immunohistochemistry (IHC) Para eGFP (Un10259, Invitrogen, Carlsbad, CA,
EE.UU.) estuvo actuado por tratar secciones con 0.3% Tritn X (15 minutos),
0.05% trypsin (20 minutos, 37C), 10 mM sodio citrate buffer (30 minutos,
100C), 3% H2O2 en metanol (30 minutos), y bloqueando con 5% suero
bovino albmina (BSA, 1 a 2 horas). El anticuerpo primario estuvo aplicado en
un 1:100 dilucin en 1% BSA (por la noche, 4C), las muestras estuvieron
lavadas y entonces reaccion la especie specic anticuerpo secundario

(Biotecnologa de Cruz de la Santa, Santa Cruz, CA, EE.UU.), y detectados por

VectainStain ABC Caja (#PK4000, Laboratorios de Vector, Burlingame, CA,
EE.UU.) sigui por 3, 3'diaminobenzidine (DAB)
Con amonio de nquel sulfate y colbalt cloruro. Anticuerpos a osteocalcin
(#M173, Takara Bio, Otsu, Japn; 1:200) y Oct4Un (#SC5279 Santa Cruz;
1:100) estuvo aplicado a parafn las secciones que utilizan el mismo protocolo
como eGFP con cambios a antigen retrieval: osteocalcin, trypsin slo; Oct4Un,
40 minutos en EDTA (pH 9.0, 1 mM) en 98C.
In situ hibridacin
In situ la hibridacin estuvo actuada en parafn ceraembedded secciones tan
anteriormente describi.(14,15) Subclones de ratn sox9, tipo II colgeno
(col2un1), tipo X colgeno (col10un1), y osteocalcin (oc/bglp) era linearized
para transcripcin de CAVAR labeled antisense riboprobes.
In situ deteccin de muerte de la clula
Deteccin de apoptosis utilizando el Roche In situ Caja de Deteccin de Muerte
de Clula (#116847959, Roche, Mannheim, Alemania) acuerdo- ing a
el
protocolo del fabricante. Las secciones eran deparafnized, tratados con
proteinaseK (20 mg/mL en 10 mM Tris HCl, 15 minutos), entonces
reaccionados con la caja para 1 hora en 37C en la oscuridad. Los controles
positivos estuvieron tratados con DNase yo antes el TUNEL reaccin, mientras
que los controles negativos no fueron reaccionados con vial #1 de la caja.
Los deslizamientos estuvieron montados con VectaShield con Dapi (#H1200,
Vector). Apoptosis Estuvo visualizado utilizando un uorescent el microscopio y
las fotos fusionaron con Safranin O imgenes de deslizamientos adyacentes.
Expansin de humano mesenchymal clulas de raz
Humano mesenchymal clulas de raz (hMSCs) era aislado y expandido de iliac
meollo de hueso de la cresta aspira de consinti donantes tan anteriormente
descritos(16) o adquiridos de Lonza (Allendale, NJ, EE.UU.; #PT2501). hMSCs
Estuvo expandido en monolayer utilizando DMEM supplemented con 10% FBS
y
CO2 y tampoco cosechado para histologa o trasplantado al modelo de
defecto de la tibia (2 a 3 pelotitas por desertar para crear un estanco t).
Aislamiento y cultura de humanos articulares chondrocytes
Humano articular chondrocytes (hACs) estuvo obtenido del discard tejido de
fresco osteochondral allografts (La Fundacin de Restauracin de la Junta:
macho, 12 a 25 aos, 6 donantes). Chondrocytes Estuvo aislado por digerir
tejido de cartlago en 1% pronase (37C, 1 hora), seguido por 1 a 3 horas en un
0.4% collagenase tipo II solucin (LS004176, Worthington Biochemi- cal,
Lakewood, NJ, EE.UU.). Las clulas estuvieron aisladas del tejido digerido que
utiliza
un 70mM lter, gir abajo
para sacar collagenase solucin, y
directamente encapsulated a scaffolds sin expansin.
Poly(ethylene Glicol) diacrylate scaffolds
Primario chondrocytes o expandido hMSC era photoencapsu- lated en un
poly(ethylene glicol) diacrylate (PEGDA)bas semi interpenetrating red con
un scaffold la composicin que consta de 16% (w/v) PEGDA (6.0 kDa) y 32%

(w/v) PEGndimethyl ter (PEG, n 2000, MW 88 kDa) para conseguir un nal

densidad de clula de 25 106 clulas/mL tan anteriormente describi.
(17,18) Hydrogels era cultivado en 37C, 5% CO2 para 6 semanas en dened
chondrogenic medio.
mRNA Aislamiento y cuantitativo RTPCR
Murine mRNA Estuvo aislado de cartlago grafts o el callo de fractura entero
por homogeneizacin en TRIzol. cDNA Era inverso transcrito con Superndice III
(#18080, Invitrogen) y RT PCR estuvo actuado utilizando SYBR Verde. El
primer las secuencias estn incluidas en Mesa 1. Expresin de gen relativo
estuvo calculada por normalizar al housekeeping gen (GAPDH, DCT) y entonces
a expresin de gen del callo de fractura entero (DDCT). Pliegue
DDCT. Graphs Representa malo T 95%
broblast Factor de crecimiento 2 (FGF2, 10 ng/mL); las clulas estuvieron
utilizadas despus de que 3 a 12 poblacin doublings (paso 1 a 4)..
hMSC Cultura de pelotita y en vivo trasplante
hMSCDeriv pelotitas de cartlago estuvieron formadas por poner 200,000
hMSCs a v bottomed platos de suspensin, centrifuging para 5 minutos en
800g y culturing en un chondrogenic el medio que contiene dexamethasone y
TGFb1 cuando anteriormente de- scribed.(16) las pelotitas eran cultivadas
para 3 semanas en 37C con 5%.
El cambio estuvo calculado cuando 2
condence De biolgico replicates para el cartlago grafts (n 6) o el callo de
fractura entero (n 5). mRNA Aislamiento y cDNA sntesis del hydrogels
estuvo actuado tan anteriormente describi.(19) el cambio Relativo en
expresin de gen estuvo calculado por normalizar a
el housekeeping gen
(18S, DCT) y entonces a expresin de gen de recientemente aislado hACs o
undifferentiated hMSCs antes de que encapsulacin (DDCT). Cambio de pliegue
estuvo calculado cuando 2DDCT. Graphs Representa malo T 95% condence
para un total de 6 diferente hAC y hMSC donantes.
Mesa 1. Primer Lista
Syber Verde
Especie
de gen
Adelante
Inversa
Taqman Ensayo ID#
GAPDH
Ratn TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG
CCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT
Sox9 Ratn GCAGACCAGTACCCGCATCT
CTCGTTCAGCAGCCTCCAG

Col2Un
Ratn GGCTCCCAGAACATCACCTA
TCGGCCCTCATCTCTACATC

Col10Un
Ratn AATCTGAAATGCAAGGTGCT
AAGACTCAAATAGTCATTAAAGCAAA

Col1Un
Ratn CCCAGAACATCACCTATCAC
TTGGTCACGTTCAGTTGGTC

Osteocalcin Ratn CGCTCTGTCTCTCTGACCTC

TCACAAGCAGGGTTAAGCTC

18S Humano

ACAN Humano

Col2Un
Humano
Col10Un
Humano
Col1Un
Humano
MMP13
Humano

hs9999999901_s1
hs00153936_m1

hs00264051_m1

hs00166657_m1

hs00164004_m1

hs00233992_m1

MSC Pelotita/hydrogel histologa e immunohistochemistry

Hydrogels Era xed en 10% neutrobuffered formalin, embed- ded en parafn, y
5 mm las secciones cortadas a silane coated deslizamientos. Toluidine Azul
staining soli visualiza sulfated proteo- glycans. IHC Soli detecta colgenos
yo (1:400, Anthony Hollander), II (1:200, IIII6B3, Banco de Hibridoma de
Estudios Del desarrollo, Ciudad de Iowa, IA, EE.UU.), X (1:200, Gary Gibson)
cuando anteriormente describi.(17,19,20) mitocondrias Humanas (1:100,
#MAB1273, Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) la deteccin sigui el mismo
protocolo, pero los deslizamientos estuvieron tratados con 0.05% trypsin (20
minutos en 37C) para antigen retrieval.
Osteoconductive En vitro cartlago explant cultura
El cartlago de el callo de fractura estuvo cosechado de la porcin central del
da 7 fractura cuando describi encima, rinsed con sterile PBS, y entonces
transferido a medio para en vitro cultura en 37C y 5% CO2. Medio de control
era un suero glucosa alta libre DMEM conteniendo 1% penicillinstreptomycin,
1% SU Premix (#354352, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.), 1 mM sodio
pyruvate, y 100 ng/mL ascorbate2fosfato. Para osteogenic culturas, las
muestras estuvieron crecidas bajo control condiciones para 2 semanas,
entonces el medio era supplemented
Con hueso protena morfogentica 2 (BMP2: 10 nm, 100 nm, o 1 mm) y 10
mM bglycerol fosfato (bGP). hMSCDeriv pelotitas de cartlago transfirieron a
osteogenic las condiciones completaron
3 semanas de estndares chondrogenic cultura antes de ser transferido a
osteogenic medios de comunicacin para un adicionales 4 semanas de cultura.
Humano vascular endothelial clulamedios de comunicacin condicionados
(HUVECCM) estuvo recogido de conuent platos de paso 2 a
3 HUVEC las clulas crecidas en Gibco Medio 200 con LVES suplemento
(#Un1460901, Invitrogen). Los medios de comunicacin estuvo recogido cada
3 das ; los lotes estuvieron combinados y lter sterilized.
Histomorphometric Anlisis
rea de mineralizacin o proteoglycan deposicin dentro del cartlago explants
estuvo determinado por staining cada 25. seccin con Alizarin Rojo o Safranin
O. Las imgenes estuvieron capturadas de un Leica (Bfalo Grove, IL, EE.UU.)
DM 5000 B microscopio ligero, y el nmero de pxeles estuvo determinado por
Adobe Photoshop (Adobe Sistemas, San Jose, CA, EE.UU.). El volumen de cada
estuvo calculado utilizando la ecuacin para un cnico frustum:
1 n1 .
.
X
p
La estabilizacin estuvo aplicada a la tibia intacta tan anteriormente descrito,
(12,13) entonces un 2mm osteotomy estuvo creado enel mid diaphysis y

aclarado de hueso debris en preparacin para el graft (Higo. 1C). Cartlago para
el graft estuvo aislado de la porcin central de un da 7 nonstabilized callo
de fractura por cuidadosamente diseccionando el callo de fractura ex vivo
utilizando un microscopio de diseccionar (Higo. 1Un, B). El fenotipo del
cartlago graft estuvo caracterizado utilizando histologa, in situ hibridacin, y
cuantitativo RTPCR (Higo. 1). SafraninO staining Muestra fuerte proteoglycan
deposicin en
el graft y destaca
que la morfologa celular es
predominantemente que de normal chondrocytes con algn hypertrophic
chondrocytes en el medio (Higo. 1D). In situ hibridacin conrms expresin de
sox9 y col2un1 durante el graft y col10una1 expresin en hypertrophic
chondrocytes en la porcin central del graft. Osteocalcin (oc/bglap) No fue
detectado anywhere en el graft. Importantly, en regiones que hubo abajo
niveles de Safranin O staining, observamos clulas expresando sox9 pero no
oc/bglap (Higo. 1D y Supplemental Higos. S1 y S2). Ms all, no detectamos
ninguna evidencia de una poblacin de progenitor que utiliza un anticuerpo a
Oct4Un (Supplemental Higo. S3Un, B). Cuantitativo RTPCR espectculos de
anlisis signicantly ms sox9 y col2un1 y signicantly menos oc/bglap
expresin en el tejido de cartlago graft compar con
el callo de fractura
entero (Higo. 1E).
Una 4curacin de semana curso de tiempo del defecto muestra que cartlago
grafts facilita endochondral reparacin de hueso en la tibia de ratn (Higo. 2).
Ms all, el trabeculated morfologa de
el hueso en da 28 sugiere el
regenerar es altamente vascularized (Higo. 2C). En la medidaemparej
defectos vacos, completos bridging de el hueso nunca fue observado (0/4);
bastante, los defectos eran lled en gran parte con tejido de granulacin
(Supplemental Higo. S4). Los defectos vacos muestran regeneracin de hueso
nuevo predominantemente en el periosteum con cantidades pequeas nicas
de hueso nuevo en el osteotomized regin.
Integracin entre el cartlagoel hueso derivado regenera era evidente
histologically y tomographically (Higo. 2C, D). Cundo la curacin producida
de cartlago grafts estuvo comparado con viviente cortical hueso grafts
(isograft) y devitalized cortical hueso grafts (allografts), el cartlago era tan
probablemente para integrar con el hueso anfitrin como isograft, y ambos
eran lejos superiores a allograft (Higo. 3Un, B;
Un p < 0.005). Fuerza de integracin, medido como fracaso definitivo
Por trespunto que dobla, conrmed calidad de integracin no fue
signicantly Diferente entre cartlago e isograft, mientras que la integracin era
tan pobre con allograft que todo grafts fall inmediatamente sin fuerza medible
(Higo. 3C). Fuerza de integracin entre el anfitrin y graft en 4 semanas no
lograron la fuerza llena de uninjured cortical hueso o la reparacin de un
da 14 nonstabilized fractura que est fortalecido por el callo sobrante
V 3h
i1
Uni Uni1
UniUni1

Tejido (Higo. 3C;b

p < 0.005, c
p < 0.05). Aun as, BMD del
Ai Y Ai 1 es el rea de total explant o mineralized explant extracellular
matriz en secciones secuenciales; h es la distancia entre secciones (250 mm),
y n es el nmero total de secciones analiz por cartlago explant. Los datos
representan el malos T 95% condence de las muestras, y signicance estuvo
probado utilizando el
MannWhitney Uprueba para nonparametric dato, con
p valores < 0.05
determinados para ser signicantly diferentes. Biolgico replicates
(n 36) estuvo utilizado para en vitro quanticationes.
Resultados
Cartlago grafts produce bienvascularized y el hueso integrado regenera
La capacidad de
un cartlago graft para estimular regeneracin de hueso
estuvo probada en un murine modelo de un segmental defecto de hueso.
Externo
isografts Y cartlago grafts no fue statistically diferente de
El cortical controles de hueso, y, importantly, el cartlago graft tuvo un BMD
equivalente a aquello de un da 28 callo de fractura (Higo. 3D; b p < 0.02).
BMD De el allograft era ligeramente ms alto que que de
Los das 14 y 21 callo de fractura, e incluso cortical hueso;
Aumentado BMD est visto en devitalized hueso porque no tiene la capacidad
de remodelar (Higo. 3D; bd p < 0.01).
El hueso regenera es el donantederiv
Basado en el proceso de curacin observ encima en el segmental defecto y
nuestros estudios anteriores de endochondral reparacin de fractura, nosotros
presumed regeneracin de hueso del cartlago grafts ocurri a travs de
endochondral ossicatin en un proceso anlogo a desarrollo de hueso largo
embrionario. Este modelo pronostica el hypertrophic chondrocytes
experimentar apoptosis

Higo. 2. Cartlago grafts producir un integrado y vascularized el hueso

regenera en un segmental defecto de hueso. (UnC) SafraninO o (EG)
Masson Trichrome staining en das (Un, E) 7, (B, F) 14, o ( C, G) 28 despus de
que implantacin de el cartlago graft. (D) mCT imagen de defecto de tibia 4
semanas postsurgically. cb cortical Hueso (anfitrin); graft trasplant
cartlago de callo de la fractura.

Y est reemplazado por osteoblasts de el anfitrin. Probamos este modelo

por trasplantar cartlago de LacZ/ Rosa26 ratones a immunocompromised
anfitriones y sigui el destino del regenerar utilizando Xgal staining para
detectar bgalactasidase actividad (xgal de fondo y staining speciciudad,
Supplemental Higo. S5). En contraste al modelo establecido, encontramos que
la mayora del hueso regenera era donante, ms que anfitrin, derivado (Higo.
4). Magnied Vistas de el graft despus de que 4 semanas de curarse ilustra
zonas de transicin donde all aparece para ser una transicin morfolgica de
las clulas de chondrocytes (Higo. 4D, flecha amarilla) a osteocitos (Higo. 4D,
estrella amarilla) dentro del tejido de donante. Seamless La integracin est
observada entre el graft y tejido anfitrin, con donante y clulas anfitrionas
embedded dentro de una matriz continua (Higo. 4C, F). Anfitrinderivado
chondrocytes es tambin evidente en el tejido en la interfaz entre el graft y
tejido anfitrin (Higo. 4D, tringulo verde), sugiriendo el tejido anfitrin estuvo
estimulado por bioactivity de el graft tejido o por tensiones mecnicas en la
interfaz de tejido.
El origen de donante de el hueso regenera era conrmed utilizando cartlago
grafts obtuvo de eGFP ratones y trasplantados a immunocompromised los
ratones en la misma manera describieron encima (Supplemental Higo. S6).
Immunohistochemistry A GFP demonio- strated que el regenerar el donante
quedado deriv despus 28 das de curarse, era altamente trabeculated, e
integrado con el anfitrin.
Cartlago grafts de humano MSCs tambin promover regeneracin de hueso
por transformacin de tejido
Para validar el uso de cartlago grafts para endochondral reparacin de hueso
en
un ms translationally sistema pertinente,
generamos pelotitas de
cartlago de humanos mesenchymal clulas de raz (hMSCs) e implant estas
pelotitas a
el murine segmental defecto (Higo. 5). Chondrogenesis Estuvo
inducido utilizando culturas de pelotita estndar supplemented con TGFb1 y
dexamethasone. (21) Histological e immunohistochemical anlisis de el hMSC
pelotitas de cartlago derivado en el tiempo de implantacin conrmed

Higo. 3. Integracin de cartlago grafts es equivalente a isograft y superior a

allograft despus de que 4 semanas de curarse. (Un) porcentaje Global que
cartlago, isograft, o allograft integrado con el tejido anfitrin bas encima
dos integracin potencial sitios por graft (7 a 8 animales, 14 a 16
oportunidades de integracin; un statistically diferente de cartlago e
isograft, p < 0.005). (B) Representacin grfica de integracin para cartlago,
isograft, y allograft. (C) fracaso Definitivo de grafts por tres punto que dobla.
Fracaso definitivo de uninjured cortical hueso para ambos el grafts (eGFP) y
ratones anfitriones (immunocompromised/desnudos) est proporcionado como
control positivo al lado fracaso de nonstabilized fracturas para referencia (b
statistically diferente de d14 fx; c diferente de cortical hueso, p < 0.05). (D)

Hueso densidad mineral (BMD) de el callo de fractura, grafts, y cortical hueso

(d statistically diferente de d21 fx, p < 0.02).
El tejido era fuertemente chondrogenic (Higo. 5Un, B) con regiones de la
hipertrofia marcada ambos por morfologa y colgeno X protena (Higo. 5C).
Despus de que 4 semanas en los defectos tibiales, transformacin de las
pelotitas de cartlago a vascularized tejido de hueso estuvo visualizado con
Masson trichrome (Higo. 5D, E). Origen de donante de el hueso era conrmed
con un anticuerpo a mitocondrias humanas (Higo. 5F). En la tibia, la pelotita
retiene su forma redondeada e integra con el nuevo periosteal el hueso
formado en el cortex de el hueso anfitrin.
Cartlago de ingeniera del tejido grafts
Chondrogenic Las pelotitas crecidas por el mtodo utilizado en este estudio es
inherently limitado en medida a aproximadamente 1 mm en dimetro, y
encontramos que a pesar de que las pelotitas integradas con el defecto de
hueso (Higo. 5E), las pelotitas adyacentes mltiples no integran con cada
otro (no mostrados). Consiguientemente, scaling esta metodologa a defectos
de escala ms grande requerir una tecnologa diferente, como el scaffold
bas las tecnologas desarrollaron para ingeniero de tejido- ing. Hemos
anteriormente desarroll un biocompatible tcnica para photoencapsulating
hMSCs a sinttico PEGDAbas
scaffolds Aquello deja para chondrogenesis.(17,19,20) Utilizando este
scaffold Tecnologa, probamos el fenotipo de cartlago que desarrollara de dos
clula de candidato fuentes para tejido engineered cartlago: hMSCs o humano
sano chondrocytes (hACs). Despus de que 6 semanas de en vitro cultura,
sulfated proteoglycans y tipo II colgeno era presente en ambos hMSCs y hACs
construye, indicando su capacidad fundamental de generar tejido de cartlago
(Higo. 6). Aun as, nico hMSCencapsulated construye elabora colgeno yo y X
protenas matriciales y mostrar un aumento robusto en COL10Un1 y MMP 13
expresin de gen.
BMP Y HUVECcondicion el medio estimula mineralizacin en vitro
A mejor entender la funcin de el vasculature en convertir cartlago a hueso
en vivo, tejido de cartlago grafts de el callo de fractura era cultivado en vitro
bajo osteoinductive condiciones. Cartlago de callo de la fractura cultivado en
vitro sin BMP2 mantuvo fuerte proteoglycan staining, y las clulas devenan
hypertrophic sin evidencia de mineralizacin en la matriz (Higo. 7UnC, M).
Cundo cultivado con BMP 2 y b glycerolpho- spate (bGP), el cartlago de callo
de la fractura mineralized, pero las clulas mantuvieron el hypertrophic
chondrocyte morfologa como opposed a devenir a osteocitole gusta (Higo.
7DF, M). Creciente BMP2 concentracin en cultura aument contenido
mineral pero no cambi morfologa de tejido (Supplemental Higo. S7). Los
resultados similares estuvieron obtenidos cundo MSCderiv pelotitas de
cartlago eran cultivadas en vitro con BMP2/bGP (Supplemental Higo. S8).
Dado la transformacin morfolgica incompleta del explanted cartlago a
hueso, nosotros hypothesized que estmulos biolgicos de
el vasculares
endothelial las clulas pueden ser esenciales. Para probar esta hiptesis,
generamos HUVECmedios de comunicacin condicionados para simular el
callo de fractura microenvironment y lo aadi al cartlago de callo de la

fractura cultivado en vitro, cualquiera con o sin la adicin de BMP2/bGP.

HUVECCondicion medi- um slo era sufcient para producir un mineralized
contenido matricial en el explants aquello no fue statistically diferente de
osteogenic medio (Higo. 7Gyo, M). Adicin ms lejana de BMP 2/bGP al
HUVECel medio condicionado produjo un pequeo, pero no statisti- cally
signicant, aumento en la cantidad de mineralizacin en el cartlago explants
(Higo. 7JM). Explants Cultivado con HUVEC los medios de comunicacin
condicionados retuvieron su hypertrophic morfologa, quizs debido a
un
aumento en el proteoglycanmatriz de cartlago rico en el explant (Higo. 7M).

Higo. 4. Donante (azul) versus anfitrin contributin a

el hueso
regenerate. Cartlago grafts estuvo obtenido de La c Z/Rosa26 ratones
de reportero y trasplantados a immunocompromised ratones (SCID Beige)
ratones. Clulas de donante eran labeled utilizando Xgal staining para
detectar bgalactosidase actividad de la Rosa26 ratones en (Un) 7, (BE) 28, o
( FH) 42 das despus de que cartlago engraftment. Caracteres especiales (D)
osteocitos de donante (estrella amarilla), donante chondrocytes (flecha
amarilla), anfitrin chondrocytes (tringulo verde). cb cortical Hueso
(anfitrin); graft trasplant cartlago de callo de la fractura de LacZ /
ratn.

Higo. 5. Humano MSCpelotitas de cartlago derivado trasplantaron a segmental defecto de hueso regenera hueso. (UnC) hMSC pelotitas despus de que 3
semanas de en vitro cultura en chondrogenic condiciones stained con ( Un)
SafraninO, o anticuerpos a ( B) colgeno II y ( C) colgeno X. (D, E) Masson
Trichrome staining de segmental defecto 4 semanas despus de que trasplante
de hMSC pelotitas de cartlago derivado. (F) hMSCdervied Pelotita con
anticuerpo staining para mitocondrias humanas en el trichrome hueso
positivo.

Endochondral Reparacin de fractura

Conversin morfolgica de chondrocytes a los osteocitos no fue
completamente recapitulated en vitro, sugiriendo la sustitucin sencilla de
soluble bioactive las molculas no fue sufcient para apoyar transformacin.
En vivo, la transicin morfolgica de chondrocyte al osteocito es claramente
visto en el callo de fractura en las regiones que rodean el invadiendo
vasculature (Higo. 8UnD). Hypertrophic chondrocytes En esta mancha de
reas de la transicin para ambos el colgeno denso bers de matriz de hueso
(HBQ rojo, Higo. 8UnD) y osteocalcin protena (Higo. 8E, F). Adyacente al
hypertrophic chondrocytes, las clulas aparecieron atter y tener el aspecto de
un osteocito. Para probar si el cambio en morfologa de clula era el resultado
de apoptosis de hypertrophic chondrocyte y sustitucin por clulas de el
vasculature cuando sugeridos por modelos actuales, utilizamos un In situ Caja
de Muerte de la Clula. En el cartlago a regin de transicin del hueso en da
7 (Higo. 8G) y da 10 (Higo. 8H) la mayora del apoptosis ocurri en clulas
que histologically y morphologi- cally identied cuando clulas de hueso,
cuando opposed a hypertrophic chondrocytes. Este dato sugiere que apoptosis
sencillamente puede facilitar remodelacin de el callo duro para crear espacio
de meollo. Nosotros luego mirados para ver si programas de progenitor eran
activados en hypertrophic chondrocytes en cartlago a reas de transicin del
hueso. Interstingly, nosotros nd Oct4Un est expresado slo en el
hypertrophic chondrocytes acercarse el invadiendo vasculature (Higo. 8yo, J y
Supplemental Higo. S3C, D). No vimos evidencia de Oct4Un en chondrocytes
o hypotrophic chondrocytes en reas sin invadir vasculature (Supplemental

Higo. S3E, F) o en osteocitos en hueso formado nuevamente (Supplemental

Higo. S3G, H).
Discusin
La capacidad de regenerar un vascularized el hueso que utiliza tejido grafts es
actualmente apremiado por las limitaciones clnicas de tecnologas actuales. A
pesar de que autograft procedimientos de hueso producen razonablemente
resultados exitosos, sitio de donante morbidity y la cantidad
de tejido
disponible es signicant problemas.(22,23) los fracasos Clnicos asociaron con
allografts ha sido extensamente

Higo. 6. Ingeniera endochondral cartlago para ingeniera de tejido. Humano

MSCs (Un) o sano humano articular chondrocytes (hACs) (B) era
photoencapsulated a PEGDA bas scaffolds y cultivado
en vitro con
chondrogenic medio para 6 semanas. (C) Anticuerpo specila ciudad era
veried utilizando cartlago articular y el osteochondral interfaz. (D) expresin
de Gen de el hMSC (n 6) o hAC (n 6) deriv tejido engineered cartlago
despus de que 6 semanas de en vitro la cultura estuvo comparada con
expresin de gen de cada tejido en da 0. Graph Representa malo T 95%
condence.

Documentado en ambos estudios animales y humanos. El problema principal

es que el tejido queda inerte, produciendo revitalizacin limitada y prdida
eventual en integridad estructural del graft.(5,10,2426) Un esfuerzo
importante ha sido hecho para desarrollar tecnologas noveles para promover
vascularization durante regeneracin de hueso que utiliza terapia de gen o
entrega de factor del crecimiento de VEGF.(11,2730) En este estudio,
investigamos una aproximacin alternativa para estimulante vascularized
regeneracin de hueso que utiliza tejido de cartlago grafts para promover
endochondral reparacin de hueso. Utilizando un translational murine modelo
de segmental defectos de hueso, demostramos que el cartlago trasplantado
produce un altamente trabeculated y bienvascularized el hueso regenera
aquello integra bien con el tejido anfitrin.
El specic ventaja que cartlago grafts ofrece encima trasplante de hueso
probablemente puede asociado con el inherente bioactivity de chondrocytes
y su adaptacin para funcin bajo avascular condiciones. Tan chondrocytes
madurar hacia hypertro- phy, ocultan VEGF para estimular invasin vascular,
MMP13 para promover mineralizacin de el extracellular matriz, y BMPs para
promover osteogenesis.(3134) Capitalizando en este innato biologi- cal la
funcin puede eliminar la necesidad para ingeniera compleja
Estrategias para entregar bioactive estmulos. Ms all, chondrocytes es

metabolically Optimiz para avascular condiciones,(35) proporcionando una

ventaja teraputica para reparacin de hueso porque grafting es a menudo
requerido en reas de dao vascular. Ischemia Es detrimental a osteogenesis y
signicantly aumenta el ndice de fractura no unin(36,37) y contribuye a
hueso actual graft fracasos.(4)
El concepto de utilizar cartlago para promover endochondral regeneracin de
hueso ha sido eficazmente pasada por alto en un nivel clnico a pesar de la
pertinencia biolgica clara de esta aproximacin. En este estudio, generamos
endochondral cartlago por crear unstabilized fracturas en murine tibias y por
inducir hMSCs hacia chondrogenesis. Experimentos anteriores haber
demonstrat- ed la capacidad de cartlago con un hypertrophic fenotipo para
formar hueso ambos en vitro(3841) y despus de que ectopic transplantation.(4145) Curiosamente, hyaline cartlago, el cual no expresa colgenos yo
o X, aparece para ser privilegiado de
esta transicin a hueso, y los
experimentos similares han sido incapaces de inducir estos permanentes
chondrocytes para experimentar endochondral ossica- tion.[(41,43,45,46), y el
dato no mostrado] Consiguientemente, endochondral cartlago, o specically la
capacidad de experimentar hypertrophic maturation, aparece requisite en
regeneracin de hueso de apoyo. Regeneracin de rgano de hueso funcional
por endochondral ossica- tion ha demostrado que tejido de hueso completo
puede ser

Higo. 7. HUVECCondicion el medio es sufcient para producir mineralized

cartlago en vitro. Alizarin Rojo y Safranin O/rpido verde staining del cartlago
estuvo obtenido de el da 7 callo de fractura y cultivado en vitro en el medio
basal que contiene 10 nM dexamethasone y 100 mg/mL Un2P para 2 semanas,
entonces tampoco mantenidos en aquella condicin basal (UnC) o transferido
a osteogenic suplementos (rhBMP2,bGP,Un2P) (DF), HUVECCM (Gyo), o
HUVEC CM con osteogenic suplementos (JL). Alizarin Rojo y Safranin
O/rpido verde staining de cartlago
grafts (M). QuantiCatin de
el
porcentaje de mineralizacin (gris) y proteoglycan
(negro) en cartlago
explants despus de que 4 semanas de en vitro cultura. Graph Representa
malo T 95% condence, con signicance (m) de < p 0.005.
Producido de hMSCcartlago derivado,(47,48) validando el concepto explor
aqu que recapitulating las secuencias del desarrollo pueden ser una estrategia
de ingeniera de tejido til . Nuestro dato expande a estos estudios para
mostrar que endochondral el cartlago puede promover curacin eficaz de un
segmental defecto de hueso en un modelo clnicamente pertinente.
Specically, el hueso regenera producido por el cartlago graft es altamente
vascularized e integra mucho mejor que allograft hueso y as como isograft. El
isograft y allograft
los modelos utilizaron para
este estudio ha sido
anteriormente descrito en murine estudios de defecto de hueso largos,(911)
proporcionados para compatibles graft dimensiones para comparacin a travs
de grafting grupos, y tener pertinencia clnica para el tratamiento de defectos
de hueso humano con segmento grande

grafting.
Una caracterstica clave de nuestro estudio
genticas en el cartlago grafts para seguir la
versus el anfitrin al hueso regenera. Nuestra
graft creara una plantilla para remodelacin de

es que utilizamos etiquetas

contribucin de
el donante
hiptesis era que el cartlago
hueso en un

Moda similar a endochondral ossicatin durante desarrollar- ment. Si

curndose ocurrido por este modelo, el trasplantado chondrocytes
experimentara apoptosis y el hueso sera anfitrin
deriv. En contraste,
encontramos el hueso regenera era en gran parte el donante deriv. Nuestro
dato era veried utilizando dos diferente genticamente labeled tensiones de
ratn, Rosa26 (LacZpositivo) y eGFP, y una mancha de mitocondrias humana
para identificar origen del trasplantado hMSCderiv pelotitas de cartlago. En
lnea con nuestro trasplantar resultados, ambos Scotti y colegas (44) y
Sacchetti y colegas (49) ha encontrado que el ectopic el hueso formado de
subcutaneously trasplant hMSC el cartlago era donante deriv. Aun as,
debido a
la heterogeneidad potencial en el tejido de cartlago grafts,
tampoco nuestro estudio ni la lata de trabajos anterior
conclusively refute El argumento que el grafts contuvo osteocitos
comprometidos, o que una poblacin pequea de donante deriv
osteoprogenitor las clulas podran repopulate el hueso regenera. Para dirigir la
posibilidad que osteoblasts era presente en el cartlago graft, utilizamos qRT
PCR e in situ.

Higo. 8. Cartlago a zona de transicin del hueso en callo de fractura. (UnD)

Sala y Brunt mancha de Cudruplo (HBQ, rojo de hueso, el cartlago azul)
de nonstabilized callo de fractura 10 correo de dasdao. (E, F) Osteocalcin
immunohistochemistry de nonstabilized callo de fractura 10 correo de das
dao. (G, H) In situ deteccin de muerte de la clula (GFP) fusion con
Safranin O (rojo de cartlago, el hueso azul) staining de da 7 (G) o da
10 (H) callo de fractura. (Yo, J) Oct4Un immunohistochemistry de da 10 callo
de fractura. Punto de flechas a Oct4Un positivo hypertrophic chondrocytes. BV
Vaso sanguneo o meollo de hueso espacio.
Hibridacin a conrm sox9 expresin durante el graft y demostr que haba
no evidencia molecular de osteoblasts. Ms all, no vimos ninguna expresin
del marcador de clula de la raz Oct4Un en el cartlago graft antes de que
trasplante, sugiriendo clulas de progenitor no fueron presentes. Oct4Un es un
marcador establecido de pluripotent clulas de raz, a pesar de que su funcin
en poblaciones de clula de raz de adulto no es aclarar. Actualmente, hay no
marcadores buenos para ratn MSCs y la ausencia
de Oct4Un puede no
conclusively demostrar osteoprogenitors no fue presente.
El destino de donante del hueso regenera incitado nos para examinar el callo
de fractura y evaluar si endochondral la reparacin puede diferir de la vista
tradicional de endochondral ossicatin durante desarrollo. En regiones de el
callo de fractura donde transiciones de cartlago a hueso
(zona de

transicin),
hay un obvio phenotypic maturation de chondrocyte
a
hypertrophic chondrocyte a hueso cerca el vasculature.
Encontramos
evidencia limitada de apoptosis en hypertrophic chondrocytes en estas zonas
de transicin. Este resultado se mantiene con otros estudios que muestran que
el hypertrophic chondrocytes no puede ser
Destinado para apoptosis.(5054) Esto no excluye la posibilidad.
Aquellas clulas de el invadiendo vasculature tambin contribuir a formacin
de hueso,(55) sino sugiere que invadiendo las clulas no pueden ser el nicos,
(56) o incluso primarios, el mtodo por qu hueso est formado durante
endochondral reparacin.
Este estudio no es el rst para sugerir aquel cartlago puede devenir hueso,
pero los restos de idea nondogmatic, y es actualmente no aclarar si esto
pasa routinely durante desarrollo y reparacin o slo bajo circunstancias
seguras. Ms all, si el cartlago a transformacin de hueso ocurre , es unclear
qu secuencias genticas o moleculares habilitan este cambio. A pesar de que
algunos informes sugieren aquel cartlago dedifferentiates a un progenitor
como estatal antes de devenir hueso,(51,57) otro dato apoya un mecanismo
donde chondrocytes puede madurar directamente a osteocitos. (50,56,58
63) En nuestro estudio, encontramos que hypertrophic chondrocytes en el
Zona de transicin del callo de fractura aparece para expresar el marcador de
progenitor Oct4Un. El mecanismo por qu Oct4Unos actos no
es
completamente entendi: En
esta situacin, el chondrocytes podra ser
dedifferentiating para recuperar capacidades de progenitor, similares a
inducidos pluripotent clulas y compatibles con el mecanismo descrito por
Cancin y Tuan. (57) Alternativamente, Oct4Un puede funcionar de manera
diferente en adulto somatic clulas y dejar celular reprogramming para
habilitar una transicin directa de cartlago a hueso. Un signicant reto hacia
aprender el mechanistic los detalles de transformacin es el sustanciales
overlap entre marcadores de hypertrophic chondrocytes y osteoblasts.(6467)
Consiguientemente, el apellido que localiza y claramente dening cartlago
versus tejido de hueso es difculto ambos en vitro y en vivo y confa
fuertemente en diferencias en morfologa. El trabajo ms lejano est requerido
para dilucidar la extensin a qu Oct4Un poder reprogram chondro- cytes
durante curacin de fractura.
Basado en este dato, nosotros hypothesized que el vasculature es esencial en
coordinar el phenotypic transformacin de cartlago a hueso. Para aislar el
vasculature de el experimento, nosotros cultivados el cartlago grafts en vitro
bajo osteogenic las condiciones que contienen BMP2. El cartlago de callo de la
fractura explants en gran parte mantuvo su hypertrophic morfologa y regiones
de calciel catin y el cartlago matriciales staining superpuestos. Para el hMSC
pelotitas, regiones de la mineralizacin generalmente ocurrida en reas donde
all estuvo disminuido proteogylcan contenido y ms attened las clulas
estuvieron observadas. La capacidad de MSC cartlago derivado para generar
estos tanllamados chondroosseo rudiments en vitro anteriormente ha sido
descrito, demostrando que este supercial la regin tiene el
histological, microstructural, e immunohistochemical charac- teristics de hueso.
(38)
A ms con exactitud recapitulate el microenvironment del callo de fractura en
vitro, y specically introduce el paracrine efecto de vascular endothelial clulas,

nosotros cultivados el cartlago explants con HUVECmedio condicionado. En

una fractura, el invadiendo vascular endothelial las clulas proporcionan MMP
9(68) y BMPs(33,69) para estimular alcalino phosphatase actividad,(70) pero el
conjunto completo de bioactive los estmulos no es plenamente dened.
Encontramos que HUVEClos medios de comunicacin condicionados era
sufcient para promover mineralizacin de la matriz de cartlago, pero todava
no observ cambio morfolgico sustancial de el hypertrophic chondrocyte a
osteocito. Tomado junto, estos en vitro los experimentos sugieren que a pesar
de que mineralized el cartlago puede ser producido con factores solubles de
vasculares endothelial clulas, o BMP 2 tratamiento, slo no son sufcient
para producir una transicin completa a hueso..
Degradacin de
la matriz de cartlago y mecnico stimula- tion era dos
componentes de el en vivo entorno que no fue replicated por nuestro en vitro
condiciones. El dato anterior de nuestro
laboratorio ha mostrado que
remodelacin de cartlago es crtica durante reparacin de fractura y la
ausencia de MMPs resultados en impaired curacin.(32,68) De modo parecido,
nuestro laboratorio ha mostrado que mechani- cal estabilidad enuences el
destino de clulas de progenitor esqueltico durante curacin de hueso, con la
estabilizacin llena que promueve intramembranous la reparacin y el
movimiento que habilitan endochondral ossicatin.(13) La funcin
de
mecnico cargando durante el cartlago de transicin a hueso en el callo de
fractura no ha sido anteriormente explor. Es posible que la estimulacin
mecnica es central a esta transicin y contribuido al sostenido hypertrophic
el fenotipo observado en vitro y habilit la transicin en el segmental defecto.
El murine el modelo utilizado en este estudio, a pesar de que proporcionando
estabilizacin externa para facilitar alineacin, no completamente
Elimina sheer y compressive fuerzas entre el anfitriones y graft hueso. El
efecto preciso de cargar en regular la transformacin de cartlago a hueso,
ambos en un moleculares o kinetic nivel, no fue explorado en este estudio
pero es cuestiones importantes para considerar en modelos animales ms
grandes.
Diseando tratamientos clnicos mejorados para la reparacin y la
regeneracin de hueso es unos focos centrales de nuestro laboratorio.
Nuestro estudio substantiates el concepto de utilizar cartlago grafts como una
aproximacin teraputica alternativa para regeneracin de hueso. Ms all,
evidencia que el cartlago directamente convierte a hueso durante la
reparacin tambin puede requerir cambio en cmo
nos acercamos el
tratamiento de impaired curacin en fracturas. Realizacin llena del cartlago
graft la tecnologa descrita en este estudio es actualmente limitado por la
capacidad a escala esta aproximacin a clnicamente pertinente
Defectos; un paso prximo para este estudio ser para optimizar un scaffold
para una estrategia de ingeniera del tejido(19) y traducir esta aproximacin a
un estudio animal grande. La importancia de comprensivo el mecanismo por
qu cartlago puede regenerar el hueso para propsitos teraputicos entra
disear una aproximacin de ingeniera de tejido apropiada a con exactitud
recapitulate las secuencias de regeneracin.
Revelaciones

Todos los autores declaran que tienen no conicts de inters.

Acknowledgments
Algunos materiales y los reactivos eran generosamente dotados de colegas:
Jennifer Oeste (Universidad de Arroz, 6kDa PEGDA), Gary
Gibson (Henry Ford, Colgeno X anticuerpo), Anthony Hollender (Universidad
de Bristol, Colgeno yo anticuerpo), y Francesco Curcio (Oct4Un anticuerpo).
Tambin damos las gracias a colegas Alfred Kuo, Tamara Alliston, Nathan
Young, y Brian Sala para su revisin pensativa y discusin de nuestro dato.
Gracias A Frank Yang para su asistencia con murine husbandry y fracturas,
Alexis Lainoff para preparacin de algunos de las sondas para in situ, y a Gina
Baldoza y Anna Lissa Wi para funcin de laboratorio diario y administracin de
subvenciones.
La bsqueda informada en esta publicacin se mantuvo con
el Instituto
Nacional de Artritis y Musculoesquelticos y Enfermedad de Piel (NIAMS) de
los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo los nmeros de premio siguientes:
5F32AR06246902 (CSB), AR053645 (TM), y AR057344 (TM). Soporte de
bsqueda adicional estuvo proporcionado por el Musculoesqueltico Trasplanta
Fundacin (CSB: MTF Premio de Detective del Junior), el UCSF Educacin de
Licenciado en Ciencias Mdicas (GEMAS) y Clnicos y Translational Instituto de
Ciencia (CTSI), y OHSU Gerlinger Premio de Bsqueda (BJ, CSB).
Autores' funciones: diseo de Estudio: CSB, DPH, BH, TM, y RSM. Conducta de
estudio y coleccin de dato: CSB, DPH, AJT, FF, y HMB. Interpretacin de dato:
CSB, DPH, AJT, FF, HMB, BH, BJ, TM, y RSM. Redactando manuscrito: CSB.
Revisando manuscrito: CSB y RM. Todos los autores aprobaron de nal versin
de el manuscrito. CSB se responsabiliza para la integridad de el dato.