COLORACIN

T.M. LILIANA DIONISIO LEONARDO

San Roman-Puno -2013

Histologa - 2013

COLORACIN
POR QU ES NECESARIO COLOREAR
UN CORTE HISTOLGICO?
PREPARADOS FRESCOS U
OBTENIDOS POST MORTEM

(M.O)

Se unen selectivamente a
ciertas estructuras,
colorandolas.
Ej. Orcena
Carmn de Best

Fibras elsticas
Glucgeno

Se diferencian slo los elementos

que poseen distinto ndice de
refraccin (ir). Aquellos
componentes con un ir. semejante
aparecern iguales al observador,
por lo tanto sern confundidos en
uno solo.
Determinados detalles
estructurales se hacen visibles

El estudio del preparado se

realiza mediante el anlisis
cromtico

Cuando una sustancia es incolora (no tiene absorcin en el espectro

visible), agregando algunos grupos no saturados (con doble ligadura)
denominados CROMFOROS se pueden desplazar esas bandas hacia el
espectro visible, entonces la sustancia presenta color.
C

carbonilo

N O
nitroso

azoico

RESUMIENDO: Sustancia incolora + Cromforos = CROMGENO

No implica que la sustancia ya sea un colorante
CROMGENO + AUXOCRMO = COLORANTE
AUXOCRMOS: son radicales qumicos que aumentan el color y
adquieren la capacidad de colorear. Estos hacen que el cromgeno se
ionice.
Grupos aminos, hidroxilos, halgenos.

 CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES SEGN SU CARGA

1. BSICO
Posee un grupo catinico (R+=cromgeno) que se une a grupos cidos
de los tejidos: SO4= (sulfato); PO4= (fosfato).
Azul de metileno
Hematoxilina
Fucsina bsica
Azul de toluidina

2. CIDO
Posee un grupo aninico (R-) que se une a grupos bsicos de los tejidos:
NH3+ (grupo amino protonado).
Eosina (Eosianato de Na)
Na+

Orange G
Azul de anilina

Na+

3. NEUTROS mezcla de un colorante cido con uno bsico.

Eosianato de azul de metileno (May Grnwald)

Teniendo en cuenta la afinidad de un colorante por determinados grupos

qumicos presentes en el tejido diremos que:
COMPONENTES TISULARES BASFILOS
COLORANTE BSICO

Formar uniones con componentes tisulares

cargados (-) por ej. grupos cidos

Heterocromatina y nuclolos (grupos fosfato ionizados de los cidos

nucleicos).
RER (grupo fosfato ionizados del ARN).
Matriz extracelular del cartlago ( hidratos de carbono con grupos
sulfatos.
COMPONENTES TISULARES ACIDFILOS
COLORANTE CIDO
Carga (-) aninica

Formar uniones con componentes tisulares

cargados (+) por ej. grupos bsicos

Filamentos citoplasmticos (Ej. Actina, miosina).

Componentes membranosos intracelulares.
Citoplasma en general.
Fibras extracelulares (grupos aminos ionizados).

La intensidad de la coloracin
depender del grado de acidez
o alcalinidad del medio.
COLORANTE CIDO
Carga (-) aninica
Ej. Eosina (carga -)

+
COLORANTE BSICO
carga (+) catinico
Ej. Azul Alcian (carga +)

CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES

VEGETALES
NATURALES

Hematoxilina
Orcena

ANIMALES
Carmn

POR SU ORIGEN

ARTIFICIALES

Derivados de la
destilacin de la hulla
Colorantes de anilina

MECANISMOS DE COLORACIN
POR QU SE COLOREA?
FSICOS:
a) Por disolucin del colorante en distintas sustancias o
componentes tisulares. Ej. Sudan III se disuelve en lpidos.

b) Por impregnacin metlica: precipitacin de sales metlicas

sobre estructuras con diferente densidad. Ej. Sales de Ag (Tcnica de Ro
Hortega), Hg (Tcnica de Ramn Moliner).

 QUMICA:
Deteccin de una sustancia determinada a travs de una
unin qumica especfica.
Ej: Tcnicas histoqumicas
Reaccin del cido peridico-reactivo de Schiff (PAS)
Reaccin del azul alcian (AB) (deteccin de glicoconjugados)
Tcnica con Carmn de Best (deteccin de glucgeno).

FSICOQUMICA (la mayora)

El colorante se une a la sustancia coloreable especfica
combinndose ntimamente con ella debido a la presencia de
agrupaciones moleculares bsicas y cidas en los tejidos que se unirn
con los grupos cidos y bsicos de los colorantes.

GLOSARIO aplicable a coloraciones y/o colorantes

SIMPLE: se utiliza un solo colorante y por ende se colorea solamente
algunos elementos del preparado. Ej: azul de metileno
COMBINADA: se utilizan dos o ms colorantes, se recurre al empleo
de colorantes bsicos y cidos. Ej: Hematoxilina-eosina
Sucesiva: Tricrmico de Masson; H&E.
Simultnea: Tricrmico de Mallory (azul de anilina-orange G)

Hematoxilina-Eosina

Tricrmico de Masson
modificado

Tricrmico de Mallory

 PROGRESIVA: se deja actuar al colorante hasta obtener una

coloracin ptima. Ej: Orcena, para fibras elsticas (Tcnica de Frnkel).

REGRESIVA: se realiza primero una sobrecoloracin y luego se elimina

el exceso del colorante por medio de diferenciadores. Este proceso se
denomina diferenciacin. Ej: Coloracin de Mallory-Heidenhain (AZAN): el
azocarmn (colorante cido) tie tantos ncleos como citoplasma.
Diferenciador: 0.1% de aceite de anilina en ROH 96.

 DIRECTA: existe una verdadera afinidad entre la sustancia a colorear y

el colorante. Ej: Eosina
En un tiempo: Ej. Hematoxilina de Carazzi
Hematoxilina al oxidarse con la luz o
una sustancia oxidante
INDIRECTA: requiere la
intervencin de
intermediarios o mordientes
para que la coloracin tenga
lugar.

Hematena + Alumbre de K o Fe
(mordiente)

LACA O HEMALUMBRE

En dos tiempos: Ej: Hematoxilina de Regaud

1 acta el mordiente directamente en el tejido y
luego el colorante. La laca se forma en el tejido.

 PANPTICA: es una coloracin combinada realizada sucesivamente

por colorantes neutros. Ej. Coloracin de May Grnwald-Giensa

PANCRMICA: en un solo colorante actan todos los colorantes

neutros que se necesitan.
Ej. Coloracin de Pappenheim
Se mezcla en una solucin colorante:
cido fnico, verde de metilo y pironina en
agua destilada.

 ORTOCROMTICA: el tejido toma el mismo color que el colorante.

Ej. la fucsina, hematoxilina.
METACROMTICA: un componente celular o una sustancia se tie de
un color diferente al del colorante. Ej. azul de metileno, azul de toluidina
Componentes tisulares inducen a que
el colorante se polimerice y modifique
su color. Se da con colorantes bsicos

TCNICAS DE COLORACIN

Coloraciones pueden ser:

GENERALES O TOPOGRFICAS
H&E
Tricrmico de Masson
AZAN
ESPECIALES
Frnkel
Sudan III
Klver-Barrera
Impregnaciones argnticas

 HISTOQUMICAS
APS
Azul Alcian

INMUNOHISTOQUMICAS

PROTOCOLO GENERAL DE COLORACIN PARA CORTES EN PARAFINA

Desparafinar: coplin con xilol (5 min).
Hidratacin (hasta el diluyente del colorante)
ROH 96: 1 min.
COLODIONAR
ROH 70: 1 min.
ROH 50: 1 min.
AGUA DESTILADA: 1 min.
Coloracin propiamente dicha
VER PROTOCOLOS

COLORACIN

Deshidratacin
ROH 96: un pasaje
Secar con papel de filtro o estufa.
Aclaracin
Coplin con xilol (ATENCIN!!!)
Montado
Utilizacin de un medio qumicamente
anhidro.

ACLARACIN

Coloraciones topogrficas en cortes en parafina

Hematoxilina-Eosina

Tricrmico de Masson modificado

PROTOCOLO GENERAL DE COLORACIN PARA CORTES EN RESINA

Hidratacin
AGUA DESTILADA: 10 min
Coloracin propiamente dicha
HEMATOXILINA DE CARAZZI 30 min
Viraje en H2O corriente
Lavado en H2O destilada
EOSINA ALCOHOLICA IODADA 3 a 5 min.
Controlar bajo microscopio.
Lavar con H2O destilada
Deshidratacin
ROH 90: un pasaje
ROH 100 un pasaje
Dejar secar bajo campana
Montaje
Utilizacin de un medio qumicamente
anhidro.

Resina vs. Parafina

Ventajas
La inclusin y preparacin del taco, lleva menos pasos y los
tiempos son reducidos.
Las estructuras celulares se observan con mayor definicin.
No interviene el efecto de la temperatura.
No se utiliza xilol.
Desventajas
La inclusin y preparacin del taco, deben hacerse el mismo da, no
se pueden generar pausas en el proceso.
Precisin en la preparacin de las soluciones de trabajo.
El tiempo de montaje del corte sobre el portaobjeto puede ser
mayor.
Es mas difcil lograr cortes seriados.
Costos elevados. Txico.

Hematoxilina -Eosina

Agradecimiento a Dra. J. Gimenez

Hematoxilina -Eosina

Agradecimiento a Dra. J. Gimenez

Tricrmico de Masson modificado

Agradecimiento a Lic. M. Ojeda

Hematoxilina -Eosina

Agradecimiento

a Lic. M. Ojeda

Development of the Follicle Complex and Oocyte taging in Red Drum, Sciaenops ocellatus Linnaeus,
1776 (Perciformes, Sciaenidae).
Dr. Harry J. Grier
JOURNAL OF MORPHOLOGY 273:801829 (2012)

PROTOCOLO DE COLORACIN PARA CORTES SEMIFINOS (MET)

Secciones semlfnas

0.5

Cortes de 1 m de
espesor previo a la
obtencin de cortes
ultrafinos.

Varilla de vidrio

2 prn

con punta redondeada

Cuchilla

Recogida de cortes

de

vidrio

Gota de
Portaobjetos

Desecacin del gua

agua

' t .---------,'

estiramient/de los ortes ~

Portaobjetoscon cortes
........
estirados tras
evaporarse el gua
a

ul i.na....,.

AGUA

Azul de tol

DESTlLA
POR

.......

----.

DA

TNClN

CALOR

iacin __..
Diferenc

AGUA
DESTILADA

Corte listo para eesarvar

PROTOCOLO DE CONTRASTE
PARA CORTES SEMIFINOS
(MET)

.FALTA TERMINAR