Electroforesis

Facultad de Ciencias BiolgicasUNPRG
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA MOLECULAR
LABORATORIO DE GENETICA Y BIOLOGIA
MOLECULAR
UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

INFORME DE PRCTICAS
Laboratorio de Gentica y Biologa Molecular
ALUMNA: AGUINAGA AYEN,

Mary
DOCENTE: RODRIGUEZ DELFIN,
Luis

MOLECULAR
PRACTICA N05
ELECTROFORESIS
OBJETIVOS:
Describir el proceso de Electroforesis.
Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una
Electroforesis.
Preparar una Electroforesis.
INTRODUCCION:
La electroforesis es un mtodo analtico semipreparativo, en el que se
separan biomolculas, en dependencia entre otros factores de su carga y
bajo la accin de un campo elctrico, fue empleado por primera vez por
Tiselius en el ao 1937. Raymond y Weintraub en 1959 emplearon como
soporte para la electroforesis un gel de poliacrilamida (PAGE),
posteriormente el mtodo fue perfeccionado por varios investigadores como
Davis y Ornstein. La popularidad de este creci rpidamente y se logr un
aumento de la resolucin. El dodecil sulfato de sodio (SDS) se introduce en
esta tcnica en 1970, y ya en 1972 se emplean agentes reductores y SDS
en la determinacin del peso molecular de protenas en lo que se denomin
electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE).
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un
campo elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo
(electrodos - y +), en dependencia de una combinacin de su carga, peso
molecular y estructura tridimensional.
Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son de
alta sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como mtodo
de separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y otras
biomolculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden
conocer tambin mediante estas tcnicas, las caractersticas cido-bsicas
de las protenas presentes en un extracto crudo, lo que da la informacin
necesaria si se pretende realizar una separacin cromatogrfica basada en
diferencias de carga. Es til adems para determinar otros parmetros como
peso molecular, punto isoelctrico y nmero de cadenas polipeptdicas de
las protenas.
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin vinlica del
monmero acrilamida CH2=CH-CO-NH2 y del monmero entrecruzador N,
N'-metilen-bis-acrilamida CH2 = CH- CO - NH - CH2 - NH - CO - CH = CH2. La
polimerizacin se inicia con la formacin de radicales libres del monmero,
que se producen por radicales libres de oxgeno, por causa de la accin de
iones persulfato.1 Las aminas terciarias como el N, N, N, N-tetrametilendiamina (TEMED) se emplean como catalizadores de esta reaccin, porque

MOLECULAR
causan la formacin de radicales libres del persulfato.4 Esta reaccin es

fuertemente inhibida por altos niveles de oxgeno,5 por lo que la solucin
debe ser desgasificada para lograr una formacin de gel reproducible. Hay
muchos factores que desempean una funcin importante en la separacin
electrofortica, como son pH, fuerza inica, gradiente de potencial, tiempo
de corrida, concentraciones de acrilamida y bis-acrilamida, etc.
La concentracin de acrilamida (% T) representa el porcentaje en peso del
monmero total empleado (acrilamida + entrecruzador en gramos por 100
mL) y determina la longitud promedio de la cadena del polmero. La
concentracin de bis-acrilamida (% C) representa el porcentaje de este
monmero en el gel y determina el grado de entrecruzamiento.
MATERIALES:
Placas de vidrio
Solucion de Poliacrilamida(Acrilamida:Bisacrilamida)
TBE 5X,TBE 1X
Agua destilada
Persulfato de amonio(APS)
TEMED
Buffer de carga
Solucion fijadora o de parada
Solucion de nitrato de plata
Solucion reveladora
Vaselina
Alcohol
Cmara electrofortica
Fuente de poder o energa
Micropipetas
Laminas de vidrio
Separadores
Slips
Peina
Tips o puntas
PREPARACIN :
AGREGAR 6 ml DE ACRIMILAMIDA

MOLECULAR
AGREGARLE AGUA
DESTILADA
HOMOGENEIZAR LA SOLUCION

MOLECULAR
SE VIERTE LA MEZCLA DE LOS COMPONENTES ANTERIORMENTE

MENCIONADOS A LOS CRISTALES PREVIAMENTE PREPARADOS
SE COLOCA EL PEINE Y SE DEJA POLIMERIZAR POR UN PERIODO
DE TIEMPO DE 20-30 MINUTOS.
DESPUS DE 20 MINUTOS SE RETIRA EL PEINE Y CON UNA

AGUJA HIPODRMICA SE LIMPIAN LOS POCILLOS CON EL FIN DE
DEJARLO LIBRE DE RESIDUOS, SE ENJUAGAN CON AGUA
DESTILADA.

MOLECULAR
SE ADICIONA A LAS PLACAS DE VIDRIO VASELINA CON UNA

AGUJA HIPODRMICA.
SE
COLOCA LA PLACA EN EL SISTEMA, UNIENDO LAS PLACAS Y EL
SISTEMA CON LOS SLIPS

MOLECULAR
SE LLENA LAS CUBETAS DEL SISTEMA CON BUFFER TBE 1X.
SE COLOCAN LOS CABLES QUE UNEN EL SISTEMA CON LA

FUENTE
DE
ALIMENTACIN
Y
SE
COMPRUEBA
LA
FUNCIONALIDAD DE ESTE CON EL BURBUJEO PRESENTE. SE
DEJA ENCENDIDA PARA QUE LIMPIE LOS POCILLOS

MOLECULAR
A CADA MUESTRA DE PCR SE LE ADICIONA 2 UL DE BUFFER DE

APLICACIN
SE APAGA LA FUENTE DE APLICACIN Y SE PROCEDE A

COLOCAR LAS MUESTRAS EN LOS POCILLOS

MOLECULAR
COLORACION DEL GEL:

SE COLOCA EL GEL EN SOLUCIN FIJADORA POR UN LAPSO DE
TIEMPO DE 10-15 MINUTOS

MOLECULAR
SE RETIRA EL FIJADOR Y SE PROCEDE A COLOCARLO EN

NITRATO DE PLATA POR UN PERIODO DE TIEMPO DE 15-20
MINUTOS
POSTERIORMENTE SE ENJUAGA EL GEL DOS VECES CON AGUA

CORRIENTE.
SE LE ADICIONA AL GEL EL REVELADOR, SE MANTENDR EN

ESTA SOLUCIN HASTA LA APARICIN DE LAS BANDAS
RESPECTIVAS.

MOLECULAR
PARA LA
CONSERVACIN DEL GEL SE COLOCA EN FIJADOR.
OBSERVACION DE LAS BANDAS
GEL DE POLIACRILAMIDA:

MOLECULAR
Solucin de poliacrilamida 20:1(acrilamida: bis acrilamida)

Solucin de TBE 5X y TBE 1X
Solucin de Persulfato de Amonio 10%
TEMED(NNNN Tetrametil Etilen Diamin)
CUESTIONARIO
1.- CUL ES LA FUNCIN DE TEMED Y APS?
TEMED, acrnimo de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (C6H16N2;

Mr = 116,21). Se trata de otro iniciador (propagador). La tasa de
polimerizacin y las propiedades del gel resultante dependen de la
concentracin de APS y TEMED. Aumentando su contenido se
disminuye la longitud media de la cadena de polmero y se
incrementa la turbidez del gel, al tiempo que disminuye su
elasticidad. Por contra, disminuyendo la cantidad de iniciadores se
obtiene el efecto inverso. Se debe, por tanto, utilizar la menor
concentracin posible de catalizadores que permita la polimerizacin
en un tiempo ptimo. Se utiliza APS y TEMED en concentraciones
equimolares del orden de 1 a 10 mM.
Persulfato amnico (APS) (N2H8S2O8; Mr = 228,2). El APS genera
radicales libres y es por ello un iniciador de la reaccin de
polimerizacin que finalmente forma el gel.
2.- QUE OTROS CATALIZADORES SON EMPLEADOS

FORMACIN DE GELES DE POLIACRILAMIDA?
PARA
LA
Catalizadores empleados en la formacin del gel de poliacrilamida

La polimerizacin se lleva a cabo con la utilizacin de sistemas catalticos
redox como por ejemplo:
Persulfato de amonio (agente oxidante) y TEMED como agente reductor.
Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN).
Perxido de hidrgeno, sulfato de hierro y cido ascrbico.
La polimerizacin no ocurre a bajo pH, ya que requiere radicales de
monmeros libres formados por catlisis bsica de radicales oxgeno del
persulfato.
La fotopolimerizacin con riboflavina no es inhibida por el oxgeno,sin
embargo, en ambos casos el TEMED acta como agente reductor suave y
acelera la polimerizacin.
3.- CULES SON LAS FUENTES DE ERROR EN UNA ELECTROFORESIS?

La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por
muchos errores experimentales, estos se reflejan a continuacin.

MOLECULAR
TEMPERATURA DURANTE LA POLIMERIZACIN Y LA CORRIDA DEL GEL

La movilidad de las protenas vara entre otras causas porque la viscosidad
del agua aumenta a bajas temperaturas (la distancia recorrida es
aproximadamente 20 % mayor en la regin central que es ms caliente).
Este efecto puede atenuarse con el empleo de un tampn ms diluido o
manteniendo temperaturas bajas durante el desarrollo de la electroforesis.
En geles vertidos a 25 C ocurre mayor variabilidad de los Rf si se comparan
con los vertidos a bajas temperaturas. La eficiencia de polimerizacin
incrementa comparativamente a 0 C por lo que sus propiedades fsicas son
superiores (para SDS-PAGE) a las de geles polimerizados a 25 C,
posiblemente por una disminucin del promedio de la longitud de la cadena
de estos ltimos.8 Un promedio de la desviacin estndar de los Rf
determinados por geles hechos con la misma mezcla de polimerizacin es
de 0,01, mientras que entre geles hechos de diferentes lotes de
polimerizacin, aunque preparados con idntica cantidad de catalizadores
es de 0,13. Esto est dado porque no es igual el porcentaje de conversin
de monmero en polmero.39 La uniformidad de la temperatura a travs del
gel mientras ocurre la corrida electrofortica generalmente elimina el efecto
de la deformacin de las bandas en forma de sonrisa.
VELOCIDAD DE LA POLIMERIZACIN
Niveles de catalizador Una polimerizacin muy rpida puede deformar las
bandas, porque ocurre una contraccin no uniforme del gel, en este caso
debe reducirse el TEMED y el persulfato de amonio o adicionar ferricianuro
de potasio, con el objetivo de hacer ms lenta esta. El empleo de niveles
bajos de catalizador provoca que la superficie del gel se torne desigual y
tienda a romperse con facilidad, pero el empleo de altas concentraciones
provoca que los geles tiendan a cuartearse. Este problema puede
solucionarse en geles de altas concentraciones, al poner una capa de
alcohol isobutlico en lugar de agua (en geles de bajas concentraciones
deben emplearse alcoholes de altas densidades).
PUREZA DE LOS REACTIVOS

El empleo de reactivos de alta calidad y agua desionizada es un
prerrequisito para hacer geles reproducibles y de alta resolucin, en
particular esto es muy importante para la acrilamida, ya que es el
constituyente ms abundante del gel y sus principales impurezas son cido
acrlico residual (que puede retardar la movilidad electrofortica de algunas
protenas), poliacrilamida lineal e iones.4 O Gaal y otros10 plantearon que el
cido acrlico y otras impurezas pueden ser eliminados por diferentes
mtodos, entre ellos la recristalizacin de la acrilamida. En SDS-PAGE la

MOLECULAR
calidad del SDS es importante, porque las protenas pueden unirse a

impurezas como alkil sulfato C10, C14 y C16, y provocar que una simple
protena forme mltiples bandas en el gel. Con SDS puro ocurre una
migracin anmala en protenas muy bsicas o muy cidas, en varias
glicoprotenas y lipoprotenas por causa de su composicin inusual.
TIEMPO DE CORRIDA
La determinacin del tiempo adecuado de corrida es muy importante, pues
corridas muy cortas impiden que las muestras avancen el espacio necesario
para su correcta separacin, pero tambin se ha probado que tiempos de
corrida cortos minimizan la dispersin de la muestra y el ensanchamiento
de la banda.
PREPARACIN DE LAS MUESTRAS
En el caso de la SDS-PAGE es necesario lograr una completa
desnaturalizacin de las protenas, para evitar la aparicin de bandas
fantasmas en la electroforesis (bandas dobles por la concentracin de ME o
por el tiempo de incubacin).
4.- TOXICIDAD DE LOS COMPONENTES DE ELECTROFORESIS

El principal inconveniente en los geles de poliacrilamida es la
toxicidad de sus componentes (acrilamida, N, N -metilen- bisacrilamida y persulfato de amonio), que pueden penetrar a travs de
la piel o por inhalacin produciendo irritacin de la piel y alteraciones
del sistema nervioso central. Los geles, una vez formados son
relativamente poco txicos, aunque es conveniente tomar las
precauciones adecuadas durante su manipulacin
5.- ES IGUAL EL AGAR QUE LA AGAROSA?
El agar-agar forma parte de la familia de hidrocoloides marinos
fabricados por Hispanagar como ingrediente alimentario (E406). De origen asitico, se ha consumido durante siglos como

MOLECULAR
elemento bsico en las dietas tradicionales de numerosas

poblaciones
en
Extremo
Oriente.
Los distintos tipos de algas de los que se puede obtener el agaragar (Gelidium, Gracilaria y Gelidiella) dan lugar a productos
con diferentes caractersticas, siendo los agares provenientes
de algas Gelidium y Gracilaria los ms utilizados y disponibles
en la cartera de productos de Hispanagar. La amplia variedad
de agar alimentario que ofrece Hispanagar permite su empleo
en un amplio nmero de formulaciones. Hispanagar le
aconsejar sobre el producto especfico que proporcionar los
mejores resultados en cualquier producto alimenticio.
El agar es un excelente agente gelificante y espesante, adems
de una fuente natural de fibra alimentaria de origen vegetal. La
compaa ofrece una gama completa de distintos agares que
cubren todas las aplicaciones alimentarias: Gold Agar, con un
temperatura de gelificacin baja, se recomienda para pastelera
y rellenos, lcteos y productos crnicos. Agarite tiene una gran
compatibilidad con productos de alto contenido en azcar y alto
punto de gelificacin. Este producto es Ideal para productos que
requieren un una gelificacin ms rpida. Grand Agar posee
propiedades nicas: gran transparencia, alto punto de
gelificacin y mejor solubilidad a temperaturas bajas.
Los principales campos de aplicacin en alimentacin son:
Confitera (gelatinas, caramelos y dulces, rellenos de caramelos,
mermeladas)
Pastelera y bollera (recubrimiento de pasteles y tartas,
donuts)
Productos
lcteos (yogures,
postres
lcteos,
leches
fermentadas)
Productos
crnicos
enlatados
El uso del agar-agar en alimentacin se basa en
sus propiedades inherentes:
Gran
poder
gelificante
Aplicable
en
un
amplio
rango
de
pH
Resistente
al
tratamiento
trmico
Gran histresis entre el punto de fusin y gelificacin
No enmascara sabores
Geles reversibles
Estabilidad de geles

MOLECULAR
La agarosa es un polisacrido natural extrado de las paredes

celulares de ciertas algas rojas (Rhodophyceae) tambin
conocidas como agarofitas. Su estructura qumica confiere a la
agarosa la capacidad de formar geles muy fuertes incluso a
bajas concentraciones. Estos geles de agarosa tienen una
estructura macro reticular con una malla muy abierta que se
puede modificar simplemente variando la concentracin de
agarosa.
La estructura macro reticular de los geles de agarosa se forma
por uniones de puentes de hidrgeno que hacen que el gel sea
termo-reversible, y por lo tanto que se funda cuando es
sometido a calentamiento. La histresis (diferencia entre la
temperatura gelificacin y de fusin) es mayor que en otros
hidrocoloides, lo cual es una gran ventaja en muchas
aplicaciones. Adicionalmente, la ausencia de grupos inicos
hace que el gel sea una estructura neutra e inerte, por lo que se
evita la interaccin de las molculas con la estructura del gel.
Todas las aplicaciones de la agarosa se benefician de esta

caracterstica de gel macro reticular. Se emplea como un tamiz
o soporte por el que pasan molculas biolgicas como protenas
o cidos nucleicos. Partculas ms grandes como virus o
fragmentos subcelulares tambin pueden moverse a travs de
la
red
del
gel.
Algunas de las tcnicas en las que la agarosa es una
herramienta
imprescindible
son:
Inmunodifusin: en esta tcnica las molculas migran a travs
del
gel
por
difusin
y
se
precipitan.
Electroforesis: las molculas son conducidas por campos
elctricos a travs de la estructura del gel. La agarosa es una
herramienta adecuada para todas las variantes de tcnicas
electroforticas,
as
como
inmunoelectroforesis
y
electroenfoque.
Cromatografa de gel, de afinidad y de cambio inico: en estas
aplicaciones el movimiento de las molculas es debido al
desplazamiento de un diluyente a travs del gel formado por
microesferas.
Medios de cultivo slidos: los medios de cultivo slidos o
semi-slidos se usan para el crecimiento de tejidos y clulas.
Los medios preparados con agarosa (en vez de agar) pueden

MOLECULAR
ser empleados para crecimiento bacterias auttrofas estrictas.

Crecimiento de cristales de protena: el gel de agarosa regula
la difusin de las molculas de protena permitiendo as la
formacin de cristales idneos para el estudio cristalogrfico.
6.- QUE REACCION OCURRE CUANDO SE LE AGREGA NITRATO DE
PLATA?
La tincin argntica es adems utilizada en el anlisis de cariotipo. El nitrato
de plata tie la Regin organizadora nucleolar (NOR por sus siglas en ingls)
asociada a protenas. Esto provoca una regin oscura donde la plata se
deposita, denotando la actividad de los genes de ARNr dentro de la NOR.
Los cromosomas 13, 14, 15, 21, y 22 poseen NORs. Adems, las NORs
aumentan la actividad de la tincin argntica ms de 50 veces. Esta
protena fue descubierta por Watson y Crick.
CONCLUSIONES
La electroforesis de protenas en geles con una matriz de

poliacrilamida,
comnmente
denominada
electroforesis
en
poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda
alguna una de las tcnicas ms ampliamente usada para caracterizar
mezclas complejas de protenas. La electroforesis en poliacrilamida es
un mtodo conveniente, rpido y econmico a nivel de muestra pues
se requieren slo cantidades del orden de microgramos de protena.
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente
de concentracin de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia
un gradiente decreciente en el tamao del poro, pueden tener
ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida.
En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona
donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se
alcanza el lmite del poro no se produce una migracin apreciable
aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este
tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en
regiones ms estrechas, adems de incrementar el rango de pesos
moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con
los de una concentracin fija.
Debemos seguir el protocolo, para que este tipo de proceso se realice
con total normalidad, adems de usar las medidas necesarias para
evitar cualquier tipo de accidentes.
LINKOGRAFIA
http://bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.htm
http://www.hispanagar.com/esp/agar.htm

MOLECULAR
http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/formatos/Electroforesis
%20de%20ADN%20en%20geles%20de%20poliacrilamida.pdf
https://books.google.co.in/books?id=cKGyh_81voC&pg=PA173&lpg=PA173&dq=toxicidad+de+acrilamida/bisac
rilamida&source=bl&ots=s_kIDwtPZ&sig=qoLI0MoM4buLvVlStFyRx67ABJ0&hl=es&sa=X&ei=i
f3oVJmgIcmvggSViYTwAQ&ved=0CB0Q6AEwAA#v=onepage&q
=toxicidad%20de%20acrilamida%2Fbisacrilamida&f=false

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1.- CUL ES LA FUNCIN DE TEMED Y APS?

TEMED, acrnimo de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (C6H16N2;

2.- QUE OTROS CATALIZADORES SON EMPLEADOS

Catalizadores empleados en la formacin del gel de poliacrilamida

3.- CULES SON LAS FUENTES DE ERROR EN UNA ELECTROFORESIS?

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TEMPERATURA DURANTE LA POLIMERIZACIN Y LA CORRIDA DEL GEL

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calidad del SDS es importante, porque las protenas pueden unirse a

4.- TOXICIDAD DE LOS COMPONENTES DE ELECTROFORESIS

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Todas las aplicaciones de la agarosa se benefician de esta

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