DESCRIPCIN Y

UTILIZACIN DE LOS
MEDIOS DE CULTIVO
.
Son
los
ms
corrientemente
utilizados, y aunque no vamos a
enumerarlos todos, s son los ms
conocidos en un laboratorio de
Microbiologa.
Agar nutritivo: Este medio es
bastante bueno para el cultivo de
grmenes
que
no
presentan
exigencias particulares. No es
diferencial.
Agar sangre: Es un medio
enriquecido que se utiliza adems
para la investigacin de los diversos
tipos de hemlisis (, gamma ).
Se utiliza para el crecimiento de
estreptococos. Para la preparacin
del agar sangre se puede utilizar el
agar nutritivo enriquecido con
cloruro sdico o un preparado
enriquecido con otras sustancias
como Columbia o el tripticase de
soja. La adicin de sangre a un
medio de cultivo no proporciona las
sustancias que estn en el interior de
los hemates, pero s puede aadir
factores inhibidores del crecimiento
bacteriano presentes en el suero.
Este es un inconveniente que puede
solucionarse calentando la sangre
para romper los eritrocitos y para
que se destruyan las sustancias
inhibidoras, que son termolbiles.La
sangre utilizada como aditivo a estos
medios suele ser sangre de carnero

diluida al 5%, pero en algunas

ocasiones es necesario utilizar
sangre de otras especies (caballo,
conejo, humana), pues facilitan las
reacciones hemolticas o contienen
determinados
factores
de
enriquecimiento o no poseen
sustancias
inhibidoras
del
crecimiento
de
determinados
grmenes. Agar chocolate: El agar
chocolate se obtiene calentando la
sangre antes de adicionarla al medio
base. Por esta razn el agar
chocolate contiene hemoglobina,
que aporta al medio un importante
elemento para el crecimiento: el
factor X o hemina termoestable. El
agar chocolate es un medio
destinado
principalmente
al
aislamiento
de
Neisserias
(gonococos
ymeningococos)
y
Haemophilus, pero en l pueden
crecer
muchos
otros
microorganismos exigentes. El agar
chocolate puede convertirse quizs
en uno de los medios ms
enriquecidos si aadimos una
mezcla de factores de crecimiento no
contenidas en la sangre. Estas
mezclas, denominadas de forma
diferente
segn
las
casas
comerciales (Polivitex, Isovitalex,
etc.) contienen ms de una docena
de compuestos que confieren a este
medio unas cualidades nutritivas
extraordinarias. Por adicin de uno
o varios antibiticos pueden
lograrse medios inhibidores o
selectivos para el crecimiento de
determinados microorganismos. Un
ejemplo clsico es el Thayer-Martin,
utilizado para el aislamiento del

gonococo y que no es otra cosa que

un agar chocolate enriquecido al
cual se ha aadido unamezcla de
tres antibiticos especficos que
impedirn el crecimiento del resto
de la flora acompaante. Agar
MacConkey: Es un medio utilizado
para el aislamiento e identificacin
de enterobacterias. Es un medio
inhibidor de los grmenes Gram
positivos por su contenido en cristal
violeta
y
selectivo
para
enterobacterias por su contenido en
sales biliares. En su composicin
lleva un azcar (lactosa) y un
indicador (rojo de metilo) que lo
convierten en un medio diferencial.
Los grmenes que fermenten la
lactosa producen una acidificacin
del medio que hacen aparecer de
color rojo fuerte a las colonias
resultantes. Las colonias lactosa
negativas
sern
incoloras,
apareciendo del mismo color que el
medio subyacente (naranja).
Agar C.L.E.D.: El medio C.L.E.D.
(Cistina
Lactosa
Electrlito
Deficiente) est recomendado para
el
recuento
e
identificacin
presuntiva de los microorganismos
de las vas urinarias. Su bajo
contenido en electrolitos evita la
invasin de los cultivos por
Proteus.La presencia de lactosa en
su composicin le confiere el
carcter de medio diferencial,
aunque la interpretacin sea
diferente al anterior medio por la
incorporacin de otro indicador: el
azul de bromotimol. Las colonias
lactosa positivas aparecern de

color amarillo y las lactosa

negativas lo harn con un color
verdoso, blanco o azulado.
Agar S.S.:El agar SS es un medio
selectivo
empleado
para
el
aislamiento de Salmonella y Shigella
a partir demuestras fecales. El
medio contiene sales biliares y verde
brillante para impedir el crecimiento
de coliformes y grmenes Gram
positivos. La presencia de lactosa y
rojo de metilo nos permiten
diferenciar las colonias que
fermentan la lactosa (rosas o rojas)
de las que no lo hacen
(incoloras).Las
especies
de
Salmonella y Shigella no fermentan
nunca la lactosa por lo que este
medio es excelente para descartar
todas las colonias que no cumplan
este requisito. El agar SS es
doblemente diferencial, porque
adems
de
indicarnos
el
comportamiento de los grmenes
con relacin a la lactosa, nos
muestra los grmenes que son
capaces
de
producir
cido
sulfhdrico, que se manifiesta como
un precipitado de color negro en el
centro de la colonia. As, una
colonia incolora y con un punto
negro central es sospechosa de
Salmonella, y ser exclusivamente a
estas colonias a quienes se hagan
las
pruebas
bioqumicas
confirmatorias de esta especie. El
agar SS es un medio muy inhibidor
que a veces impide incluso el
crecimiento de ciertas especies de
Salmonella y sobre todo de Shigella.
Por esta razn debe utilizarse

siempre junto con otro medio menos

inhibidor como el Hektoen.
Agar Hektoen :Es un medio ms
diferencial y menos selectivo que el
agar SS. Se utiliza para facilitar el
aislamiento de las enterobacterias.
La presencia de tres azcares
(lactosa, sacarosa y salicilina )
permiten
ampliar
el
poder
diferencial de este medio. Este
medio es capaz de detectar los
grmenes formadores de SH2, igual
que el SS. Las cualidades del agar
Hektoen se deben a su riqueza en
peptonas y azcares, que neutralizan
el efecto inhibidor de las sales
biliares respecto a ciertos grmenes
de cultivo delicado (Shigella en
particular).El
crecimiento
de
Salmonella es excelente, igual que el
de Shigella, obtenindose colonias
ms numerosas y voluminosas que
en los medios selectivos usuales. La
inhibicin
tiene
lugar,
esencialmente, sobre E. coli y en
menor medida sobre Proteus y
Citrobacter. Hay que sealar que el
vibrin colrico crece bien en este
medio.
C.P.S. ID3. :Medio cromognico
desarrollado por Biomerieux, que
permite la identificacin de E. coli,
P. mirabilisy E. faecalis, con la
simple visualizacin del cambio de
color de la colonia sobre el medio
(rojo burdeos, azulo marrn). La
identificacin solo requiere la
adicin de un reactivo para
confirmar o descartar la especie
sospechada. Otros microorganismos

diferentes requieren los sistemas de

identificacin habituales (API, p. ej)
Granada, Islam o New GBS: Medios
utilizados para deteccin de
Streptococcus agalactiae, mediante
la utilizacin de un sustrato
cromognico especfico de este
microorganismo.
Agar Mueller-Hinton: Es el medio
universalmente aceptado para la
realizacin de los antibiogramas o
pruebas de sensibilidada los
antimicrobianos.
A
l
nos
referiremos ms ampliamente en el
captulo correspondiente
Agar Tripticase de soja: Es un
medio utilizado para el crecimiento
de grmenes exigentes, como
Brucella, Neisseria o Streptococcus.
Es un medio muy enriquecido, pero
no es diferencial. Caldo tioglicolato
con resazurina: Es un medio
recomendado para controles de
esterilidad. Permite el cultivo de
aerobios,
anaerobiosy
microaerfilos. Tiene un bajo
potencial redox que, al aumentar, se
manifiesta por un color rosa del
medio.
Agar Chapman: Es un medio
selectivo para el aislamiento de
estafilococos. Su elevado contenido
en cloruro sdico permite la
inhibicin de la mayora de los otros
grmenes. La presencia de manitol y
rojo fenol convierten a este medio en
diferencial: as se puede identificar
presuntivamente el Staphylococcus
aureus, ya que estegrmen crece

bien en medios salados y fermenta el

manitol (colonias amarillas).
Agar Baird-Parker: Permite el
crecimiento
de
estafilococos
coagulasa positivos, a la vez que los
diferencia del resto.
Medio de Loeffler: Es un medio
especfico para el cultivo de
Corynebacterium difteriae.
Agar Desoxicolato Citrato Lactosa
Sucrosa (DCLS):Similar al agar SS.
Es un medio diferencial e inhibidor
a la vez.
Agar Kligler: Medio especfico para
pruebas de identificacin de
enterobacterias. Aunque de l
hablaremos conms detenimiento en
el captulo de pruebas de
identificacin bacteriana, podemos
ir adelantando que se tratade un
medio diferencial que permite
conocer el comportamiento del
microorganismo ante dos azcares
(glucosa y lactosa), investigar la
formacin de gas y comprobar si el
microorganismo puede producir
sulfatoferroso a partir del tiosulfato
sdico.
Agar Levine EMB (Eosina azul de
metileno):Se utiliza para aislamiento
de enterobacterias, pues impide el
crecimiento de Gram positivos y
diferencia muy bien a E. coli, cuyas
colonias adquieren un color
negruzco con un brillo metlico
caracterstico. Caldo selenito-F: Se
utiliza
exclusivamente
para

enriquecimiento de Salmonellas.
Agar
Cetrimida.
Agar
King: Permiten el crecimiento de
Pseudomonas, inhibiendo Gram
positivos y la mayora de
enterobacterias.El segundo pone
adems
de
manifiesto
la
pigmentacin
fluorescente
de
Pseudomonas bajo luz UV.
Agar Schaedler: Es un medio con sangre y
vitamina K muy adaptado para el cultivo de
anaerobios.
Agar Gardnerella:Agar con sangre humana ms
una mezcla de antibiticos que permiten la
observacin
de
colonias
betahemolticas
caractersticas de Gardnerella vaginalis
Campylosel: Se utiliza para el aislamiento de
Campylobacter intestinales creciendo a 42 C en
microaerofilia.
Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract):Se
utiliza para el aislamiento de bacterias del gnero
Legionella
Lwenstein-Jensen:Este medio se utiliza para el
cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene
verde malaquita parainhibir parcialmente el
crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza
como sustancia de enriquecimiento.

Tincin Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras

celulares se tien con la misma tonalidad
(Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul
de lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de
KOH) permite ver elementos de hongos ya
que el KOH digiere parcialmente los
componentes proteicos, por ejemplo de la
clula husped, pero no acta sobre los
polisacridos de las paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite observar clulas
levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en
LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y
la cpsula aparece como un halo claro alrededor de los
microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede
agregarse a las preparaciones en fresco de heces para
observar la presencia de leucocitos.
En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin
con tinta china.
Tincin Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras
celulares se diferencian en funcin de los
diferentes colorantes que fijan de acuerdo
con su propia constitucin qumica.
Los ejemplos clsicos sera la tincin de
GRAM o la de Ziehl-Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una
tincin GRAM

Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana

Ya hemos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas
bsicas para la deficinin "taxonmica" de las bacterias: el

color que adquieren tras la tincin y la forma que

presentan las clulas bacterianas.
En lo relativo a la coloracin, ya hemos explicado
anteriormente que hablamos de microorganismos Grampositivos cuando aparecen teidos de color azul-violeta y
de Gram negativos cuando se visualizan de color rojorosado.
Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa
bacteriana en una tincin GRAM:
Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin
celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss,
tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos,
aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao.

Bacilos
grandes
variaciones
morfolgicas:
estreptobacilos, cocobacilos

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

fusiformes,

 Tinciones especficas
Se utilizan para incrementar el contraste en las clulas
microbianas y revelan estructuras particulares, entre las
que se incluyen en los flagelos y las cpsulas.
Tincin adecuada
En su forma ms simple, el verdadero proceso de tincin
puede implicar la inmersin de la muestra en la solucin
colorante, seguido del aclarado que es un lavado para
eliminar el exceso de colorante y la observacin. Muchos
tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente.
Cuando la solucin de colorante en exceso se elimina
durante el aclarado, la tincin mordentada permanece.

Tincin negativa
Un mtodo sencillo de tincin para bacterias, que adems
es un claro caso de cromofobia y que por lo tanto funciona
aun cuando los mtodos de tincin positiva fallan, es
la tincin
negativa.
Esto
puede
ser
conseguido
simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y
aplicando
directamente
sobre
ella
una
gota
de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra
humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los
microorganismos pueden ser observados fcilmente por
medio de microscopa en campo claro como inclusiones
claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que
las rodea

Tincin indirecta:
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso
de un mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico.

Tincin directa:
Hablamos de tincin directa
interacciona directamente con
tratamiento previo.

cuando el colorante
el sustrato, sin otro

Una tincin cido-alcohol resistente se realiza segn los

siguientes pasos:

1. Tincin primaria con fucsina bsica, que tie todas las

clulas de rojo.
2. Calentamiento suave de la preparacin para facilitar la
penetracin del colorante en el interior de la clula.
3. Decoloracin con una solucin de cido clorhdrico en
etanol. Este decolorante elimina la fucsina de todas las
clulas excepto de las micro bacterias, que la retienen
debido a su superficie crea.
4. Coloracin de contraste con azul de metileno. Se tien
de azul todas las clulas previamente decoloradas, lo que
facilita
la
diferenciacin
entre
las
clulas
de
Mycobacterum, an teidas de rojo, v las clulas restantes
del espcimen.

Tincin: RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las
micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos
auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las
bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja
brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de
potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia
inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol
resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se
tien con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodaminaauramiria es que luego los frotis pueden ser reteidos con
la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente
sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el
aceite de inmersin. De esta forma, los resultados
positivos pueden ser confirmados con las coloraciones
tradicionales, que adems permiten la diferenciacin
morfolgica.

Tincin: NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico
ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas
preparaciones de naranja de acridina, el color de la

fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la

concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado
como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el
microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos
modos, como el colorante se intercala en el cido
nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo
despus de la tincin.

Colorantes
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos
que tienen alguna afinidad especfica por los materiales
celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
molculas cargadas positivamente (cationes) y se
combinan con intensidad con los constituyentes celulares
cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos
y los polisacridos cidos.

Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teir

clulas animales, para hacer ms visibles sus ncleos. Es
tambin utilizado para teir los extendidos de sangre para
ser utilizados en citologa y como colorante vital en el
recuento de reticulocitos.
Azul Nilo: Tie los ncleos de color azul. Tambin puede ser
utilizado para teir clulas vivas.
Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un
mordiente adecuado, tie las paredes celulares de color
prpura. El cristal violeta es un componente importante en
la coloracin de Gram.
Eosina: La eosina se utiliza ms frecuentemente como
contra coloracin de la hematoxilina, impartiendo un color
que
va
del
rosado
al
rojo
al
material citoplasmtico, membrana celular, y algunas
estructuras extracelulares. Adems imparte un fuerte
color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada
tambin en algunas variantes de la coloracin de Gram, y
en muchos otros protocolos de tincin.
Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los
ncleos celulares de rojo, y se utiliza principalmente como
contracoloracin. Tambin puede ser utilizada para darle
una coloracin amarilla al colgeno.

Verde
de
metilo;
El verde
de
metilo se
utiliza
frecuentemente en microscopia de campo claro, para teir
la cromatina de las clulas y facilitar as su visualizacin.

Tinciones supra vitales

Las tinciones supravitales, son aquellas que se realizan
sobre las clulas o tejidos vivos. Pero que estn aislado
del organismo del que pertenecen