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INTRODUCCIN
1. Homogeneizacin de la muestra
Separacin y Purificacin
OBEJTIVOS
Identificar las etapas y fundamentos
indispensables para la extraccin de
ARN bacteriano.
Adquirir conocimiento bsico para el
manejo y cuidado de ARN extrado.
Realizar un procedimiento comercial
y accesible para la obtencin de ARN.
MATERIALES
Reactivos
Fenol
Etanol
Procedimiento
Isopropanol
Equipos
Vortex
Microcentrifuga
Se tomaron 2ml de
cultivo de bacterias
(E.
coli),agregandose a
un microtubo 2ml,
se
llevo
a
centrifugar 14.000
rpm 30" a 4C.
Luego se desecho
el sobrenandante,
aadiendose 2ml de
sln de lavado y se
centrifugo.
luego se desecho
nuevamene
el
sobrenadnte y se
resuspendio en 200
l de H2O sin
ARNasas.
se paso la suspension a
un tubo nuevo de 2ml
(contiene perlas circonosilica) y se aadieron 500
l sln detergente, 500 l
fenol acido y 100 l
cloroformo:Isoammilico
se llevo al vortex,
posteriormente
incubandos en hielo 10';
luego se centrifugo a
10.000 rpm 10' a 4C.
se paso la fase acuosa a
un microtubo de 1.5 ml y
se aadio un volumen
(1:1)
de
cloroformo
isomilico. Se mezcl por
inversin,
centrifugandose a 14000
rpm 5' a 4C.
se paso la fase
acuosa
a
un
microtubo de 1.5
ml, aadiendole 500
l
de
sln
isopropanol
e
incubar a -20 C
por
30',
luego
centrifugamos
a
14000 rpm 15' a 4
C.
se
desecho
el
sobrenandante,
aadiendose 400l
de
etanol
75%
mezclar
por
inversion,
centrifugando
a
14000 rpm 5' a
4C , luego deseche
el sobrenadante.
se
dejo
secar,
resuspendiendose
en TE.
RESULTADOS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Poz
o
RN
A
Fuente:
Laboratorio
de
biologa
molecular. En la extraccin de ARN a
partir de bacterias (E. coli)
En esta imagen se puede observar, el
resultado obtenido, luego de realizar el
protocolo para la extraccin de ARN a
partir de bacterias (kit ARN), en esta
prctica trabajamos con cepas de E.coli,
las cuales son las ms comnmente
utilizadas para realizar este tipo de
procedimientos.
El pozo correspondiente a nuestro grupo,
es el nmero 11, en el cual se puede
observar mediante la electroforesis, la
presencia de ARN, esto quiere decir que
se realiz el protocolo de manera
correcta, por lo tanto, se pudo obtener el
resultado esperado. Al igual que los pozos
1, 4, 5, 6, 7; en los cuales es ms notable
la presencia de ARN. En los pozos, 9, 10,
12 y 13; la presencia de ARN fue mnima;
y, en los pozos, 2, 3, y 8 no se observ la
presencia de ARN.
DISCUSIONES
En la prueba de electroforesis se pudo
evidenciar un resultado exitoso debido a
que hubo un correcto desarrollo del
protocolo expuesto por la docente.
Es muy importante conocer los materiales
y reactivos que se utilizaron durante este
protocolo, ya que cualquier error a la hora
de pipetear o aadir reactivos se vern
afectados en los resultados que se desean
obtener.
CUESTIONARIO
a. cul es
la
funcin del
dietlpirocarbonato
(DEPC)
durante la extraccin del RNA?
(Salamanca, 2015)
Es una sustancia qumica que elimina
Ribonucleasas, enzimas capaces de
degradar el RNA. Se prepara adicionando
el compuesto DEPC, 0.01 ml por cada
100 ml de agua. Con el agua DEPC
puedes disolver RNA aislado de cualquier
tejido, pues esta agua ya no tendr
ribonucleasas que degraden el RNA.
c. qu inhibidores de nucleasas
existen y en que procedimientos
deben utilizarse? (Cultek, 2016)
Tampn Tris-EDTA (TE): es un
inhibidor de nucleasas y un buen tampn
para la conservacin del ADN. El EDTA
inhibe la PCR a concentraciones
superiores a 1mM.
Fenol: desnaturaliza las protenas
contaminantes de la muestra. Se usa para
eliminar
la
protenas
(proteasas,
nucleasas...); disminuye el rendimiento de
la PCR a concentraciones del 0,2% y al
0,5% la inhibe completamente.
Cloroformo: permite la separacin
de 2 fases; el ADN queda en la fase
acuosa y en la fase orgnica quedan las
protenas y otros contaminantes.
Etanol e isopropanol: precipitan
los cidos nucleicos. Tienen efectos
inhibitorios a concentraciones superiores
al 1%
- Isotiocianato de guanidinio: es un
agente caotrpico (favorece la disolucin
en agua de compuestos insolubles) que
inhibe las RNasas y conserva el ARN
-El SDS es un detergente inico que
desnaturaliza las protenas pero tambin
inhibe la PCR a concentraciones
mnimas.
-Otras sustancias que presentan efectos
inhibitorios sobre la PCR son el cloruro
sdico, la hemoglobina, la heparina o la
urea.
d. A partir de que otras muestras
puede realizarse la extraccin de
ARN y con qu objetivo se
realizan estas
extraccin?
muestras
de
CONCLUSIONES
Mediante la realizacin de este
protocolo se pudo identificar las
etapas y fundamentos indispensables
para la extraccin de ARN bacteriano.
Se pudo comprobar que una de las
metodologas ms sencillas es la que
se utiliz en este trabajo prctico y
consiste en la utilizacin de un
detergente suave como es el SDS
para el lisado de las clulas que se
combina con la muestra de manera de
favorecer la solubilizaran del
material.
Para obtener una excelente extraccin
de ARN bacteriano es importante
seguir paso a paso el protocolo con la
ayuda del docente.
BIBLIOGRAFIA
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pdf