Universidad de Puerto Rico en Humacao

Departamento de Qumica
Bioqumica (QUIM-4055-001)
Cesar Giovanni Soto Diaz (842-11-9010)
Anlisis de

Biochemical Characterization of a Polysialyltransferase from

las Cuatro

Mannheimiahaemolytica A2 and Comparison to Other Bacterial Polysialyltransferases

Figuras

Theresa Lindhout1,2, Cynthia R. Bainbridge2, Will J. Costain2, Michel Gilbert2, Warren W. Wakarchuk1,3*

Figura 1.

1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada, 2Human Health Therapeutics, National
Research Council Canada, Ottawa, Ontario, Canada, 3Department of Chemistry and Biology, Ryerson University, Toronto, Ontario, Canada

Expresin y
solubilidad
de PSTMh constructos.

Las construcciones PST se expresaron en E. coli seguido de disrupcin celular y centrifugacin.

La soluble y las fracciones insolubles se analizaron por SDS-PAGE y tincin con azul de
Coomassie. Las bandas correspondientes a los tamaos de las variantes de la protena fueron
observadas (indicados con un asterisco). El aumento de la intensidad de las bandas, indicado el
aumento de expresin en comparacin con la protena no de fusin. Por otra parte, la protena
truncada demostr la mejor variante.

Figura 2. pH ptimos de PSTNm, PSTEC, y PSTMh.

Las actividades especficas de las tres PSTs
bacterianas se compararon a diferentes pH de
reaccin.

Las

purificacin

enzimas

separadas,

de

tres

lotes

se

analizaron

de
por

duplicado (n = 6). Todas las enzimas demostraron

actividad en toda la gama de valores de pH
ensayados. PSTMh demostr un pH ptimo de
reaccin de 7.0. PSTNm y PSTEC demostraron
una actividad ptima a pH ligeramente ms alto.

Figura 5. Anlisis SDS - PAGE de las reacciones PST en DISA fetuina.

A. Las tres PSTs se incubaron usando

condiciones de reaccin estndar (carriles
denotan ''A''), as como una condicin de
reaccin para mejorar la formacin del
producto durante 1 o 2 horas. Una reaccin de
control negativo (que no contiene enzima) se
incluy. La pequea banda a, 75 kDa indica la
PST aadi a la reaccin. B. Despus del
anlisis, las protenas se transfirieron a una
membrana y se sondaron con anticuerpos a
PSA. Todas las reacciones fueron positivas
para PSA, excepto el carril de control negativo
que contiene no modificada disialyl fetuina.

Figura 6. Polysialylation de las protenas de la superficie celular en clulas PC12 vivas.

Las clulas PC12 se incubaron con los tres archivos PST en ausencia y presencia de 5 mM CMPNeu5Ac durante 1 hora a 37uC. PSA de la superficie celular se detect utilizando PSA-NCAM
inmunocitoqumica y los ncleos se detectaron con Hoechst 33258 y de formacin de imgenes
de microscopa confocal. Despus del tratamiento de las clulas PC12 con los tres archivos PST
en presencia de etiquetado PSA de la superficie celular especfico CMP-Neu5Ac se detect
(como se indica en los paneles denotados + CMP-Neu5Ac). Las reacciones de control tambin se
realizaron con el ausente CMPNeu5Ac; en estas reacciones no se detect el etiquetado PSA. La
cuantificacin de polysialylation celular se realiz mediante ImageJ (v 10.2) en las imgenes
inmunocitoqumicos de dos experimentos independientes mediante la medicin de la intensidad
de fluorescencia de 15 celdas seleccionadas al azar por imagen. Las imgenes fueron preprocesadas mediante la realizacin de sustraccin de fondo (50 pxeles de radio de la bola de
rodadura) antes de medir la intensidad de los pxeles. los valores de fluorescencia relativa se
calcularon dividiendo la intensidad PSA (fluorescencia verde) por la intensidad DAPI
(fluorescencia azul).