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Prácticas de Laboratorio-Hematologia
Prácticas de Laboratorio-Hematologia
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Prcticas de LABORATORIO
OBJETIVOS GENERALES
Que el alumno conozca:
Las principales propiedades de las protenas y que se familiarice con los procesos
generales de extraccin, identificacin y cuantificacin de las mismas.
Que las enzimas constituyen una clase especial de protenas, que requieren condiciones
ptimas de accin, que catalizan reacciones qumicas especficas y que para su
funcionamiento resulta esencial mantener la conformacin nativa.
I. PROTENAS
OBJETIVOS ESPECFICOS
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celulares que puedan interferir con las determinaciones. Por ltimo, si el objetivo es analizar
la estructura del glucgeno, ser necesario purificarlo.
En el presente trabajo prctico se realizar una extraccin de las protenas solubles en
medio acuoso que se encuentran presentes en frutos. Luego de la extraccin, las protenas
sern separadas de impurezas tales como azcares y pigmentos por tratamiento con
acetona, que produce la precipitacin de las protenas, las que luego sern redisueltas y
posteriormente cuantificadas por el mtodo de Bradford.
2. Reaccin del biuret
Fundamento de la reaccin
Consiste en tratar una protena o pptido con Cu++ en medio alcalino, producindose una
coloracin violcea por formacin de un complejo de coordinacin entre el Cu++ y los pares
electrnicos libres de los nitrgenos de los grupos imino de la unin peptdica. Son
necesarias por lo menos dos uniones peptdicas para que tenga lugar la reaccin.
Retomando lo visto anteriormente en el trabajo experimental del mdulo 2 (ver
algunas consideraciones), cuando se caracteriza un grupo o familia de sustancias (por
ejemplo, caracterizacin cuali o cuantitativa de protenas en una muestra problema) o
identifica una sustancia en particular (por ejemplo comprobar la presencia de ovoalbmina
en clara de huevo) se debe tener muy en cuenta el objetivo que se persigue. En funcin de
este objetivo se seleccionar el mtodo ms indicado.
La reaccin del biuret no es una reaccin especfica para protenas. Eso hace que un
resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los
resultados falsos positivos.
Un resultado negativo de la reaccin del biuret sobre una muestra problema no
necesariamente indica la ausencia de protenas, ya que puede ocurrir a) que no existan
protenas o pptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret
positivas), b) que existan una o ms sustancias interferentes en la muestra que impidan que
se produzca la reaccin (lo que dara lugar a un resultado falso negativo). Esto puede
descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composicin aproximada de la muestra.
Por ejemplo, si deseo determinar el contenido de pptidos generados por una reaccin de
hidrlisis cida, los H+ del medio interferirn con la reaccin del biuret, ya que sta necesita
de un medio alcalino para la formacin del complejo con Cu++. En este caso la interferencia
puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo (en caso contrario
obtendra un falso negativo como resultado) y c) Que existan pptidos, pero a una
concentracin inferior al lmite de sensibilidad del mtodo. Todo mtodo permite determinar
la presencia de un compuesto slo si la concentracin del mismo es superior a cierto valor.
Existen mtodos mucho mas sensibles que el biuret (ver mas abajo).
3. Reaccin de Bradford
Fundamento de la reaccin
El mtodo involucra la unin de un colorante, el Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) a las
protenas. La solucin del colorante libre es de color rojizo (mxima absorcin a 465 nm) y
cambia al azul (mxima absorcin a 595 nm). La unin es un proceso rpido
(aproximadamente 2 minutos) y el complejo colorante-protena se mantiene estable hasta
una hora despus de producido.
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Como en esta reaccin el CBB se une especficamente a las protenas, es un buen mtodo de
caracterizacin (aunque no de identificacin). La reaccin se prefiere a otras por su
sensibilidad (mayor que la del biuret), lo que significa que, para una misma muestra, puede
obtenerse un resultado positivo con el reactivo de Bradford pero negativo con el reactivo del
biuret.
Dado que an los materiales biolgicos ms sencillos poseen una composicin qumica
compleja, siempre se debe de tener en cuenta la posibilidad de interferencias (positivas o
negativas). Tambien se debe tener en cuenta que no siempre son las mismas sustancias las
que interfieren en los distintos mtodos. En el caso de extractos vegetales es comn
encontrar sustancias como los fenoles que por lo general producen interferencias en muchos
de los mtodos de caracterizacin de protenas. La reaccin de Bradford es de eleccin en
estos casos pues los mencionados compuestos no producen interferencia.
Confeccin de la curva de calibracin
Una vez que se ha detectado la presencia de un componente es importante conocer la
cantidad del mismo presente en la muestra y en consecuencia se debe hallar una manera de
cuantificarlos. Para llevar a cabo el anlisis cuantitativo es necesario efectuar una curva de
calibracin. Para la confeccin de dicha curva se utilizan diluciones de una protena pura de
concentracin conocida (protena patrn; en nuestro caso utilizaremos albmina bovina).
Sobre cada dilucin se lleva a cabo la reaccin de Bradford y la curva de calibracin se
obtiene graficando los datos de absorbancia [2] correspondientes a cada una de las
diluciones versus la concentracin de protena de las mismas. El rango de deteccin de
protenas para el mtodo es de 0,1 a 1 mg/ml, dentro del cual la relacin absorbanciaconcentracin se mantiene lineal.
4. Ensayos de estabilidad de protenas en dispersin acuosa
Las protenas se mantienen dispersas gracias a interacciones con las molculas de solvente y
de solutos presentes. Su estabilidad, al igual que sucede con otras macromolculas que
forman dispersiones coloidales, se fundamenta en dos factores: hidratacin y carga
elctrica, que actan contraponindose a la influencia de la gravedad que tiende a producir la
sedimentacin de las partculas dispersas. En el seminario de trabajos prcticos se discutir en
detalle de qu forma distintos agentes (pH, agentes deshidratantes, solventes orgnicos, etc)
influyen sobre la estabilidad de las protenas.
5. Electroforesis
Fundamento
Si se aplica un campo elctrico a una solucin que contiene una molcula con carga neta (+
o -), sta migrar a una velocidad que depende del valor de su carga, su tamao y su
forma. Esta tcnica, denominada electroforesis, se utiliza para separar mezclas de
molculas cargadas (protenas, cidos nucleicos), ya sea sobre un soporte (papel, cellogel) o
dentro de un gel (agarosa, almidn o poliacrilamida).
La movilidad electrofortica es la relacin de la velocidad de la molcula (v) y el potencial
elctrico (E). Tambin es igual a la carga neta de la molcula (Z) dividida por el coeficiente
friccional (f), que es la resistencia que el gel opone al movimiento de la partcula.
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En la frmula puede verse que a mayor carga elctrica, mayor ser la movilidad de la
molcula.
Un parmetro importante a considerar en la electroforesis de aminocidos y protenas es su
punto isolelctrico (pI), ya que conociendo el pI y el pH del medio, conoceremos la carga de
la molcula. Cuando el pH es mayor que el pI la molcula tendr carga negativa; por el
contrario, si el pH es menor que el pI la carga de la molcula ser positiva. De esta manera,
de acuerdo al pH del buffer de electroforesis utilizado, la muestra se sembrar en uno u otro
polo: si la molcula tiene carga negativa se sembrar cerca del polo negativo (ctodo), con
lo que migrar hacia el polo positivo (nodo) y viceversa.
II. ENZIMAS
OBJETIVOS ESPECFICOS
Detectar la presencia o ausencia de actividad enzimtica en saliva (actividad amiloltica)
y en jugo de anan (actividad proteoltica).
Determinar el valor de la actividad enzimtica variando algunos parmetros que la
afectan (pH, temperatura).
Si en un extracto biolgico se desea establecer la presencia de una determinada protena con
actividad biolgica, tal como una enzima, no basta con determinar la existencia de dicha
protena, sino que se requiere un ensayo que pruebe que la misma es biolgicamente
funcional. Cuando la actividad biolgica es especfica (como ocurre en el caso de las enzimas)
resulta innecesaria la etapa de purificacin, ya que la actividad biolgica ser evidenciable an
en presencia de otras protenas, aunque ser necesaria la eliminacin de cualquier sustancia
que interfiera con su actividad.
Para medir la actividad enzimtica slo se requiere un mtodo analtico sencillo que determine
la desaparicin del sustrato o la aparicin de los productos de reaccin.
Enzima
2Sustrato
P
Productos
Para medir la influencia del pH, de la temperatura, de la concentracin de enzima, etc. sobre
la velocidad de la reaccin, debe realizarse dicha reaccin variando el factor en estudio y
dejando constantes todos los dems.
1. Degradacin de almidn por accin de amilasa salival
Fundamento
El mtodo se basa en la hidrlisis del almidn (sustrato), en condiciones de pH y
temperatura fisiolgicos, por accin de una amilasa presente en la saliva. Los productos de
reaccin son polisacridos de menor peso molecular hasta llegar a disacridos (maltosa), no
evidenciables con el reactivo de Lugol (pero s con Fehling).
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2. Determinacin de la actividad proteoltica de las enzimas presentes en el jugo de anan
Fundamento:
El mtodo se basa en la hidrlisis de la casena (sustrato) por accin de enzimas
proteolticas (proteasas) en condiciones de pH y temperatura adecuados, obtenindose como
producto de reaccin pptidos de menor peso molecular, que no precipitan por el agregado
de cido tricloroactico y que pueden evidenciarse por medio de la reaccin del biuret.
Medida de la actividad proteoltica
proteasas
CASENA
pptidos pequeos
0,5 ml
0,5 ml
1 gota
Empleando el protocolo correspondiente, realizar la reaccin del biuret con cada una de
las soluciones indicadas en la tercera columna de la misma tabla
Tipo de Ensayo
Control Negativo (Blanco)
Control Positivo
Muestra 1
Muestra 1
Rotular
B
P
G
H
Solucin a investigar
Agua destilada
Casena al 0,1%
Gelatina comercial al 1%
Clara de huevo al 10%
Reactivo de Bradford
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Protocolo de la reaccin de Bradford
Colocar en un tubo de ensayo:
Solucin a investigar
Reactivo de Bradford
0,05 ml
2,50 ml
Empleando el protocolo correspondiente, realizar la reaccin del biuret con cada una de
las soluciones indicadas en la tercera columna
Nmero de ensayo
Control Negativo (Blanco)
Control Positivo
Muestra 1
Muestra 2
Albmina 1 mg/ml
---0,1 ml
0,25 ml
0,5 ml
0,75 ml
1,0 ml
Agua destilada
1,0 ml
0,9 ml
0,75 ml
0,5 ml
0,25 ml
----
Agregar en cada
tubo las
sustancias
indicadas en las
columnas de la
derecha y mezclar
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Determinacin de la absorbancia para cada dilucin de albmina
Agregar gota a gota solucin saturada de sulfato de amonio hasta que no se observe ms
formacin de precipitado
11.
Colocarlas sobre una placa de vidrio adhirindolas bien y dejar en estufa durante unos
minutos
12.
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II. ENZIMAS
1. DEGRADACIN DE ALMIDN POR ACCIN DE LA AMILASA SALIVAL
1.1. Preparacin de la solucin stock de enzima
Colocar gotas de saliva diludas en 0,5 ml de agua destilada.
1.2. Ensayo cualitativo. Deteccin de la atividad amilsica
Agregar 0.5 ml de la solucin stock de amilasa salival a un tubo Lugol positivo (solucin
de almidn ms Lugol, color violceo)
Luego de unos minutos, el tubo con saliva comenzar a cambiar de color por desaparicin
del complejo almidn-yodo
Ensayo
Blanco
Muestra
0,1ml
0,1ml
TCA al 5%
2 ml
Casena al 1%
1 ml
1 ml
o
Incubar a 37 C durante el tiempo indicado
TCA al 5%
2 ml
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2.2.1. Efecto del pH
Segn el protocolo indicado arriba se determinar la actividad enzimtica empleando como
sustrato soluciones de casena al 1% disuelta en soluciones de diferente valor de pH (2; 7 y
11)
Rotular cuatro tubos de la siguiente manera: B (para el blanco), 2 (para la solucin de
casena de pH 2), 7 (para la solucin de casena de pH 7) y 11 (para la solucin de casena
de pH 11)
Continuar el protocolo
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Muestra A
+
+
+
Muestra B
+
-
Muestra C
+
-
En base a los resultados del cuadro, qu compuesto/s podrn hallarse en cada una de las
muestras?
2) Qu reacciones de caracterizacin realizara para verificar la naturaleza proteica de la
gelatina? Cul es el fundamento de esta reaccin de caracterizacin? Indicar reactivos y
visualizacin de la reaccin.
3) Una protena con estructura helicoidal, da positiva la reaccin de Lugol?.
4) Si realiza la reaccin del biuret sobre una solucin del aminocido alanina, obtendr
resultado (+) (-)?
5) Puedo utilizar el mtodo de biuret para identificar albmina bovina en una mezcla de
protenas? Fundamente su respuesta.
6) En qu caso el resultado de la reaccin de biuret puede generar un falso negativo?
7) Se realiza la reaccin de Bradford en una muestra problema y los resultados son los
siguientes:
agua destilada: (-)
muestra: (-)
solucin de casena al 1%: (+)
Explique los resultados obtenidos
8) Qu operaciones debera efectuar si se desea cuantificar el contenido de protenas en el
jugo de anan?
9) Explique el efecto del (NH4)2SO4 sobre las protenas.
10) Cul es el fundamento de la tcnica de electroforesis?. De qu factores depende la
migracin diferencial de las molculas? A qu tipo de compuestos puede aplicarse esta
metodologa?
11) Disee las condiciones de una experiencia electrofortica que le permita separar tres
protenas (A, B y C), cuyos pesos moleculares son del mismo orden pero cuyos puntos
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isoelctricos tienen los siguientes valores: 8.3, 5.1 y 7.2, respectivamente. Fundamente su
respuesta.
12) En qu direccin migrarn las siguientes protenas puestas en un campo elctrico al pH
indicado ?
a) Seroalbmina a pH = 5
(p I=4,9; PM = 68.500)
(pI=9,5 PM=23.240)
[1] EC son las iniciales del Comit de Enzimas (Enzyme Committee) de la Unin
Internacional de Bioqumca y Biologa Molecular.
[2] En la mayora de las reacciones de coloracin la intensidad del color producido es
proporcional a la concentracin del compuesto en la muestra. Esta intensidad puede ser
evaluada espectrofotomtricamente por medida de un parmetro especfico: la absorbancia.