Resumen: V-041

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E

Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006

Escherichia coli productor de toxina Shiga

en medias reses y carnes molidas bovinas*
1

Cicuta, Mara E. - Deza, Natalia - Roibn, Walter R.

1
4
2
Benitez, Mara C. - Ramrez, Gabriela V. - Arz, R. O.
1.Ctedras de Microbiologa - 2. Ctedra de Bromatologa (FCV/UNNE),
Sgto. Cabral 2.139, Corrientes. Tel/Fax 03783- 425753 420854, Interno 165. E-mail: cicuta@vet.unne.edu.ar
3.Servicio Fisiopatogenia , Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn,
Av. Vlez Sarsfield 563 (1281), Buenos Aires.E-mail: ndeza@anlis.gov.ar
4.SGCYT/UNNE
ANTECEDENTES
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC), es un patgeno emergente transmitido por alimentos,
asociado a casos espordicos y a brotes de diarrea con o sin sangre, colitis hemorrgica y sndrome urmico hemoltico
(SUH) (Paton & Paton (1998).Desde su identificacin como patgeno en 1982, STEC O157:H7 ha ocasionado una
serie de brotes, especialmente en Canad, Japn, Reino Unido y Estados Unidos (Bettelheim, 2003; Karmali, 1989).
Los rumiantes en general, y el ganado vacuno en particular, han sido sealados como los principales reservorios de
STEC, el ganado ovino es tambin excretor de estos microorganismos (Padola et al., 2004; Blanco et al., 2004; Gmez
et al., 2002). Distintos alimentos como carne molida y productos crnicos crudos o insuficientemente cocidos,
hamburguesas, embutidos fermentados, lcteos no pasteurizados, mayonesa, jugos de manzana no pasteurizados y
vegetales tales como lechuga, brotes de soja y alfalfa, entre otros, han sido sealados como fuente de contaminacin en
casos espordicos o brotes asociados a STEC, la bacteria es resistente a los cidos y puede sobrevivir en alimentos
fermentados (Gmez et al., 2002). El ganado vacuno no es un husped especfico de STEC, en heces de animales sanos
se pueden aislar distintios serotipos de STEC O157 y no-O157 y un mismo animal puede portar ms de un serotipo
(Hussein & Bollinger, 2005). Otras formas de transmisin son: la contaminacin cruzada durante la preparacin de los
alimentos, el contacto directo del hombre con animales, y persona a persona, por la ruta fecal-oral, debido a las bajas
dosis infectivas que posee este grupo bacteriano, ya menos de 100 bacterias por gramo de alimento puede causar
enfermedad (Paton & Paton, 1998; Karmali, 1989).
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un mtodo selectivo y sensible que amplifica regiones
especficas de un gen. Para minimizar tiempo y materiales, los cebadores o primers pueden ser combinados en una
reaccin nica (PCR mltiple) que puede detectar varios genes en una sola muestra (Watterworth et al., 2005; Paton &
Paton, 1998). Esta reaccin ha significado un considerable avance sobre otros mtodos de PCR para identificar STEC y
la mayora de sus genes marcadores de virulencia incluyendo las variantes de la toxina Shiga (Osek, 2003). Esta tcnica
ha sido validada por diversos autores (Leotta et al., 2005; Pollard et al., 1990) para el rpido diagnstico de STEC
basada en la deteccin de los genes stx1, stx2 y rfbO157 para la confirmacin de cepas STEC O157 y no- O157 a partir
de cultivos. El desarrollo de este mtodo ha permitido la identificacin simultnea de los tipos enterotoxignicos
(ETEC), enteropatognicos (EPEC), enterohemorrgicos (EHEC) y enteroinvasivos (EIEC) de E. coli (Rappelli et al.,
2001). Con esta tcnica y tan slo 12 horas de enriquecimiento en caldo, un mnimo de 0,5 unidades formadoras de
colonias (UFC) por gramo de carne molida puede ser detectada (Witham et al, 1996).
Si bien la mayora de los estudios estn orientados a la deteccin de E. coli O157, en la actualidad aumentaron
los esfuerzos para detectar los diferentes serotipos de STEC no-O157 (Bettelheim 2000, 2003) .En Espaa (Blanco et
al., 2003), detectaron 13% de STEC en 455 muestras de carne cruda, aislando 1% de E. coli O157:H7 y 12% de STEC
no-O157. En Argentina se analizaron 279 muestras de carne, detectndose STEC O157:H7 en 3,8% de muestras de
carne picada, 4,8% de muestras de chorizo fresco y 3,3% de muestras de chorizo seco (Chinen et al., 2001). En el ao
2003 se pudo establecer por primera vez en Argentina la asociacin entre un caso espordico de SUH y el consumo de
hamburguesas caseras contaminadas por STEC O157:H7 (Rivas et al., 2003a,b).
Visto que los perfiles de virulencia de Escherichia coli aisladas de hamburguesas y carne molida se
corresponden con los obtenidos de terneros y bovinos adultos (Parma et al.2000) y Argentina, con 300 casos por ao
de SUH, tiene uno de los valores ms altos registrados con una tasa de incidencia de 12,5/100.000 nios menores de 5
aos (Lpez et al., 1997; Gianantonio et al., 1973 y Rivas et al., 1996), el propsito del presente trabajo fue determinar
la presencia de E. coli productor de toxina Shiga en medias reses bovinas de plantas faenadoras y carnes procesadas en
lugares de expendio de las mismas, de las provincias de Chaco y Corrientes del nordeste argentino.

* Corresponde al PI 20/03: Escherichia coli verotoxignicas, con especial referencia a O157:H7, en medias reses y
carne molida bovinas del nordeste argentino(SGCYT/UNNE, Res. N 638/2003-CS)

Resumen: V-041

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E

Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006
MATERIALES y MTODOS
En el perodo comprendido entre mayo de 2004 y julio de 2006 se analizaron 240 muestras de carne molida y
147 hisopados de reses bovinas. Cada unidad de carne picada se conform de acuerdo con la normativa del Servicio
Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroalimentaria (SENASA, Circular 3496/2002) de porciones representativas de
los lotes de produccin, de 150 g cada una, de las cuales se pesaron 25 g en 225 ml de caldo tripticasa soya. La
recoleccin de los hisopados se realiz mediante el uso de tcnicas no destructivas, siguiendo las mismas normas, con
una plantilla de papel de estraza descartable, que cubri una superficie de 100 cm2 o sea un cuadrado de 10 cm de lado,
en cuatro zonas: nalga, ijada, pecho y cogote. Se frot un hisopo embebido en caldo peptonado (0,1%) estril + cloruro
de sodio (0,85%), en forma vertical, luego horizontal y por ltimo diagonalmente, cubriendo la totalidad de esa
superficie. Todas las muestras fueron enriquecidas en agua peptonada con cefixima (Bag, 0,05 mg/l) a 37C durante 6
hs., y posteriormente aisladas en agar MacConkey (Merck). La caracterizacin de las colonias fermentadoras de lactosa
se realiz mediante la utilizacin de citrato de Koser (Oxoid) y la produccin de lisina decarboxilasa en agar lisina
hierro (Britania). Con esta identificacin previa se hicieron las pruebas de crecimiento en presencia de telurito de
potasio, fermentacin de sorbitol, y deteccin de -glucuronidasa 11.
Los aislamientos de Escherichia coli se enriquecieron en caldo tripticasa de soja (Difco) a 37C por 6 hs y
luego repicados en agar MacConkey sorbitol (SMAC) (Difco). Las placas de SMAC se incubaron a 37C durante 18-24
hs. Como tamizaje se realiz la tcnica de PCR mltiple de la zona de crecimiento confluente, para deteccin de los
genes stx1 y stx2, usando los oligonucletidos descriptos por Pollard et al. (1990) y el gen rfbO157, usando los
oligonucletidos descriptos por Paton & Paton (1998). Los aislamientos stx1 y/o stx2 positivos se identificaron por
tcnicas bioqumicas estndares serotipificaron con antisueros de E.coli O y H (rskov & rskov, 1984) y
caracterizaron feno-genotpicamente (Chinen et al., 2001; Rivas et al., 2003a,b)
Caracterizacin fenotpica y genotpica de los aislamientos. El gen eae fue detectado por PCR (Karch et al.,
1993); las cepas STEC eae-negativas se analizaron para determinar la presencia del gen saa (Paton & Paton, 1998), el
gen EHEC-hly se identificar por PCR (Schmidt et al., 1995) y la hemlisis debida a EHEC-enterohemolisina se
observar en placas de agar sangre con glbulos rojos desfibrinados de oveja. El antibiotipo fue determinado segn el
mtodo de Kirby Bauer para: cido nalidixico, amikacina, ciprofloxacina, ampicilina, cloranfenicol, colistin,
estreptomicina, gentamicina, nitrofurantona, tetraciclina y trimetoprima-sulfametoxazol (NCCLS Standards Methods
2004).
Subtipificacin de los aislamientos. Las variantes de stx2 se determinaron por anlisis de polimorfismo de
longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) de los productos de amplificacin obtenidos por PCR de una regin de
la subunidad B de la toxina.(Tyler et al., 1991).
DISCUSIN de RESULTADOS
Se confirmaron bioqumicamente como Escherichia coli, 190 cepas (Cuadro 1), 134 (70,5%) de las cuales
fueron aisladas de carnes molidas (n= 240) y 56 (29,4%) de reses bovinas (n= 147).
Cuadro 1: Caracterizacin bioqumica de 190 cepas de Escherichia coli aisladas de carnes molidas e hisopados de reses
bovinas de las provincias de Corrientes y Chaco (mayo 2004 a julio 2006).
Muestra (aislamientos/n)
Carne molida (134/240)
Res bovina
(56/147)

Sorbita (+) Sorbita (-)

63
71
46
10

Telurito(+)Telurito (-)
120
14
55
1

+
(n=36) 30
(n=22) 20

6
2

Referencias:
Sorbita (+): Fermentacin de sorbitol
Sorbita (-): No fermentacin de sorbitol
Telurito (+): Crecimiento en presencia de telurito de potasio
Telurito (-): Ausencia de desarrollo en presencia de telurito de potasio
+: Presencia de la enzima -glucuronidasa
-: Ausencia de la enzima -glucuronidasa
Del 55,8% de las carnes molidas (134/240) se aisl E. coli mientras que slo del 38% (56/147) de las reses.
Ello fue esperable debido a las normas sanitarias que rigen para la res (lavado con agua potable, fro y desecacin de la
superficie) comparado con el procesamiento de las carnes molidas, donde, al destruir las fascias protectoras, aumenta la
superficie de contaminancin.
Una sola cepa aislada de carne molida e identificada como C37a, fue caracterizada como E. coli STEC noO157:H7, OR:HNT, stx2vh-a (Figura 1), negativa para los marcadores de virulencia accesorios: eae, EHEC-hlyA y saa,
fermentadora de sorbitol, -glucuronidasa positiva, no desarrollando en presencia de telurito de potasio y sensible a
todos los antibiticos ensayados. Otra cepa proveniente de hisopado de res, referencia R40b, de cinco das de

Resumen: V-041

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E

Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006
conservacin en cmara fue caracterizada como E. coli O157 (Figura 2), no fermentadora de sorbitol, glucuronidasa
positiva y desarrollando en presencia de telurito de potasio.

stx2 (+)
1

1000pb

346 pb (stx2)
259 pb (rfbO157)

Stx2
0157

130 pb (stx1)
Stx1

Figura1.
Productos de amplificacin por PCR para la deteccin de los genes
stx1, stx2 y rfbO157. Lnea 1: E. coli OR:HNT stx2 cepa aislada
de carne molida (C37a). Lnea 2: control negativo E. coli ATCC
25922 sin factores de virulencia. Lnea 3: control positivo E. coli
EDL933 stx1/stx2/rfbO157. Lnea 4: control de reactivos (mezcla
sin templado). Lnea 5: Amplicn de control positivo

Figura 2.
Productos de amplificacin por PCR para la
deteccin de los genes stx1, stx2 y rfbO157.
Lnea 1: E. coli O157, cepa aislada de hisopado
de res (R40b). Lnea 2: control positivo, E. coli
EDL933 stx1/stx2/rfbO157. Lnea3: control de
reactivos (mezcla sin templado). Lnea 4:
marcador
de
tamao
molecular.

CONCLUSIONES
Debido a que el tipo 2 de toxina Shiga (stx2) es el principal responsable de la falla renal en el SUH, (Wen et
al. 2006; Brooks et al., 2005) es necesario extremar los controles higinico-sanitarios de derivados bovinos, en especial
carne molida, para que no constituyan riesgo en los consumidores.
Cepas stx2 como la de este trabajo, han sido predominante en varios estudios llevados a cabo en Argentina
sobre bovinos y sus productos, en especial carnes molidas y hamburguesas (Blanco et al., 2004, Gmez et al. 2002,
Gioffre et al., 2002) y en Australia (Brett et al. 2003). Sin embargo Mercado et al, (2004), hallaron un 60% de STEC
no- O157 productoras de toxina Shiga stx1, en 15 cepas aisladas de 12 muestras de materia fecal diarreicas de terneros
de establecimientos pampeanos argentinos.
La prevalencia de STEC no-O157 en los Estados Unidos es mayor de lo que se sospechaba, por esta razn, a
partir de enero de 2002, la American Society for Microbiology Public and Scientific Affairs Board Committee on
Agriculture and Food Microbiology recommend al U.S. Department of Agriculture Food Safety and Inspection
Service (FSIS) la necesidad de incluir los serotipos no-O157 STEC (Parck et al., 2002).
BIBLIOGRAFA
1- Bettelheim KA. Non O-157 Verotoxin-producing Escherichia coli . A problem, paradox and paradigm.
Exp. Biology and Medicine. 228: 333 344 2003.
2- Bettelheim KA. Serotypes of verotoxin-producing Escherichia coli reported in the literature apart from
those
belonging
to
serogroup
O157.
MicroBionet.http://www.microbionet.com.au/frames/feature/vtec/intro.htm 2000.
3- Blanco M, Padola NL, Kruger A, Sanz ME, Blanco JE, Gonzalez EA, Dahbi G, Mora A, Bernardez MI,
Etcheverria AI, Arroyo GH, Lucchesi PM, Parma AE, Blanco J. Virulence genes and intimin types of
Shiga-toxin producing Escherichia coli isolated from cattle and beef products in Argentina. Int
Microbiol. 7(4):269-76 2004.
4- Brett KN, Hornitzky MA, Bettelheim KA, Walker MJ, Djordjevic SP. Bovine non-O157 Shiga-toxin 2containing Escherichia coli isolates commonly posses stx2-EDL933 and/or stx2vhb subtypes. J Clin
Microbiol. 41(6):2716-22 2003
5- Brooks JT, Sowers EG, Wells JG, Greene KD, Griffin PM, Hoekstra RM, Strockbine NA. Non-O157 Shigatoxin producing Escherichia coli infections in the United States, 1983-2002. J Infect Dis. 192(8):1422-9
2005.
6- Chinen, I.; Tanaro, J.D.; Miliwebsky, E.; Lound, L.H.; Chillemi, G.; Ledri, S.; Baschkier, A.; Scarpin, M.&
Rivas, M. Isolation and characterization of Escherichia coli O157:H7 from retail meats in Argentina. J.
Food Prot. 64 (9): 1346 51 2001.

400 pb
300 pb
200 pb
100 pb

Resumen: V-041

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E

Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006
7- Gianantonio, C.A.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Gallo, G.E. & Sojo, E.T. The hemolytic uremic
syndrome. Nephron,
11: 174-192 1973.
8- Gioffre A, Meichtri L, Miliwebsky E, Baschkier A, Chillemi G, Romano MI, Sosa Estani S, Cataldi A,
Rodriguez R, Rivas M.Detection of Shiga toxin Escherichia coli by PCR in cattle in Argentina,
Evaluation of two procedures. Vet Microbiol. 22;87(4):301-13 2002.
9- Gmez D, Miliwebsky E, Fernandez Pascua C, Baschkier A, Manfredi E, Zotta M, Nario F, Piquin A, Sanz
M, Etcheverria A, Padola N, Parma A, Rivas M. Aislamiento y caracterizacin de Escherichia coli
productora de verotoxina de hamburguesas congeladas y quesos blandos. Rev Argent Microbiol.
34(2):66-71 2002.
10- Hussein HS, Bollinger LM. Prevalence of Shiga toxin-producing Escherichia coli in beef cattle. J Food
Prot. 68(10):2224-41 2005.
11- Karch H, Bohm H, Schmidt H, Gunzer F, Aleksic S, Heesemann J. Clonal structure and pathogenicity of
Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H7. J. Clin. Microbiol.; 31: 12005 1993.
12- Karmali, M.A. Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli. Clinical Microbiological Reviews
2, 1538 1989.
13- Leotta GA, Chinen I, Epszteyn S, Miliwebsky E, Melamed IC, Motter M, Ferrer M, Marey E, Rivas M.
Validation of a multiplex PCR for detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli. Rev Argent
Microbiol. 37(1):1-10 2005.
14- Lpez, E.L.; Contrini, M.M.; Sanz, M.E.; Vias, M.R.; Parma, A.R.; De Rosa, M.F. & Cleary, T.G.
Perspectives on Shiga-like toxin infections in Argentina. J.Food Protect., 60: 1458 - 1462 1997.
15- Mercado EC, Gioffre A, Rodriguez SM, Cataldi A, Irino K, Elizondo AM, Cipolla AL, Romano MI, Malena
R, Mendez MA. Non-O157 Shiga-toxin producing Escherichia coli isolated from diarrhoeic calves in
Argentina J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. 51(2):82-8 2004
16- National Committee for Clinical Laboratory Standards..Performance standards for antimicrobial disk
susceptibility tests, 8th ed., 24 (1). Approved standard M100-S13. National Committee for Clinical
Laboratory Standards, Wayne, P.A 2004.
17- rskov F & rskov I. Serotyping of Escherichia coli. In T. Bergan (ed), Methods in Microbiology,
Academic Press, London, 14: 43 112 1984.
18- Osek J. Development of a multiplex PCR approach for the identification of Shiga toxin-producing
Escherichia coli strains and their major virulence factor genes Journal of Applied Microbiology,
95(6):1217 2003.
19- Padola NL, Sanz ME, Blanco JE, Blanco M, Blanco J, Etcheverria AI, Arroyo GH, Usera MA, Parma AE.
Serotypes and virulence genes of bovine Shigatoxigenic Escherichia coli (STEC) isolated from a feedlot
in Argentina. Vet Microbiol. 100(1-2):3-9 2004.
20- Parck CH, Kim HJ & Hixon DL. Importance of testing stool specimens for Shiga toxins. J. Clin.
Microbiol. 40:3542-3543 . 2002.
21- Paton, JC & Paton, AW. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli
infections. Clin. Microbiol. Rev. 11:450-479 1998.
22- Pollard DR, Johnson WM, Lior H, Tyler SD, Rozee KR. Rapid and specific detection of verotoxin genes
in Escherichia coli by the polymerase chain reaction. J.Clin.Microbiol. 28: 540-545 1990.
23- Rivas M, Caletti MG, Chinen I, Refi SM, Roldn CD, Chillemi G, Fiorilli G, Bertolotti A, Aguerre L.
Home-prepared hamburger and sporadic hemolytic uremic syndrome, Argentina. Emerging Infect. Dis.
9:1184-1186 2003a.
24- Rivas M, Sosa Estani S, Rangel J, Caletti MG, Valls P, Mead P, Griffin P. Risk factors associated with
Shiga toxin-producing Escherichia coli infections, Argentina. A Case-Control Study. Abstract 5th
Iternational Symposium and Workshop on Shiga toxin (verocytotoxin) Producing Escherichia coli
infections. Edinburg, (United Kingdom) p. 19 2003b.
25- Rivas, M.; Voyer, L.E.; Tous, M., de Mena, M.F.; Leardini, N.; Wainsztein, R.; Callejo, R.; Quadri, B.; Corti,
S.& Prado, V. Verocytotoxin-producing Escherichia coli infection in family members of children with
hemolytic uremic syndrome. Medicina (Buenos Aires), 56: 119 125 1996.
26- Schmidt, H., L. Beutin, and H. Karch Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of
Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933. Infect. Immun. 63:1055-1061 1995.
27- Tyler SD, Johnson WM, Lior H, Wang G, Rozee KR. Identification of verotoxin type 2 variant B subunit
genes in Escherichia coli by the polymerase chain reaction and restriction fragment length
polymorphism. J. Clin. Microbiol. 29: 1339-1343 1991.
28- Watterworth L, Topp E, Schraft H & Leung KT. Multiplex PCR-DNA probe assay for the detection of
pathogenic Escherichia coli Journal of Microbiological Methods 60, Issue 1:93-105 2005.
29- Wen SX, Teel LD, Judge NA, O'Brien AD. A plant-based oral vaccine to protect against systemic intoxication
by Shiga toxin type 2Proc Natl Acad Sci U S A. 103(18):7082-7 2006.
30- Witham PK, Yamashiro CT, Livak KJ, Batt CA. A PCR-based assay for the detection of Escherichia coli
Shiga-like toxin genes in ground beef. Appl Environ Microbiol. 62(4):1347-53 1996.