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INGENIERA
Facultad de Ingeniera Ambiental
LABORATORIO N1
Tema:
Distribucin Universal de lo
Microorganismos
Curso:
Microbiologa Sanitaria I
Profesor Jorge Gilberto Tello Cebreros
:
Alumno:
Salinas Soto, Pedro
2015 - I
I.
II.
OBJETIVOS:
Aprender a utilizar los equipos y materiales en el laboratorio de
microbiologa, necesarios para la preparacin de medios de cultivo
y conteo de Reconocer la presencia de microorganismos patgenos en el agua.
Utilizar mtodos bacteriolgicos para comprobar la potabilidad del agua de
distintos lugares de la UNI, por medio de placas con medio agar
Conocer los factores que influyen en el crecimiento de microorganismos en el
agua, para su respectivo tratamiento.
Realizar un recuento de bacterias heterotrficas mediante la unidad formadora de
colonias(U.F.C)
Determinacin del nmero ms probable de bacterias coliformes en agua potable.
Analizar la relacin entre concentracin de la muestra de agua usada y la cantidad
de colonias que crecen en el medio.
Presenciar la reduccin de microorganismos conforme se reduce la concentracin
en el tratamiento usado.
FUNDAMENTO TERICO:
HUMEDAD
Los microorganismos requieren unas condiciones mnimas de humedad para su
crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como medio de
transporte a travs del cual los compuestos orgnicos y nutrientes son movilizados
hasta el interior de las clulas. Un exceso de humedad inhibir el crecimiento
bacteriano al reducir la concentracin de oxgeno en el suelo. El rango vara en funcin
de la tcnica
Actividad de Agua
El agua es el solvente en donde ocurren las reacciones qumicas y enzimticas de la
clula y es indispensable para el desarrollo de los microorganismos.
La actividad de agua (aW) del medio representa la fraccin molar de las molculas de
agua totales que estn disponibles, y es igual a relacin que existe entre la presin de
vapor de la solucin respecto a la del agua pura (p/po). El valor mnimo de a W en el
cual las bacterias pueden crecer vara ampliamente, pero el valor ptimo para muchas
especies es mayor a 0.99. Algunas bacterias halfilas (bacterias que se desarrollan en
altas concentraciones de sal) crecen mejor con aW = 0.80.
Variaciones en la actividad de agua puede afectar la tasa de crecimiento, la
composicin celular y la actividad metablica de la bacteria, debido a que si no
disponen de suficiente cantidad de agua libre (no asociada a solutos, etc) en el medio
necesitaran realizar ms trabajo para obtenerla y disminuir el rendimiento del
crecimiento.
MTODOS DE AISLAMIENTO
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de
los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El
crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a
partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las
condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista
y formada por individuos iguales (un clon bacteriano).
Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales
son cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades
intrnsecas en el cultivo (microorganismos parsitos de otros), al desconocimiento de
los requerimientos especficos de cultivo, y a la existencia de grupos de
microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de
sintrofa por ejemplo).
Se estima que en slo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las
bacterias marinas son cultivables.
Existen procedimientos de enriquecimiento del nmero de bacterias de ambientes
naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradski que
crea un microcosmos para enriquecer el nmero de ciertos tipos de microorganismos
presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento.
III.
PROCEDIMIENTO:
Procedimiento A (grupos 1 y 3)
1. Tomamos 4 tubos de agar nutritivo fundido y esterilizado a 45C, flameamos la parte
superior de los tubos.
2. Tomar 3 placas Petri ya habindolas esterilizado y una placa sin esterilizar, a
continuacin numerarlas del 1 al 4 respectivamente. Vertimos el agar nutritivo en las
placas.
PLACA N1
Exponer el agar nutritivo al ambiente del laboratorio duran te 15 minutos para que
solidifique.
PLACA N2
Dividimos la placa en 4 zonas (A, B, C, D)
Zona A: Cabello
Zona B: Huella digital
Zona C: Inoculador estril
Zona D: Inoculador no estril
PLACA N3
No abrir la placa Petri
PLACA N4
No abrir la placa Petri
3. Despus de realizar todo lo anterior, las placas se invierten y se dejan reposar por
48 horas, para verificar la formacin de microorganismos y se colocan a la
refirgeradora.
Procedimiento B (grupos 2 y 4 y 5)
1. Usamos una pipeta estril para transferir el caldo nutritivo esterilizado del tubo a un
tuvo estril y vaco.
2. Usamos una pipeta no estril para transferir el caldo nutritivo esterilizado del tubo a
un tubo estril y vaco.
3. Usamos una pipeta estril para transferir el caldo nutritivo esterilizado del tubo a un
tubo no estril y vaco.
4. Colocar los tubos en la incubadora por 48 horas.
IV.
RESULTADOS:
(Grupo 1)
PROCEDIMIENTO A: colonias de bacterias desarrolladas en agar nutritivo
Grupo
Placa N1 estril
Ambiente:
Laboratorio de
Placa N2 estril
Sector
A: Pelo
Sector B:
Huella
Sector C:
Inoculador
Sector D:
Inoculador no
Placa
N3
estril
No
abrir
Placa N4 no
estril
No abrir
N de Colonias (X)
Tamao
Margen
Microbiologa
6
X1= 10mm
X2= 3mm
X3= 2mm
X4= 1.5mm
X5= 5mm
X6= 1.5mm
X1= Rizoide
X2= Liso
X3= Liso
X4= Liso
X5= Rizoide
X6= Liso
X1= Convexa
con botn
Elevacin
Cromognesis
Caracteres
pticos
X2= Plana
X3= Plana
X4= Plana
X5= Convexa
X6= Plana
X1= Crema
X2= Crema
X3= Crema
X4= Crema
X5= Crema
X6= Crema
X1=Translcido
X2= Opaco
X3= Opaco
X4= Opaco
X5= Translcido
X6= Translcido
3
X1=
2.5cm
X2=
1mm
estril
0
estril
15
X3=
1mm
X1= Liso
X1=
X2= Liso
Filamentoso
X3= Liso
X1=
Plana
X2=
Plana
X3=
Plana
X1= Plana
X1=
Crema
X2=
Crema
X3=
Crema
X1= Crema
X1=
Opaco
X2=
Opaco
X1= Opaco
X3=
Opaco
Grupo3
PLACA 1 AMBIENTE: FOTOCOPIADORA 13 COLONIAS
IC
X1:2mm
MARGEN:
X2:2mm
SOLO X5: ONDULANTE LOS DEMAS
X3:6,5mm
LISOS
IIC
X4:3mm
ELEVACION:
X5: CONVEXA EL RESTO
X5:10mm
PLANOS
X6:1mm
CARACTERISTIAS OPTICAS:
IIIC
X7:2mm
OPACAS
X8:3mm
PIGMENTACION:
IVC
X9:1,5mm
X10:1,5mm
X11:2mm
X12:1mm
X13:3,5mm
CREMA
FACTORES:
HUMEDAD, SUSPENSION DE
PARTICULAS,
# DE PERSONAS, RADIACION,
FLUJO DE AIRE,
OBSERVACIONE
S:
X5: LINEA AMARILLA INTERNA
RISOIDE
HUMEDAD RECOMENDADA 50 O
MENOR
PLACA 4
PLACA 2
B: DEDO
X1:
1,5mm
X2: 2
mm
MUCHAS COLONIAS
AGRUPADAS >100
TAMAO PROMEDIO:
2mm
A: CABELLO
C
D
NO HAY COLONIAS
NO HAY COLONIAS
NO HAY COLONIAS
PLACA NO ESTERIL
MARGEN:
ELEVACION: PLANO
MARGEN:
CARACT.
LAS MAS PEQUEAS ONDULADAS, LAS
OPTICAS:
OPACAS
MAS GRANDES LISAS
PIGMENTACI
ELEVACION:
ON:
CREMAS
TODAS PLANAS
CARACTERISTICAS OPTICAS:
TRANSLUCIDAS
PIGMENTACION:
CREMA
PLACA 3
PLACA
ESTERIL
LISO
NO SE ENCONTRO
NADA
TUBO #1
TUBO
ESTERIL/PIPETA
ESTERIL
TUBO #2
TUBO
ESTERIL/PIPETA
NO ESTRIL
TUBO #3
TUBO NO
ESTRIL/PIPETA
ESTRIL
CANTIDAD DE
CRECIMIENTO
NO HAY
CRECIMIENTO
ESCASO
DISTRIBUCION
DE
CRECIMIENTO
NO HAY
DISTRIBUCIN
ACUMULADO EN
EL FONDO COMO
SEDIMENTO
NO HAY
OLOR
AROMTICO
TUBO #1
TUBO
ESTERIL/PIPETA
ESTERIL
TUBO #2
TUBO
ESTERIL/PIPETA
NO ESTRIL
TUBO #3
TUBO NO
ESTRIL/PIPETA
ESTRIL
NO HAY
CRECIMIENTO
ESCASO
GRUPO N02
OLOR
Grupo4:
GRUPO N04
CANTIDAD DE
CRECIMIENTO
DISTRIBUCION
DE
CRECIMIENTO
NO HAY
DISTRIBUCIN
ACUMULADO EN
EL FONDO COMO
SEDIMENTO
NO HAY
OLOR
AROMTICO
TUBO #1
TUBO
ESTERIL/PIPETA
ESTERIL
TUBO #2
TUBO
ESTERIL/PIPETA
NO ESTRIL
TUBO #3
TUBO NO
ESTRIL/PIPETA
ESTRIL
OLOR
Grupo 5:
GRUPO N05
CANTIDAD DE
CRECIMIENTO
DISTRIBUCION
DE
CRECIMIENTO
OLOR
V.
DISCUSIN:
VI.
CONCLUSIONES:
VII.
RECOMENDACIONES:
No agitar los tubos de ensayo al momento de observar los resultados, pues ya
no se distingue adecuadamente la distribucin del crecimiento (anillo o
sedimento).
Verificar que absolutamente todos los materiales se encuentren en el estado
ptimo para llevar a cabo los experimentos.
Procurar tener selladas las placas Petri, para evitar el ingreso de
microorganismos.
Hacer un control riguroso de los tiempos requeridos en los experimento para
evitar complicaciones posteriores.
Realizar bien la medicin del peso de los medios de cultivo, as como del
volumen de agua destilada, para llevar a cabo los experimentos de manera
exitosa.
VIII. CUESTIONARIO:
1. Qu factores influyen en la flora microbiana del aire?
El aire no es un medio apto para la multiplicacin bacteriana, ya que carece de
los nutrientes necesarios para ella, pero si se puede albergar como flora
transente, microbios que estn asociados a gotas de agua, polvo u otra
materia particulada. Dichos microorganismos son en general bacterias de bajos
poderes patgenos y generalmente pigmentados, Ya que estos metabolismos
secundarios los protegen de las radiaciones de luz ultravioleta y del ozono
presente en nuestra atmsfera.
El aire puede considerarse como un vector de microorganismos ya que su
movimiento puede arrastra grmenes de un lugar a otro, los vientos pueden
levantar flora de tierras y desiertos en los fenmenos de evaporacin
transportar gotitas de agua con microorganismos. Por ende como ya se dijo si
bien alberga bacterias de poca patogenicidad, en algunos momentos puede
transportar patgenos con el consecuente peligro para los humanos.
Artculos personales, como pauelos o vasos para beber, que han sido usados
3.- Periodo de estado, convulsivo o asfctico: dura unas 4-6 semanas. La tos se
vuelve paroxstica o convulsiva en accesos o quintas: el enfermo, encontrndose
bien, nota que va a tener un acceso, realiza una inspiracin profunda y comienza con
una tos a golpes, ininterrumpida, atropellada, que dificulta la respiracin por lo que el
nio estira la cara y el pecho hacia delante, saca la lengua, se va poniendo colorado,
ciantico y con ojos llorosos y tiene una gran sensacin de angustia. Al terminar la
crisis aparece una inspiracin ruidosa (al pasar el aire por una faringe muy estrecha)
que es lo que se llama gallo de la tos ferina. La tos va cediendo, al final de acceso se
expulsa un esputo mucoso blanquecino y con mucha frecuencia vmitos. El enfermo
est agotado. El nmero de quintas diarias y su intensidad vara dependiendo de la
agresividad del germen, as como del carcter del paciente (ms frecuente en
nerviosos e irritables). Tras unos das la cara est abotargada, edematosa, con los
prpados hinchados: facies tosferinosa. Debido a las quintas de tos pueden
aparecer: pequeas hemorragias subconjuntivales, petequias en cara, epistaxis,
prdida de conciencia (si la apnea o falta de respiracin es prolongada, ulceracin en
el frenillo de la lengua (al golpearse con los dientes), incontinencia de orina, prolapso
rectal... No hay fiebre.
4.- Periodo de convalecencia o remisin: dura entre 1-3 semanas. Las quintas
se van haciendo menos frecuentes hasta desaparecer. Pueden aparecer nuevas crisis
de tos convulsiva despus de varios meses de superada la enfermedad, ante la
presencia de un catarro banal.
Aunque esta es la forma de presentarse normalmente podemos encontrar variaciones
o distintas formas clnicas.
Del recin nacido y lactante: ms breve. No existe gallo, con frecuentes crisis
de apnea (que pueden ser graves) y frecuentes complicaciones respiratorias y
neurolgicas.
Una persona infectada propaga organismos de tos ferina al aire a travs de las gotas
de humedad que expulsa al toser. Cualquiera que se encuentre cerca puede inhalarlas
e infectarse.
La meningitis afecta a dos de cada 10.000 recin nacidos a trmino y con peso normal
y a dos de cada 1.000 recin nacidos con bajo peso. Hay ms afecciones entre los
nios que entre las nias, y en la mayora de los casos, la meningitis de un recin
nacido es una complicacin de la sepsis (infeccin de la sangre que se extiende hasta
el cerebro).
La meningitis infecciosa puede estar provocada, bien por virus, bien por bacterias La
infeccin por virus es la ms comn. Aunque requiere tratamiento hospitalario, suele
ser benignas. En ocasiones aparecen como consecuencia de otras infecciones vricas,
como las paperas. Cuando es una bacteria el agente causante hablamos de una
patologa ms grave. En ocasiones pueden provocar la muerte.
SINTOMAS: Una vez contagiada, una persona puede padecer los primeros sntomas
entre los dos y los diez das posteriores al contagio. En ocasiones tiene un comienzo
brusco, en otros los sntomas son similares a los de un catarro o una gripe. Los ms
frecuentes y que anuncian una gravedad son:
Fiebre alta
Rigidez de nuca
Vmitos bruscos
Somnolencia
Prdida de conciencia
PREVENCION:
Existen vacunas para los meningococos tipo A y C. Actualmente se est extendiendo
por toda Espaa la vacunacin obligatoria el tipo C. Cada vacuna es especfica.
Vacuna tipo C: Estimula la formacin de defensas contra el germen. La proteccin se
produce a las dos semanas de la vacunacin. Para nios mayores de un ao basta
con una dosis, pero para los nios de entre 7 y 12 meses son necesarias dos dosis, y
para los de entre 0 y 6 meses, tres. La vacunacin se realiza a los menores de 6 aos.
Provoca efectos secundarios leves, como inflamacin y molestias en el lugar de la
inyeccin, fiebre baja e irritabilidad. Est contraindicada cuando existen estados
febriles en el momento de la vacunacin; si el nio es hipersensible a alguno de los
componentes de la vacuna, o en personas inmunodeprimidas.
3. Qu
grupos
de agentes causa la mayor incidencia de enfermedades respiratorias?
Gran nmero de infecciones humanas y animales se transmiten por el aire y
causan enfermedades en el aparato respiratorio principalmente.
Se caracterizan por su tendencia a causar epidemias, siendo ms frecuentes
durante el otoo y el invierno, cuando las personas se renen en sitios
cerrados.
La transmisin area de enfermedades no es nicamente de microorganismos
que salen de las vas respiratorias. En algunos casos se forman bioaerosoles
procedentes de animales y sus productos que se suspenden en el aire y
pueden ser inhaladas
A continuacin se presenta un cuadro en el cual se clasifica y posteriormente
se cuantifica los agentes causantes de enfermedades resspiratorias
de
Rhizopus
Nigrican,
alternara
ALTERNARIA
El gnero Alternara contiene especies cosmopolitas que se encuentran en un amplio
rango de materiales y productos. Como saprobias pueden deteriorar alimentos y
forrajes, produciendo compuestos biolgicamente activos tal como micotoxinas. Como
patgenas reducen el rendimiento de las cosechas o afectan a los vegetales
almacenados. Es necesaria una identificacin precisa de las especies porque cada
nombre entraa un conjunto de caractersticas (preferencias para el crecimiento,
patogenicidad, produccin de metabolitos secundarios) que permiten predecir el
comportamiento del hongo (Andersen et al. 2001).
CULTIVOS
Las caractersticas del crecimiento
constituyen uno de los criterios
para
la
clasificacin.
En
CzapekLevadura A. alternata y A.
infectoria producen colonias de
tamao similar (56 - 63 mm de
dimetro en 1 semana a 27C),
chatas y ligeramente algodonosas.
El micelio areo es gris verdoso
con reverso negro parduzco.
Muchas cepas de A. infectoria
forman escasos conidios, tienen
un micelio algodonoso y el reverso
de la colonia es obscuro en el
centro rodeado de un anillo
anaranjado
plido
(Andrews
1992).
En Malta-Glucosa. alternata forma
colonias algodonosas, elevadas,
con micelio gris verdoso y esporos negro parduzco. A. infectoria tiene colonias pardas
aceituna a negro parduzco, chatas y algodonosas, a veces con fasciculos y
esporulacin moderada mostrando el micelio gris y con frecuencia un pigmento soluble
verde amarillento. Otras especies casi no presentan esporulacin sobre este medio
(Andrews 1992).
En Czapek-Glicerol (cap. 3) A. alternata y A. infectoria producen colonias
indistinguibles, de color pardo grisceo a pardo oliva, 7 - 12 mm de dimetro en 1
semana a 27C, con micelio poco denso. En Malta-Diclorn, las colonias tienen un
dimetro de 40 - 45 mm en iguales condiciones. A. alternata muestra un color negro
verdoso en anillos concntricos, la colonia aterciopelada tiene largas cadenas no
ramificadas de conidios lisos. A. infectoria tiene colonias fasciculadas, de color gris
verdoso, con cadenas siempre ramificadas de conidios rugosos y con frecuencia
forman estructuras teleomrficas inmaduras
MORFOLOGA E IDENTIFICACIN
Los conidios de Alternaria tienen septos transversales y longitudinales y se los conoce
como dictiosporas, adems son pardos y picudos. Nacen por la brotacin apical de
una clula conidigena o de la espora anterior, dando lugar en este ltimo caso a una
cadena que suele ramificarse si una espora produce ms de un brote. La especie A.
infectoria tiene un estado perfecto que pertenece al gnero Pleospora. ste forma
pseudotecios sobre el tallo de cereales o hierbas con ascas bitunicadas cilndricas en
los lculos del estroma, dentro de las cuales hay 8 ascosporas provistas de septos
transversales y longitudinales .
Es comn observar en los hongos una plasticidad morfolgica. Cuando las especies
de Alternaria crecen en medios ricos y en la obscuridad bajo condiciones ambientales
no controladas, se forma un exceso de micelio areo que afecta al desarrollo
tridimensional de la esporulacin. Al hacer las preparaciones hmedas se destruyen
las estructuras y tambin se debe decir que presentan cadenas largas.
RHIZOPUS NIGRICANS
SACHAROMYCE SEREVISAE
5. Cules son los ingredientes del caldo nutritivo, agar nutritivo y agar
sabouraud?
Agar Nutritivo
A principios de 1900 la APHA (American Public Health Association) sugiri esta
formulacin como un medio de cultivo estndar para el anlisis de agua. El Agar Nutritivo
se encuentra descrito en los Mtodos
Estndar de la APHA y de la AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists) para el
anlisis de agua, leche y sus derivados, alimentos y otros materiales.
El Agar Nutritivo sigue siendo un medio ampliamente utilizado para el cultivo de
microorganismos no fastidiosos.
En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrgeno, vitaminas
y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante.
Agar Nutritivo
Extracto de carne
Peptona
Agar
Agua
Cantidad
3g
5g
15g
1000ml
1. Caldo Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el desarrollo de
microorganismos con escasos requerimientos nutricionales.
Su uso est descripto en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y
otros materiales de importancia sanitaria.
Caldo Nutritivo
Cantidad
Extracto de carne
3g
Peptona
5g
Agua
1000ml
2. Agar Sabouraud
Es un medio para el cultivo de hongos y levaduras. El Agar Sabouraud es una
modificacin del Agar de Dextrosa. Este medio es usado para el cultivo de hongo
patgenos, particularmente de aquellos asociados con infecciones de la piel. La alta
concentracin de dextrosa y la acidez del pH hacen a ste un medio selectivo para
hongos. Con la adicin de cicloheximida, estreptomicina y penicilina, se obtiene un
Agar
Cantidad
excelente medio para el
aislamiento primario
Sabouraud
de dermatofitos.
Pluripeptona
10g/l
Cloranfenicol
Glucosa
0.05g/l
40g/l
Agar
15g/l
IX.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:
TEXTOS:
-Biologa de los microorganismos Brock
-Roger y Stanier. El mundo de los microbios. Aguilar, Madrid 1965
-Pelczar, Michael J. Microbiologa, Mxico, McGraw-Hill, 1982
PAGINAS WEB:
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http://www.unavarra.es/genmic/micind-0.htm
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www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/09- factores
%20de%20supervivencia.htm
OUTSIDE MICROBIOLOGA REQUERIMIENTOS QUMICOS
http://www.microbiologa.com.ar/fisiologa.php?Mostrar=qumicos
http://www.biologia.edu.ar/microind/crecimiento%20bacteriano.htm
http://facultad.bayamon.inter.edu/yserrano/crecimiento%20microbiano.htm
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.-%20Cultivo%20de
%20microorganismos.pdf
http://www.slideshare.net/grupofarmacoudea/flora-normal-1772185
http://proquimessa.com/Portals/0/CalidaddeAirePDF2_Microbiologiadelaire.pdf
http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/NT
P/Ficheros/786a820/802%20web.pdf
X.
ANEXOS E IMGENES: