MECANISMOS BIOQUMICOS DE LA MUERTE

CELULAR POR APOPTOSIS

1. Introduccin
La muerte celular, particularmente la apoptosis, probablemente sea uno
de los tpicos ms estudiados entre los bilogos celulares. Entender la
apoptosis en condiciones de enfermedad es muy importante, ya que no
slo puede ensear la patognesis de la enfermedad sino tambin da
pistas de cmo puede ser tratada la enfermedad; por ejemplo, en el
cncer hay una prdida de balance entre las clulas en divisin y la
muerte celular, y las clulas que deberan morir no reciben las seales
para hacerlo. El problema puede surgir en cualquier etapa en la va de la
apoptosis. Un ejemplo es el downregulation del p53, un gen supresor de
tumor, que resulta en menos apoptosis y mayor crecimiento y desarrollo
tumoral, y la inactivacin del p53, independientemente del mecanismo,
se lo ha vinculado a muchos cnceres humanos.
2. APOPTOSIS
La apoptosis es un tipo de muerte celular que usan los organismos
multicelulares para eliminar clulas daadas o no necesarias de una forma
perfectamente controlada que minimiza el dao de las clulas vecinas. Los
restos celulares resultantes, que estn siempre rodeados de membrana
plasmtica, son eliminados mediante fagocitosis, evitando la inflamacin
en esa zona.
La clula que muere por apoptosis sufre una serie de cambios
morfolgicos, reducindose su volumen. La membrana se altera y
aparecen protuberancias ("blebbing"), el citoplasma y los orgnulos
celulares se condensan y se liberan factores del interior de la mitocondria
que promueven la muerte.
Desde que fue descripta la apoptosis por Kerret al en 1970, es uno de los
procesos ms investigados en la biologa. Al ser un proceso altamente
selectivo, es importante tanto en condiciones fisiolgicas como
patolgicas. En situaciones fisiolgicas tales como la destruccin
programada en el desarrollo embrionario para terminar de formar los
tejidos, la involucin fisiolgica tales como el desprendimiento del

endometrio o la regresin de la mama luego de la lactancia, la destruccin

normal de las clulas acompaadas por nueva proliferacin como en el
tracto digestivo, la involucin del timo a edad temprana. Y en condiciones
patolgicas como la muerte celular inducida por un quimioterpico en el
cncer, la muerte y deplecin progresiva de los CD4 en el SIDA, algunas
formas de muerte celular inducidas por virus como en las hepatitis B o C,
la atrofia patolgica de rganos y tejidos como resultado de retirar un
estmulo como la atrofia de la prstata luego de una orquiectoma, etc. En
resumen, la muerte celular programada hace referencia a situaciones en
las cuales las clulas activan un programa letal que se encuentra
codificado en el genoma, que en un momento preciso, selecciona
determinadas clulas para morir. La apoptosis tiene como funcin
biolgica principal mantener la homeostasis en distintas poblaciones
celulares. La desregulacin de este proceso puede conducir a estados
patolgicos que involucran a enfermedades con excesiva acumulacin
celular (falta apoptosis) o con excesiva prdida celular (sobra apoptosis).
3. Cambios bioqumicos en la apoptosis:
A grandes rasgos, existen tres tipos principales de cambios bioqumicos que
pueden verse en la apoptosis:
1) Activacin de las caspasas.
2) Rotura de DNA y otras protenas.
3) Cambios de la membrana y reconocimientos por parte de las clulas
fagocticas.
Al principio de la apoptosis, hay expresin de fosfatidilserina (PS) en las
capas externas de la membrana celular, que han hecho un flipped out
desde las capas ms internas. Esto permite el reconocimiento temprano de
clulas muertas por los macrfagos, lo que resulta en fagocitosis sin
liberacin de componentes celulares pro-inflamatorios. Esto es seguido de
una rotura caracterstica del DNA en piezas grandes de 50 a 300 kilobases.
Ms tarde, hay un clivaje internucleosomal del DNA en oligonucleosomas
formados por mltiplos de 180 a 200 pares de bases, por parte de las
endonucleasas. Esto hace que en la corrida electrofortica en el gel,
aparezca la caracterstica escalera de DNA. Otra caracterstica especfica
de la apoptosis es la activacin de un grupo de enzimas que pertenecen a
la familia de la cistena-proteasas, denomindas caspasas. La c de
caspasa se refiere a la Cisteinaproteasa, en tanto el aspasa se refiere a
la propiedad nica de la enzima de clivar siempre despus de residuos
asprticos. Las caspasas activadas, clivan muchas protenas celulares
vitales y rompen el andamiaje nuclear y el citoesqueleto. Tambin activan a
las DNAsas, que adems degradan al DNA nuclear. Aunque los cambios
bioqumicos explican en parte algunos de los cambios morfolgicos de la
apoptosis, es importante notar que el anlisis bioqumico de la
fragmentacin del DNA o la activacin de las caspasas no deberan ser
usados para definir a un proceso apopttico, ya que puede ocurrir apoptosis
sin fragmentacin olignonucleosomal del DNA y puede ser caspasaindependiente. El Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD) ha

propuesto que la clasificacin de las modalidades de muerte celular se

basen exclusivamente en criterios morfolgicos, ya que no hay una clara
equivalencia entre cambios ultraestructurales y bioqumicos que deriven de
la muerte celular.

Papel de la mitocondria en la apoptosis:

Durante la apoptosis las mitocondrias liberan al citosol protenas que
participan en el proceso de manera decisiva. Una de estas protenas es el
citocromo c que una vez en el citosol produce la activacin de algunas
caspasas. La liberacin de protenas de la mitocondria va acompaada de
una prdida de su funcin como orgnulo generador de energa, ya que se
afecta el proceso de transporte electrnico.

Fagocitosis de las clulas apoptticas:

En las clulas apoptticas se producen cambios en la distribucin de lpidos
de la membrana plasmtica. Un fosfolpido normalmente presente slo en la
cara interna de la bicapa lipdica, la fosfatidilserina, se transloca a la cara
externa. La fosfatidilserina en la superficie celular acta como seal para
que la clula apopttica sea reconocida y eliminada por los fagocitos.

Figura. Muerte celular por apoptosis. A) Panel superior: Fases del proceso de
muerte
por
apoptosis:
condensacin de los distintos
orgnulos
celulares,
fragmentacin
celular
generando cuerpos apoptticos
y fagocitosis. Panel inferior:
Imgenes
del
microscopio
ptico
mostrando
ncleos
teidos con DAPI de clulas
normales o apoptticas. En
este ltimo caso, los ncleos
aparecen
condensados
o
fragmentados. B) Rutas de
activacin de la apoptosis: de
receptores de muerte y mitocondrial. Cascadas de activacin de caspasas que
conducen a la ruptura de protenas y a la activacin de la fragmentacin del ADN.

Mecanismos de apoptosis:
Entender los mecanismos de apoptosis es crucial y ayuda a entender la
patognesis de condiciones que resultan de una apoptosis desordenada. Esto, a
su vez, puede ayudar al desarrollo de drogas que hagan blanco en ciertos genes
apoptticos o vas de la misma. Las caspasas son centrales al mecanismo de la
apoptosis ya que son tanto iniciadoras como ejecutoras del proceso. Hay tres vas
por el cual las caspasas pueden ser activadas. Las dos comnmente descriptas
vas de iniciacin son la va intrnseca (o mitocondrial) y la va extrnseca (o del
receptor de muerte). Ambas vas finalmente llevan a una va comn o fase de
ejecucin de la apoptosis. Una tercera va de iniciacin, menos conocida, es la va
del retculo endoplsmico intrnseca.

La va extrnseca del receptor de muerte: La va extrnseca del receptor

de muerte, como su nombre lo indica, comienza cuando los ligandos de
muerte se unen a un receptor de muerte. Aunque se han descripto varios
receptores de muerte, los ms conocidos receptores de muerte son el
receptor de TNF tipo 1 (TNFR1), y una protena relacionada llamada Fas
(CD95) y sus ligandos, TNF y Fas ligando (FasL), respectivamente. Estos
receptores de muerte tienen un dominio de muerte intracelular que recluta a
protenas adaptadoras tales como el dominio de muerte asociado al
receptor TNF (TRADD) y al dominio de muerte asociado a Fas (FADD), as
como a cistena-proteasas como las caspasas. La unin de un ligando de
muerte a un receptor de muerte, resulta en la formacin de un sitio de unin
para una protena adaptadora y el complejo completo de ligando-receptoradaptador se conoce como DISC (complejo de sealizacin que induce
muerte). El DISC entonces, inicia el ensamblaje y activacin de la procaspasa 8. La forma activada de la enzima, la caspasa 8, es una caspasa
iniciadora, que inicia la apoptosis clivando otras caspasas ejecutoras o de
ro abajo.

La va intrnseca mitocondrial: Como su nombre lo indica, la va

intrnseca se inicia dentro de la clula. Los estmulos internos, tales como
un dao gentico irreparable, la hipoxia, concentraciones extremadamente
altas de calcio citoslico y un stress oxidativo severo, son todos
disparadores de la iniciacin de la va mitocondrial intrnseca.
Independientemente del estmulo, esta va es el resultado de una
permeabilidad mitocondrial aumentada y de la liberacin de molculas
proapoptticas tales como la citocromo-c hacia el citoplasma. Esta va est
estrechamente regulada por un grupo de protenas que pertenecen a la
familia Bcl-2. Hay dos grupos principales de protenas Bcl-2,
especficamente las protenas pro-apoptticas (Bax, Bak, Bad, Bcl-Xs, Bid,
Bik, Bim y Hrk) y las anti-apoptticas (Bcl-2, Bcl-XL , Bcl-W, Bfl-1 y Mcl-1)
En tanto las protenas anti-apoptticas frenan la apoptosis bloqueando la
liberacin mitocondrial de citocromo-c, las protenas pro-apoptticas actan
promovieron la liberacin de citocromo-c desde la mitocondria hacia el
citoplasma. No es la cantidad absoluta, sino el balance entre las protenas
pro- y anti-apoptticas lo que determina si se va a iniciar o no la apoptosis.
Otros factores apoptticos que se liberan desde el espacio
intermembranoso mitocondrial hacia el citoplasma incluyen al factor
inductor de apoptosis (AIF), al segundo activador de caspasa derivado de
mitocondria (Smarc), a la protena de unin al IAP directo con bajo ph
(DIABLO) y la protena A de requerimiento de alta temperatura /Omi
(HtrA2). La liberacin citoplasmtica de citocromo-c activa a la caspasa 3
por medio de la formacin de complejo conocido como apoptosoma, que
est conformado de citocromo-c, Apaf-1 y caspasa 9. Por otro lado, el
Smac/DIABLO o la Omi/HtrA2, promueven la activacin de la caspasa
unindose al inhibidor de las protenas de apoptosis (IAPs) que

posteriormente lleva a la disrupcin en la interaccin de los IAPs con la

caspasa 3 o 9.

La
La

va
comn:
fase de

ejecucin de la apoptosis involucra la activacin de una serie de caspasas.

Las caspasas que est hacia arriba de la va intrnseca es la caspasa 9, en
tanto la de la va intrnseca es la capasa 8. Las vas intrnseca y extrnseca
convergen en la caspasa 3. La caspasa 3, as, cliva al inhibidor de la
desoxiribonucleasa activada por caspasa, que es responsable de la
apoptosis nuclear. Adems, las caspasas que estn rio abajo, inducen el
clivaje de las proten-kinasas, protenas del citoesqueleto, protenas de
reparacin del DNA y subunidades inhibitorias de la familia de las
endonucleasas. Tienen tambin un efecto sobre el citoesqueleto, el ciclo
celular y las vas de sealizacin, los cuales, todos juntos, contribuyen a los
cambios morfolgicos tpicos de la apoptosis. El hecho de que los
precursores de las caspasas estn expresados constitutivamente en las
clulas vivas, y que la apoptosis pueda inducirse rpidamente en ellas,
probaran la alta sofisticacin y eficiencia del proceso de regulacin de las
caspasas. En la actualidad existen varios modelos que explican el modo en
que se regulara la actividad de estas proteasas:
1) Activacin de las caspasas efectoras: una seal pro-apopttica
culmina en una caspasa iniciadora que, posteriormente, activa a las
efectoras provocando el desensamblaje celular.
2) Activacin de las caspasas iniciadoras: las caspasas iniciadoras se
activaran por unin a cofactores especficos. As, en el caso de la procaspasa 8 se requerira la unin con su cofactor FADD para su activacin.
La pro-caspasa 9, en cambio, se activa al unirse a Apaf-1, pero requiere del
citocromo-c y del ATP para conformar el apoptosoma. Esto indica que la
activacin de estas proteasas puede requerir de mltiples cofactores,
habiendo surgido distintos modelos para explicar cmo podra producirse la
activacin a travs de ellos.

3) Los inhibidores como reguladores: las IAPs actuaran bloqueando la

apoptosis a travs de la inhibicin de caspasas efectoras, sin embargo,
tambin previenen la activacin de estas enzimas cuando hay
sobreexpresin, sugiriendo que los blancos reales en las clulas son la procaspasas efectoras y otras protenas involucradas en la activacin.
La va del retculo endoplasmtico intrnseco.
Esta va del retculo endoplsmico intrnseco es una tercera va y la menos
conocida. Se cree que depende de la caspasa 12 y es independiente de la
mitocondria. Cuando el RE se injuria por stress celular como hipoxia,
radicales libres o falta prolongada de glucosa, hay un desplegamiento de
protenas y una sntesis reducida de protenas en la clula, y una protena
adaptadora conocida como factor 2 asociado al receptor TNF (TRAF2), se
disocia de la pro-caspasa 12, resultando en la activacin de la misma.

4. Protenas de la familia Bcl-2

La familia de protenas Bcl-2, est comprendida por protenas proapoptticas y anti-apoptticas, que juegan un rol importantsimo en la
regulacin de la apoptosis, especialmente en la va intrnseca, ya que son
previas al dao celular irreversible y actan principalmente a nivel
mitocondrial. Todos los miembros Bcl-2 estn localizados en la membrana
mitocondrial externa. Son dmeros responsables de la permeabilidad de
esta membrana, sea en la forma de canal inico o a travs de la creacin
de poros. Segn su funcin y los dominios de homologa Bcl-2 (BH = Bcl-2
Homology), los miembros de esta familia se dividen en tres grupos. El
primer grupo son las protenas anti-apoptticas que contienen los cuatro
dominios BH y protegen a la clula de cualquier estmulo apopttico.
Algunos ejemplos son el Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, A1/Bfl-1 y Bcl-B/Bcl2L10. El
segundo grupo est conformado de protenas slo con dominio BH-3,
llamadas as en comparacin a los otros miembros, y estn restringidas al
dominio BH3. Ejemplos de este grupo incluyen al Bid, Bim, Puma, Noxa,
Bad, Bmf, Hrk y Bik. En momentos de mucho stress celular, tal como dao
al DNA, deprivacin de algn factor de crecimiento, se activan las protenas
slo-BH3, que son iniciadoras de la apoptosis. Por lo tanto, son proapoptticas. Los miembros del tercer grupo contienen tambin los cuatro
dominios BH y tambin son pro-apoptticas. Algunos ejemplos incluyen al
Bax, Bak y Bok/Mtd. Cuando hay disrupcin en el balance de miembros de
la familia Bcl-2 anti-apoptticos y proapoptticos, el resultado es una
apoptosis desregulada en las clulas afectadas. Esto puede deberse a una
sobreexpresin de una o ms protenas anti-apoptticas o a una subexpresin de una o ms protenas proapoptticas o a una combinacin de
ambas cosas. Por ejemplo, se demostr que la sobreexpresin de Bcl-2
(anti-apopttica) protege a las clulas del cncer de prstata de la
apoptosis; tambin se demostr que la sobreexpresin de Bcl-2 lleva a la
inhibicin de la apoptosis inducida por TRAIL en los neuroblastomas y en
las clulas de cncer de mama.

5. p53
La protena p53, tambin llamada protena tumoral 53 (o TP 53), es uno de
las protenas supresoras de tumores mejor conocidos, codificado por el gen
supresor de tumor TP53, localizado en el brazo corto del cromosoma 17
(17p). Se los denomina por su peso molecular, es decir 53 kDa. Esta
protena no solo est involucrada en la induccin de la apoptosis sino
tambin tiene un papel clave en la regulacin del ciclo celular,
diferenciacin, desarrollo, amplificacin gnica, recombinacin del DNA,
segregacin cromosmica y senescencia celular, por lo que es llamada
guardian del genoma.

6. Inhibidor de protenas de la apoptosis (IAPs)

El inhibidor de protenas de la apoptosis son un grupo de protenas
estructural y funcionalmente similares que regulan la apoptosis, citoquinesis
y transduccin de seales. Se caracterizan por la presencia de un dominio
proteico de repeticin (BIR). A la fecha, se han identificado ocho IAPs. Los
IAPs son inhibidores endgenos de las caspasas y pueden inhibir la
actividad de las caspasas uniendo sus dominios BIR conservados a los
sitios activos de las caspasas, promoviendo la degradacin o manteniendo
a las caspasas lejos de sus sustratos.

Bibliografa:

http://med.unne.edu.ar/sitio/multimedia/imagenes/ckfinder/files/files/CarreraMedicina/BIOQUIMICA/apoptosis.pdf
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Diosdado Vargas/ Tc Per Mex 2003; 41(1): Pg 49 -62, disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/vetmex/vm-2005/vm051h.pdf
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Isabel Marzo Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular II. Universidad
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