La Fertilizacin abstracta es uno del ms especfico y cuidadosamente regul

las interacciones del clula-clula en el cuerpo animal y se determina a una

magnitud grande por la compatibilidad entre los ligand y molculas del
receptor en la superficie de cada gameto. En el pellucida de la zona (ZP), la
actividad de receptor de esperma es asociada con el glycoproteins ZP3 (el
receptor primario para la esperma acrosome-intacta) y ZP2 (el receptor
secundario para la esperma acrosome-reaccionada) pero se definen bien sus
protenas obligatorias complementarias en la esperma. Nosotros repasamos la
evidencia para el proacrosin como un ZP secundario la protena obligatoria en
esta comunicacin. Proacrosin/acrosin liga el non-enzymically al glycoproteins
de ZP. Ligar es una interaccin inica fuerte entre el polysulphate se agrupa en
el glycoproteins de ZP (probablemente en sus mitades del hidrato de carbono)
y residuos bsicos en la superficie de proacrosin. El stereochemistry de los
reactantes es crucial y determina a una magnitud grande la afinidad de ligar. El
mutagenesis sitio-dirigido y un anlisis 3D-estructural de jabal y acrosin del
carnero han identificado 2 racimos de residuos bsicos potencialmente
involucrado ligando. Un anticancer del polysulphonated narcotizan, suramin, se
ha mostrado ligar fuertemente al proacrosin/acrosin e inhibir esperma-huevo
que liga en el vitro. En el modelo del ratn, 125I-ZP2 y 3 H-suramin ligan 65%
eficazmente al acrosin 'nulo' la esperma que para salvaje-teclear la esperma.
Ni ZP2 ni suramin ligan al acrosome la esperma intacta y pueden, por
consiguiente, slo ejerza sus efectos despus de la exposicin de los
volmenes del acrosomal. En conjunto, esta combinacin de datos bioqumicos,
genticos y funcionales apoya la hiptesis que el proacrosin es una protena del
multifunctional con un papel significante reteniendo la esperma acrosomereaccionada mucho tiempo en la superficie de ZP bastante para permitir a la
penetracin de ZP empezar. 2002 Ciencia de Elsevier Irlanda S.A.. Todos los
derechos reservados.

1. la introduccin Durante su pasaje de los testculos al sitio de fertilizacin en

el oviducto, los espermatozoos mamfero encuentran una variedad de clulatipos diferentes que van de las clulas de Sertoli y espermatozoos en el tubules
del seminiferous a las clulas del epithelial en el epididymis, tero y oviducto y
finalmente el oophorus del cmulo. Aunque en muchos espermatozoos de la
especie muestre una interaccin transente con algunos de estos clula-tipos
que pueden tener la importancia fisiolgica (por ejemplo para la supervivencia
en el tero), ninguno de las clulas ni sus productos secretorios sacan las
sendas sealando apropiadas que se comienzan cuando el spermatozoon
alcanza el huevo y lazos finalmente al pellucida de la zona (ZP). en parte, esto
puede estar debiendo a la inmadurez de los espermatozoos ellos, la presencia
de inhibitory/membrane que estabiliza factores o la combinacin incorrecta de
signos que emanan de la clula designado. Por consiguiente, la especificidad
de fertilizacin reside a una magnitud grande en el cruz-charla complementario

que ocurre entre los gametos homlogos. Dentro de este guin, los complejos
del ligand-receptor presentan obviamente en la superficie de esperma y huevo
juegue un papel importante. Como resultado de una cantidad grande de
investigacin acumulado en la biologa celular de fertilizacin en las especies
diferentes (para la revisin Yanagimachi ven, 1994), pueden verse las
interacciones del esperma-huevo mamfero como una serie de pasos
secuenciales. En el paradigma del ratn (Wassarman, 1999), un spermatozoon
acrosome-intacto que llega en la superficie del ZP reconoce y liga a un receptor
primario asociado con la mitad del hidrato de carbono O-unida de glycoprotein
ZP3 (Fig. 1). Esta encuadernacin es de afinidad suficiente retener el
spermatozoon del motile en la superficie del ZP mientras permitiendo
arracimarse de al mismo tiempo receptor-ligand complejos que inducen
exocytosis de la vescula del acrosomal. El ventanaje extenso y prdida de la
gorra del acrosomal exponen la matriz del acrosomal y en el futuro la
membrana del acrosomal interna. En esta fase un segundo paso obligatorio
tiene lugar entre el receptor secundario en el ZP (el glycoprotein ZP2) y una
protena obligatoria dentro de la matriz del acrosomal y/o en la membrana del
acrosomal interna. Ligar, sin embargo, no deben ser tan tenaces que impide a
la cabeza de esperma penetrar a travs del ZP. En parte como resultado de
fuerzas del empujn generadas por el flagellum del motile y en parte debido a
un no identificado 'el lyticlike' la accin, la cabeza de esperma penetra a travs
de los ZP y accesos los perivitilline espacian (Bedford, 1998). Aqu un tercer
paso obligatorio sucede que posiblemente involucra integrin o receptores de
CD9 en el oolema (el al de et de Molinero., 2000). Aunque este cuadro parece
bastante claro, la naturaleza del primero, las protenas obligatorias secundarias
y terciarias en los espermatozoos son muy contenciosas. Una variedad ancha
de candidatos se ha descrito (Mesa 1), muchos de ellos en el
el sistema del ratn exclusivamente. stos son suficientemente dispares en sus
propiedades plantear las preguntas importantes sobre cmo ellos se integran
entre si con, incluso permitir la redundancia dentro del sistema como sugerido
por el reciente gen 'el knockout' los experimentos. Los mritos relativos de
estos ZP diferentes se han discutido las protenas obligatorias en varias
revisiones (McLeskey, 1998,; Wassarman, 1999). En esta comunicacin que
nosotros enfocaremos en la evidencia en el favor de una protena espermaespecfica los proacrosin/acrosin llamados como una encuadernacin
secundaria o molcula del ligand por retener la esperma acrosome-reaccionada
en la superficie de la zona. Aunque el acrosin se ha considerado mucho tiempo
como un lysin de la zona, la evidencia para esto es menos convincente que
previamente supuso (Bedford, 1998) y debe considerarse ahora como una
protena del multifunctional. 2. la evidencia para el proacrosin/acrosin de
esperma como una protena ZP-obligatoria Los experimentos iniciales para
descubrir ZP las protenas obligatorias en los espermatozoos eran basado en el
principio de usar ZP2 y receptores de ZP3 como las sondas identificar sus

protenas obligatorias respectivas en los extractos de espermatozoos. Para este

propsito, las protenas detergente-solubles de la esperma del jabal estaban
separadas por el SDS-PGINA, desplegaron en un borrn Occidental e
incubaron con 125I-labelled cerdo el glycoproteins de ZP. Estos experimentos,
usando ZPs del follicular u ovul los huevos, captacin de forma consistente
revelada por una protena de esperma de Mr 53 kDa que eran
el immunologically identificado y bioqumicamente como el proacrosin, los
zymogen forman del acrosin de protease de serine (Jones y Broncea, 1987;
Jones, 1991,; Urch y Patel, 1991). Alguna encuadernacin tambin se observ a
un grupo de protenas de Mr bajas en el plasma seminal, despus identific
como una familia de glycoproteins del vesiclederived seminal conocido como el
adhesins de esperma (el Topfer-Petersen et al., 1998). Dado el grado alto de
selectividad de la sonda de ZP para proacrosin mostrado por el fracaso de la
sonda para ligar al nmero grande de otras protenas de esperma presente en
el borrn, la naturaleza de la interaccin fue investigada ms all. El estado
actual de conocimiento puede resumirse como sigue: 1. el Proacrosin-ZP
glycoprotein ligar es el non-enzymic (Jones, 1991,; El Jansen et al., 1995). La
inclusin de inhibidores del proteinase (2 mm EDTA, 5 p-aminobenzamidine del
mm (el pAB), 100 leupeptin de g) en los pulidores de la incubacin ningn
efecto lleva puesto captacin de la sonda (de hecho, inhibidores de forma
consistente aumento que liga por 10-15%). en cualquier caso, el proacrosin es
inherentemente inactivo. 2. ligando de [125I]ZPs al proacrosin purificado
muestran un ancho ptimo entre el pH 5.0 y 8.0 y es sal-dependiente, con un
mximo afilado a 150 mm NaCl (Williams y Jones, 1993); 50% inhibicin tiene
lugar a 450 mm NaCl. Esto sugiere que una interaccin inica fuerte
estabilizara por co-ordinated hidrgeno que une entre las mitades del guanido
en los grupos del sulphate como descrito para las interacciones de sobre de
bindin-vitilline (De Angelis y Glabe, 1990). 3. Inactivo - el acrosin y proacrosin
son igualmente eficaces en ZP los ensaye obligatorios (Jones, 1991). El hecho
que el proacrosin se convierte a - el acrosin por las hendiduras interiores (el
Baba et al., 1989) en ambos el N-trmino (entre arginine 23 y valine 24) y el Ctrmino (arginine 322 y proline 324) sugiere que ni el llamado 'la cadena ligera'
ni los peptide C-terminales proline-ricos estn envueltos en la encuadernacin
de ZP. Esto ha sido inveterado por el aislamiento del 23 residuo nativo la
cadena ligera y la sntesis artificial del peptide. Significativamente, el
polyarginine, polylysine y polyhistidine tienen slo capacidad obligatoria dbil
como haga 20-mer y 30-mer peptides sintticos de arginine (el Jansen et al.,
1995). Esto es sugestivo de un requisito estructural secundario para ZP que
liga por el peptide (vea debajo). 4. El mecanismo de la interaccin involucra
reconocimiento de grupos del polysulphate en el glycoproteins de ZP por los
residuos bsicos en la superficie de proacrosin de una manera similar a eso
para el heparin-antithrombin III interacciones (Jones, 1991,; Urch y Patel, 1991,;
El Jin et al., 1997). Contrariamente a las demandas tempranas, ligando no

involucra el fucose y no es un lectin-como la interaccin. En el cerdo, todas las

tres clases de glycoproteins de ZP son los sulphated en sus mitades del hidrato
de carbono (el Nakano et al., 1990) y todo el tres lazo al proacrosin. Sin
embargo, no se requieren hidratos de carbono por el se por ligar excepto en la
medida en que cuando ellos mantienen un armazn polimerico repetidor la
presentacin de grupos del sulphate en la alineacin del stereochemical
correcta. L. Howes, R. Jones / el Peridico de Reproducti e Inmunologa

As, algunos polmeros del sulphated (por ejemplo el fucoidan, sulphate del
dextran 500 K, el galactan, el polyvinylsulphate) es competidores fuertes de
ZP-proacrosin que liga considerando que otros (por ejemplo el sulphates del
chondroitin, heparin) es los competidores muy dbiles. 5. ligando de grupos del
sulphate requiere la presentacin correcta de residuos bsicos positivamente
cobrados en la superficie del proacrosin. La modificacin qumica de arginines,
lysines e histidines con el phenylglyoxal, diethylpyrocarbonate o el anhdrido
del citraconic abole la encuadernacin completamente (el Jansen et al., 1995).
Estos reactivos, sin embargo, no son sitio-especficos, pero expresando
recombinants de la tachadura de proacrosin del jabal en las bacterias l ha
sido posible identificar un fragmento obligatorio mnimo representado por los
residuos 47 a 272 (Fig. 2). Sitio-dirigi mutagenesis de aminocidos
seleccionados dentro de este fragmento ha identificado algunos de los residuos
crticos involucrados, como histidine 47+arginine 50, 51 junto con arginine
250, lysine 252 y arginine 253 (el Jansen et al., 1998). Significativamente,
sustituyendo un racimo de lysines (73, 75,76,77) adyacente a histidine 47
ningn efecto lleva puesto ligando de ZPs. Moreno y Barros (2000) encuentre
que un peptide sinttico que representa los residuos 59 a 76 glycoprotein de
ZP inhibidos que ligan al proacrosin del jabal, apuntando a un papel para
arginines 66+67+histidine 69. En el acrosin del conejo, Richardson y O'Rand
(1996) tambin dedujo del mutagenesis estudia que histidine 47 era
importante para la encuadernacin de ZP. Los residuos anteriores, sin embargo,
son improbables ser los nicos involucrados en polysulphate que liga como el
stoichiometry de proacrosin-ZP glycoprotein ligar no es conocido. 6. el
descubrimiento que el suramin, un anticancer del sulphonated narcotizan, es
un competidor muy eficaz de proacrosin-ZP ligar ha proporcionado las visiones
en los requisitos del stereochemical de los grupos reaccionando (Jones el al del
et., 1996). UNA propiedad significante de suramin es que no penetra las
membranas celulares y por consiguiente no liga a los espermatozoos
acrosome-intactos. Desde que es muy eficaz bloqueando la fertilizacin en el
vitro, parece probable que que acta despus de la acrosome-reaccin que ha
tenido lugar cuando los volmenes del acrosomal son expuestos. No tiene el
efecto claro en la motilidad de esperma, ni induce la reaccin del acrosome.
Suramin es ahora de inters considerable como una herramienta por disecar
las interacciones del esperma-huevo mamfero. Sus mritos principales son: (i)

es un compuesto de peso molecular pequeo (Mr 1420) con una composicin

qumica bien-definida; (el ii) tiene una estructura simtrica (Fig. 3), una
propiedad que parece relacionado a su habilidad de cruz-unirse las protenas;
(el iii) el sulphonate se agrupa en el naphthalene terminal cerque las
estructuras son necesarias para la encuadernacin de afinidad alta; y (el iv) un
nmero grande de anlogo se ha sintetizado (el Jentsch et al., 1987)
permitiendo investigar los rasgos estructurales diferentes. Como resultado de
proteger 15 de estos anlogo en el ZP-proacrosin (el jabal) ligando

ensaye, fue encontrado que el compuesto del padre present el arreglo ptimo
(Jones el al del et., 1996). la Reduccin en el nmero de sulphonate terminal se
agrupa o quita de cualquiera de los anillos aromticos interiores caus una
prdida de actividad competitiva. El struc-ture tridimensional de suramin es
eso de un cucharn poco profundo o taza (el Adhikesovalu et al., 1988)
sugiriendo que es la distancia entre los anillos de naphthalene de sulphonated
terminales que son el rasgo importante por ligar a, y cruz-unindose, las
protenas. En el nivel celular, el suramin est muy eficaz inhibiendo la
fertilizacin en el vitro (Jones el al del et., 1996). 7. Immunodetection de
proacrosin/acrosin en la membrana del acrosomal interna y en los remanentes
de la matriz del acrosomal que sigue la reaccin del acrosome se ha
demostrado en el conejo, marmota y cuy (el Barros et al., 1992). sobre todo, En
el conejo podran descubrirse los acrosin en 25% de esperma recuperados del
espacio del perivitelline (el Valdivia et al., 1999), incitando la especulacin que
stos pueden ser la esperma que puede ligar a y fertilizar los huevos zonaintactos frescos (el Kusan et al., 1984). Proacrosin se conoce bien para ser un
inherentemente 'pegajoso' la molcula como l quiere
Fig. 1. Propuso a modelo de sucesin de eventos durante esperma-huevo que
liga en los mamferos. Una esperma capacitada penetra a travs del oophorus
del cmulo y llega en la superficie del pellucida de la zona (paso 1). La
esperma acrosome-intacta liga a los receptores primarios (el glycoprotein ZP3:
los pasos 2 y 3) sigui por la induccin de la acrosome-reaccin (paso 4). Esto
expone la matriz del acrosomal y en el futuro la membrana del acrosomal
interna. Ligando (paso 5) se mantiene va un receptor de ZP secundario (el
glycoprotein ZP2). La esperma del motile empieza a penetrar a travs del ZP y
en el futuro los accesos los perivitelline espacian dnde liga a un receptor
terciario (el integrin/CD9) en el oolemma (se reprodujo de Jones el al del et.,
1996). Fig. 2. la distribucin Lineal de elemento esencial y los aminocidos
agrios en la sucesin primaria de proacrosin del jabal. (Se reprodujo del Jansen
et al., 1995). Fig. 4. la estructura de cristal Tridimensional de acrosin del jabal
con el modelo transpuesto de suramin para ilustrar los tamaos moleculares
relativos. Sulphonate se agrupa en el suramin es la naranja coloreada (la
estructura de Acrosin deriv del Tranter et al., 2000).

ligue en general a las superficies de vaso, liposomes y membranas celulares

qu induce la activacin del contacto (el Parrish et al., 1978; Lo el Leggio et al.,
1994). no est claro qu propiedad es responsable para esta tenacidad clara
como las parcelas del hydropathy no revele ningn dominio del peptide
hidrfobo pronunciado (el Baba et al., 1989; El Klemm et al., 1990). hay
indicaciones fuertes No obstante, que el proacrosin/acrosin tiene el potencial
para actuar como un 'el puente' entre las clulas. 3. los rasgos estructurales de
proacrosin de esperma Dados la importancia de stereocompatibility entre el
proacrosin de esperma / el acrosin y el polysulphate se agrupa en el
glycoproteins de ZP por ligar, un anlisis del crystallographic de acrosin del
jabal fue emprendido para determinar la orientacin de la superficie de los
residuos importantes arriba expresado. De 20 mg de protena nativa
favorablemente purificada, se obtuvieron cristales que el diffracted a 2.1 UN y
de estos datos las estructuras tridimensionales fueron obtenidas por el anlisis
del reemplazo molecular (el Tranter et al., 2000). Cuando la molcula se gira
sobre el Y-eje, es posible demostrar que los racimos de residuos bsicos,
previamente identific por el mutagenesis sitio-dirigido ser involucrado ligando
(vea Seccin 2 sobre), aparezca en vueltas que proyectan del centro hidrfobo
de la protena y se posiciona para o estar al lado de del sitio activo (Fig. 4).
Significativamente, los intramolecular distancian entre los dos la mayora de
los racimos importantes aproxima al palmo entre el naphthalene cerca a las
extremidades de suramin (Fig. 3), haciendo pensar en un mecanismo para su
inhibicin competitiva de actividad del acrosin. Es decir, forma un puente por el
sitio activo que previene acceso de substrate. Aunque el suramin liga a una
variedad de protenas diferentes, muestra el proteases del serine respecto a a
algunos rasgos que distingue finamente interesantes. As, el suramin no inhibe
la actividad del trypsin y tiene slo un efecto dbil en el chymotrypsin, pero
fuertemente inhibe el elastase del neutrophil (y acrosin; El Cadene et al.,
1997). es posible que como el elastase, hay ms de un sitio de suraminencuadernacin en el acrosin y el anlisis extenso se exigir identificar stos.
4. la evidencia gentica por ligar de glycoprotein de ZP2 al acrosin de esperma
En el sistema del cerdo describi sobre, fue encontrado que todos los
glycoproteins de ZP limitaron a proacrosin/acrosin purificado inmovilizado en el
dotblots. Adems, FITC-labelled paren ZPs limit ms fuertemente a la esperma
de jabal de permeabilized (Jones, 1991) que a clulas intactas que sugieren
que en su estado nativo dentro del acrosome dnde es el complexed a los
inhibidores y L. Howes, R. Jones / el Peridico de Reproducti e Inmunologa 53
(2002) 181-192 189 varias protenas obligatorias, los proacrosin/acrosin
todava podran actuar recprocamente con ZPs. Hay evidencia buena
subsecuentemente en el ratn sugerir que el receptor secundario para la
esperma es ZP2 (el Bleil et al., 1988), puede predecirse que ZP2 ligar al
acrosin del ratn en la preferencia a otras protenas de esperma. Para probar
esta hiptesis, nosotros hemos comparado ligando de ratn [125I]ZP2 salvajeteclear (+/+) y knockout del acrosin (? /?) esperma que usa el autoradiography

del microscopio ligero. Fue encontrado que [125I]ZP2 lmite al permeabilized

pero no a esperma acrosome-intacta que est de acuerdo con las
observaciones por el Bleil et al. (1988). cundo el permeabilized (+/+) y (? /?)
la esperma fue comparada, hubo una 65% disminucin en el nmero de granos
colores de plata asociado con la cabeza de esperma acrosin-deficiente. Una
figura similar se obtuvo para la captacin de [3 H]suramin. Esto proporciona la
evidencia ms fuerte hasta ahora ese proacrosin/acrosin es la molcula de
ligand de esperma mayor para el receptor de ZP secundario, ZP2. La cantidad
pequea de ligar de [125I]ZP2 al acrosin (? /?) la esperma puede ser debida a
dos otros proteases del serine que los componentes mayores del acrosome del
ratn son (el pariente a otras especies, la esperma del ratn es muy deficiente
en el proacrosin). El hecho que ZP2 que liga al acrosin (? /?) la esperma est
muy reducida pero no aboli concurre con el hallazgo que el acrosin (? /?) la
esperma es capaz de fertilizar los huevos, aunque con la eficacia reducida (el
Baba et al., 1994; El Adham et al., 1997). No obstante, la habilidad de
[125I]ZP2 y [3 sondas de H]suramin para diferenciar entre el acrosin (+/+) y
(? /?) la esperma puede atribuirse a su afinidad por el proacrosin/acrosin. 5. las
Conclusiones hay por consiguiente, Actualmente, razones buenas para creer
que el proacrosin / el acrosin tiene un papel como una molcula obligatoria
secundaria. Es eficazmente el targeted a su sitio de accin el descargo
siguiente de la vescula del acrosomal y de est presente en el momento
apropiado y pone para actuar recprocamente con la superficie de la zona.
Dado los constreimientos fsicos agregados que las clulas del cmulo
circundantes llevarn puesto los movimientos de esperma, la formacin de
ataduras inicas entre el proacrosin/acrosin y glycoproteins de ZP (en el ratn,
especficamente ZP2) sera de tenacidad suficiente impedir a la esperma
destacar. Esto permitira tiempo la cabeza de esperma para comenzar la
penetracin de la zona. La habilidad del suramin de droga de ligar fuertemente
al proacrosin / el acrosin e inhibe esperma-zona ligando sugiere que los
mimetics seguros del compuesto tengan el potencial como agentes del
antifertility si solt cerca del sitio de fertilizacin, por ejemplo de IUDs largosuplente. 190 L. Howes, R. Jones / el Peridico de Reproducti e Inmunologa 53
(2002) 181-192 Reconocimientos Nosotros agradecemos el BBSRC el apoyo
financiero. Nosotros tambin agradecemos a John Coadwell (BI) para la ayuda
con el modelado molecular y los numerosos colegas en el laboratorio y en otra
parte quin ha contribuido a estos estudios durante varios aos.

2. ARCHIVO
Acrosin (CEE 3.4.21.10) es proteinase del serine localizado en el acrosome de
esperma y consider jugar un papel esencial en la fertilizacin. En contraste
con el mamfero, hay slo datos limitados acerca del acrosin del avian,
principalmente enfocado en la caracterizacin de enzima madura. En el estudio

presente, el acrosin se aisl de espermatozoos del pavo que usan la filtracin

de gel en la presencia de 4 urea de M al pH agrio. N-trmino que los
sequencing de Edman permitieron a la identificacin de los primeros 26
aminocidos del N-trmino: VVGGTEALHG SWPWIVSIQNPRFAGT. Esta sucesin
fue usada construir los cebadores y obtener una sucesin del cDNA de los
testculos. La sucesin del aminocido dedujo de las muestras del cDNA que el
acrosin del pavo se sintetiza inicialmente como el preproprotein con el 19residuo el peptide sealado. Esta sucesin sealada se sigue por una sucesin
del 327-residuo que corresponde al zymogen del acrosin. El proacrosin de
Turqua no contiene un segmento proline-rico a la porcin de Cterminal. El
acrosin del pavo maduro es una molcula de la dos-cadena que consiste en luz
y las cadenas pesadas y fue encontrado para ser el glycoprotein. El sistema del
proacrosin/acrosin existe en los espermatozoos del pavo y este sistema puede
activarse semejantemente a eso de mamferos. El valor alto de asociacin
constante fuertemente sugiere que la actividad del acrosin en los pavos puede
controlarse por un plasma seminal el inhibidor de Kazal bajo las condiciones
fisiolgicas. 2010 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados
1. la introduccin El acrosome es una nica vescula que rodea la parte anterior
de los espermatozoos encabece y contiene varios enzimas del hydrolytic entre
que el acrosin de proteinase de serine es el la mayora estudi la enzima del
acrosomal (el Chen et al., 1991). se considera que Acrosin juega un papel
esencial en la fertilizacin, reconocimiento, encuadernacin y penetracin del
pellucida de la zona del vulo (el Klemm et al., 1991). Acrosin se sintetiza y
guard en el acrosome de esperma como el proacrosin, un formulario del
zymogen inactivo. Durante la reaccin del acrosome, el proacrosin se convierte
en el acrosin maduro por un dos proceso de activacin de parte: la liberacin
de segmentos del proenzyme del C-trmino y hendidura de una atadura del
peptide que produce las cadenas ligeras y pesadas (el Baba et al., 1989a). El
papel de acrosin en el reconocimiento y ligando de sobres del oocytes nunca se
ha mostrado en los pjaros. En contraste con el mamfero, hay datos limitados
acerca del acrosin del avian. La presencia de actividad del trypsinlike en el
pavo y espermatozoos del pollo extrae se ha demostrado (Froman 1990; Ho y
Meizel; 1976, Richardson et al., 1988). el acrosin de Turqua fue aislado y
parcialmente se caracteriz (el Richardson et al., 1988; El Richardson et al.,
1992). los estudios de Inhibicin indicaron esa pavo acrosin amidase actividad
se inhibi por el aprotinin, ovomucoid, inhibidor de trypsin de soja,
benzamidine y cinc. Un mtodo clnico bas en la determinacin de actividad
de amidase de esperma de esperma
2. se perfeccionaron las suspensiones para la esperma del pavo (el Glogowski
et al., 2001). no hay informacin en la actualidad, acerca del sistema del
proacrosin/acrosin de espermatozoos del pavo, la estructura de protena del
proacrosin y su sucesin. Se relacionan diferencias en la evolucin de mamfero
y complemento de protease de pjaro principalmente a las funciones

inmunolgicas, de desarrollo, reproductores y neutras (el Quesada et al., 2010).

la Reproduccin es uno de los procesos ms dismil entre los pjaros y
mamferos. Se encuentran diferencias mltiples en gen del protease
involucrado la fecundacin y embrin saliendo del cascarn. Los Testin serine
proteinase y varios miembros del ADN la familia de metalloproteases (Adams
1-7 y ADN 30) envuelto en la fertilizacin en los mamferos est faltando en el
genome de pjaros. Por otro lado, el acrosin se conserva en los pjaros y
mamferos (el Berln et al., 2008). Los genomes de humano y pollo contienen
un solo gen del acrosin (ACR), sin embargo, el genome de pinzn de cebra
contiene siete non-en racimo ACR-como los genes. Por consiguiente, los
estudios acerca de la caracterizacin del acrosin son necesarios para definir
propiedades especie-especficas de acrosins vertebrado. Turqua el plasma
seminal contiene un inhibidor de trypsin de peso bajo-molecular que se
identific como un Kazal inhibidor familiar que puede inhibir eficazmente
trypsin-como las enzimas en el vivo (el S?owi?ska et al., 2008). los inhibidores
de Kazal presentan en el semen mamfero se llama los inhibidores del acrosin
(Laskowski y Kato, 1980). Ellos estn presentes en una concentracin alta en el
plasma seminal y tambin se atan a los espermatozoos aparezca (el Jonakova
et al., 1992). La funcin fisiolgica postulada principal de inhibidores de Kazal
es la proteccin de los tejidos reproductores, protenas del plasma seminales o
espermatozoos viables de la accin del proteolytic de acrosin
3. liber del acrosomes de muerto y da los espermatozoos (Laskowski y Kato,
1980,; Lessley y Broncea, 1978). es el unknownif Kazalinhibitors del semen del
avian, semejantemente a su colega mamfero, la actividad de acrosin de
mando bajo las condiciones fisiolgicas. La longitud de almacenamiento de
semen del pavo es muy restringida y normalmente despus de 24 h de
almacenamiento se observan disminuciones significantes en la viabilidad de
esperma y la capacidad fertilizando (el Clarke et al., 1982; Donoghue y Wishart,
2000). UN declive en la calidad de esperma es acompaado por los cambios en
el phospholipids (debido a su lysis), el metabolismo endgeno, o peroxidation
del lipid (el Douard et al., 2000; El Douard et al., 2004). En nuestro trabajo
anterior, nosotros mostramos que tambin se relaciona una disminucin en la
calidad de esperma de pavo durante el almacenamiento del shortterm a las
perturbaciones en la actividad de amidase de esperma, probablemente
conect a la activacin prematura de proteinases de serine de acrosomal (el
Kot?owska et al., 2007). Por consiguiente, es posible que el declive en la
calidad de semen de pavo y la fertilidad es causada por el proteolysis
desenfrenado en los espermatozoos. Se requiere conocimiento acerca de la
caracterizacin del sistema de proacrosin/acrosin de pavo y su mando por
entender bien de fisiologa de semen de pavo y la mejora de almacenamiento
de semen lquido. En el trabajo presente, nosotros demostramos la presencia
del proacrosin / el sistema del acrosin en los espermatozoos del pavo. La
estructura primaria de proacrosin del pavo deducida de la sucesin del

nucleotide del cDNA duplicado tambin se informa. Se describen caractersticas

de Physicochemical de acrosin del pavo. Ocurriendo el inhibidor del plasma
seminal naturalmente pueden controlar la actividad del acrosin potencialmente
bajo las condiciones fisiolgicas. 2. los materiales y mtodos 2.1. los Animales
y probando el Semen era rutinariamente reunido por el masaje abdominal (las
Madrigueras y Quinns, 1937) de los pavos (el gallopavo de Meleagris) de PERO
Grande-6 la lnea (los Pavos Unidos britnicos Limitaron, Chester, Inglaterra),
durante la estacin reproductor. Se mantuvieron Toms bajo las condiciones de
agricultura normales en la Turqua Testing la Granja en Frednowy, Polonia. El
semen agrupado prueba (0.5 mL) se centrifug a las 12,800g para 3 min para
separar los espermatozoos del plasma seminal. Se sujetaron los espermatozoos
a extracto de la protena que usa el mtodo descrito por el Richardson et al.
(1988). primero, la esperma se lav tres veces con 0.88% NaCl y centrifug.
Luego, las pelotillas de esperma eran que el resuspended en 0.5 mL de 4 urea
de M helados en el nitrgeno lquido, y deshel dos veces. Se pusieron las
suspensiones de esperma entonces en un bao de hielo, sonicated para 30 s
con VC-13 PB (Sonics, EE.UU.), ponga a 35% rendimiento relativo, y centrifug
para 3 min a las 12,800g. El extracto de esperma se prepar inmediatamente
antes de la purificacin en Superdex 200 X/K HiLoad 16/60 columna
(Amersham Bioscience, Uppsala, Suecia). se obtuvieron testculos Frescos
diseados por el cDNA duplicar de los pavos del PERO Grande-6 la lnea e
inmediatamente helado en el nitrgeno lquido y guard a ?80 C. La
aprobacin del Comit de los Experimentos Animal en Olsztyn, Polonia se
obtuvo antes de empezar cualquier experimento. 2.2. la activacin de
proteinase del serine de pavo espermatozoos Esperma extracto se prepar en
4 urea de M como descrito previamente y activ a 37 C en 0.3 M Tris-HCl, pH
8.0 para 4 h. A las diez se tomaron las muestras de intervalos de minuto y
sujetaron a una medida de actividad de amidase y al electrophoresis de SDSPGINA de gelatinolytic bajo la condicin de la non-reduccin. Benzamidine se
agreg a una concentracin de 20 mm a las muestras para SDS-pginagelatinase para detener la activacin de proteinase de serine. 2.3. la
purificacin de acrosin de los espermatozoos del pavo El extracto de esperma
frescamente preparado (1 mL) se filtr a travs de un 0.45 m poro tamao
jeringa filtro y el fractionated extenso por la filtracin de gel
4. (GF) el chromatography en Superdex 200 X/K HiLoad 16/60 columna. Las
protenas eran los eluted con 4 urea de M, pH 3.0 a 1 mL/min que usa un
sistema de FPLC (Amersham Bioscience), y descubri a 280 nm. Los
fragmentos obtenidos (1 mL) se protegi para la actividad de amidase de
acrosin y descubrimiento del electrophoretic de actividad del gelatinase. Se
sujetaron los fragmentos Acrosin-conteniendo a la medida de la asociacin de
equilibrio constante para los complejos del acrosin-inhibidor y autoactivation.
Adicionalmente, los fragmentos del acrosin obtuvieron despus de que
filtracin de gel que us el chromatography de la fase inverso se purific (RPC)

en el sistema de HPLC. El lyophilized fracciona de acrosin se disolvi en 0.1%

cido del trifluoroacetic (TFA, Fluka, Buchs, Suecia), se filtr a travs de un 0.22
m poro tamao jeringa filtro y ms all purific en la columna de BioBasic8
(el Hypersil-clave de Thermo, Runcorn, Reino Unido) equilibr con 0.1% TFA.
Las protenas limitadas eran los eluted con una pendiente lineal (0%-75%) de
80% acetonitrile (Merck, Darmstadt, Alemania) y 0.07% TFA (la proporcin de
flujo 1 mL/min). El acrosin estaba el eluted en un rango de 48%-51%
acetonitrile. Las crestas del eluted eran los lyophilized. Los fragmentos
obtuvieron despus de que se usaron RPC para la determinacin de sucesiones
del N-trmino de acrosin y spectrometry de masa. 2.4. Autoactivation de
filtracin de gel fracciona Los fragmentos de GF se protegieron para el
proacrosin por la activacin al proteinases activo. Autoactivation se realiz por
la incubacin a 37 C para 3 y 24 h a pH 8.0. Despus de que se tomaron las
muestras de activacin y sujetaron a la medida de actividad de amidase y al
gelatinolytic el electrophoresis de SDSPAGE bajo la condicin de la nonreduccin. Se esper aumento de actividad del amidase como el indicador de
activacin del proacrosin. 2.5. los mtodos analticos La concentracin de la
protena era moderada por el Lowry et al. (1951) y Bradford (1976) usando los
reactivos de la Sigma-Aldrich Qumicos Ca. (St Louis, MO, EE.UU.) y albmina
de suero bovina como la norma. La actividad de amidase de esperma era
moderada segn el mtodo descrito por Geiger y Fritz (1983) con
modificaciones descritas por el Ciereszko et al. (1996a, 1996b), usando N -? - el
benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) como un substrate. Una unidad (U)
de actividad del amidase se define como la cantidad de enzima que hydrolyzes
1? el mol L?1 BAPNA/min a 25 C. El descubrimiento de Electrophoretic de
actividad del gelatinase se realiz segn el themethod de Siegel y Polakoski
(1985) como previamente describi (el Kot?owska et al., 2005, 2007). los
Alcuota (0.2? la protena de g) de extracto de esperma estaba bien cargado en
cada uno (Fig. 1). las geles se lavaron a la temperatura del cuarto con 2.5%
Tritn X-100 para 40 min Despus del electrophoresis, incub en la solucin de
desarrollo (50 mm Tris-HCl el pH 7.5 ms de color de ante, conteniendo 200
mm NaCl, 0.02% Tritn X-100) para 1 h a 37 C. Las vendas de la protena
despus de que GF fueron identificados por el SDS-PGINA bajo las condiciones
de la non-reduccin en 10% tabla gelifiqese (Laemmli, 1970). los Alcuota (50?
la protena de g) de extracto de esperma y 15? la protena de g de fragmento
de GF est bien cargada en cada uno (Fig. 2). la actividad de Antitrypsin se
evalu por la inhibicin de actividad de amidase de trypsin bovina segn el
mtodo de Geiger y Fritz (1983) con modificaciones previamente descritas (el
Ciereszko et al., 1996a, 1996b,; El Ciereszko et al., 1998). la actividad de
Antitrypsin despus de la PGINA (10% polyacrylamide se gelifican) se
identific usando el trypsin bovino (Sigma) segn Uriel y Berges (1968) como
descrito previamente (el Kot?owska et al., 2005). los Alcuota (20? la protena
de g) de plasma seminal y 7? la protena de g de fragmento de GF est bien
cargada en cada uno (Fig. 3). el electrophoresis Siguiente, las geles se

incubaron a 37 C para 15 min con el trypsin bovino en 0.1 M fosfato pulidor

(pH 7.4) y entonces transfiri en una solucin que contiene un substrate del
chromogenic (el acetylDL-phenylalanine -? - el ester del naphthyl) para el
trypsin. Se guardaron las geles manchadas en 2% cido actico. Las zonas que
poseen la actividad inhibitoria contra las enzimas escogidas aparecen como las
vendas del unstained en un fondo coloreado.
5. 2.6. la determinacin de sucesin del N-trmino de acrosin Los fragmentos
concentrados de acrosin despus de que se disolvieron RPC en HPLC grade el
agua (Sigma). las Muestras eran hervido y sujetaron al SDS-PGINA del tristricine (Schagger y von Jagow, 1987) y electroblotted hacia una membrana de
PVDF que usa 10 mm 3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonoic cido-NaOH (pH
11.0) conteniendo 10% metanol. La membrana se manch en 0.1% Coomassie
R-250 Azul Inteligente en 40% metanol y 1% cido actico y destained en 50%
metanol.
El N-trmino protena sucesin anlisis se realiz a BioCentrum S.A.. (Cracovia,
Polonia). El secuencialmente se identificaron derivado del phenylthiohydantoin
aislados de aminocidos usando el Procise 491 (Biosystems Aplicado, Ciudad
Adoptiva, CA, EE.UU.) el sistema de anlisis de sucesin automtico, segn el
protocolo normal del fabricante. Se realizaron las comparaciones de la sucesin
usando la base de datos SWISSProt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). 2.7.
Duplicando y sequencing de proacrosin Los testculos del pavo frescos estaban
cortados en los pedazos pequeos e inmediatamente helado en el nitrgeno
lquido. El tejido era el grinded en el nitrgeno lquido a un polvo fino con un
mortero y el majadero sigui por NucleoSpin fltrese la homogeneizacin
(Macherey-Nagel, Alemania). ARN Total de aproximadamente 40 mg de tejido
roto que us NucleoSpin ARN II Equipo se purific (Macherey-Nagel). La
cantidad e integridad del ARN total fueron verificadas por el agarose del
formaldehdo gelifiqese el electrophoresis. Identificar el cDNA del proacrosin,
un juego de cinco degenerado y cebadores del nondegenerate se dise
basado en la sucesin del polypeptide parcialmente conocida de la protena y
protenas acrosin-relacionadas de la base de datos de EMBL. El cDNA que us
el Exponente III se sintetiz
6. el transcriptase inverso (Invitrogen, EE.UU.) con el poly-dT(20) cebador que
usa 5 g de ARN total como una plantilla. De seis reacciones que ocurrieron en
el experimento, el par de cebador de MO1-F y cebador de MO2-R (Mesa 1) dio
un producto de PCR dominante de 576 bp. El producto se purific de la gel del
agarose, duplicada en el vector del pCR4-TOPO, y sequenced. Todas las
reacciones de PCR se realizaron con FastStart la Fidelidad Alta Taq Polymerase
(Roche, Alemania). Los 5? y 3? La RAZA se realiz segn Frohmann (1993).
Basado en la sucesin parcial de proacrosin, un juego de 5?RACE cebadores de
la marcha atrs y 3?RACE cebadores delanteros se dise (Mesa 1). La sntesis
de cDNA de 5? g del ARN total que us el cebador de Acro51 en 5?RACE se

realiz y adaptador-oligo-dT(17) los cebadores en 3?RACE. Despus de la 5?

RACE reaccin de RT, los cebadores, nucleotides y sales estaban alejadas por el
ultrafiltration las columnas de Microcon-100 encendidas (Millipore, EE.UU.), con
el agua del miliQ-calidad estril para la dilucin. El cDNA purificado que us el
transferase terminal se fue detrs de (Promega, EE.UU.) en la presencia de
0.25 dATP del mm a 37 C para 10 min. La segunda cuerda de cDNA que us se
sintetiz adaptador-dT(17) el cebador. Despus de la suma de adaptador y
cebadores de Acro52, la primera 5?RACE reaccin se realiz, sigui por PCR
"semi-anidado" que usa el cebador de Acro53 y cebador del adaptador. El
producto discreto fue purificado y duplic en el vector de sequencing de pCR4TOPO. El 3?RACE producto se amplific despus de la suma de cebador de
Acro31 y cebador del adaptador a 3?RT cDNA. Entonces el cebador de Acro32 y
el cebador del adaptador se us en PCR "semi-anidado." El producto especfico
fue purificado y duplic en el vector del pCR4-TOPO. Todos los DNAs se
analizaron por el sequencing (el Laboratorio de Sequencing, el Instituto de
Bioqumica y Biofsica, la Academia polaca de Ciencias, Varsovia, Polonia). La
traduccin de una sucesin del nucleotide a una sucesin de la protena que
us se realiz el Traduzca el Programa (http://us.expasy.org/tools /
7. dna.html). El peptide sealado putativo era el usando determinado el
SignalP 3.0 programa (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP /) segn el
Nielsen et al. (1997). el peso molecular e isoelectric apuntan de la protena
traducida era los usando calculados el ProtParam Toll el programa
(http://us.expasy.org/tools/protparam.html). la Posttranslational modificacin
prediccin de N -, los sitios de O-glycosylation eran el usando determinado el
NetNGlyc 1.0 Servidor segn el Gupta et al. (en la preparacin)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc /) y NetOGlyc 3.1 Servidor segn el
Julenius et al. (2005) (http://www.cbs. dtu.dk/services/NetOGlyc /). se predijeron
cleaved de sitios de hendidura Potenciales por el trypsin usando a Cortador de
Peptide segn el Gasteiger et al. (2000)
(http://www.expasy.ch/tools/peptidecutter /).
8. 2.8. la determinacin de masa molecular la masa Molecular era
spectrometry de masa usando determinado llevado a cabo en un Bruker
Escudero 3000 Ventaja la Ionizacin de Electrospray (ESI) el ion trampa masa
espectrmetro (Burker-Daltonics, Bremen, Alemania) en el Laboratorio Regional
de Anlisis de Physicochemical y la Investigacin Estructural (Cracovia,
Polonia). 2.9. la Determinacin de punto del isoelectric El punto del isoelectric
era determinado por el isoelectric que enfoca (IEF). El isoelectric que enfoca de
acrosin se llev a cabo bajo non que desnaturaliza las condiciones en las geles
de IEF listas con un rango del pH de 5-8 con el ctodo y nodo los pulidores de
IEF (Bio-Rad, Hoefer, San Francisco, CA, EE.UU.) para 2.5 h en el total,
empezando con el voltaje constante de 100 V para 1 h,

9. aumentando entonces a 250 V para el prximo 1 h y a 500 V para 30 min.

Para la calibracin de la pi el IEF marcador equipo (Bio-Rad) se us. Isoelectric
apuntan de acrosin se estim con el uso del Kodak 1D programa (la Eastman
Kodak Compaa, Nuevo Haven, CT, EE.UU.). 2.10. el Descubrimiento de mitad
del glycan el Glycoprotein manchando se realiz despus del SDS-PGINA. La
gel se manch con GlycoProfile III solucin manchando segn el protocolo del
fabricante (Sigma). 2.11. la Medida de la asociacin de equilibrio constante
(Ka) para el complejo de inhibidor de acrosin-Kazal que Acrosin-contiene el
fragmento despus de que GF que us UTube Concentrators se concentr
(Millipore) a 5000 U/mL de actividad del amidase. La concentracin del acrosin
era calculada por el titration del sitio activo con el pnitrophenyl-p?guanidinebenzoate (NPGB) usando el mismo procedimiento en cuanto al
titration del trypsin (la Persecucin y Shaw, 1967). apareca que 4 M urea
presente en la muestra del titration que acta recprocamente con las causas
de NPGB una disminucin en la concentracin de la enzima calculada. Los
titration del sitio activos de trypsin bovino en la presencia de urea mostraron
una prdida de concentracin del trypsin de aproximadamente 50% (datos no
mostrados). Por consiguiente nosotros aumentamos la concentracin del
acrosin obtenida en la presencia de urea por 50%. Las concentraciones de
inhibidor de Kazal del plasma seminal eran determinadas por el titration con el
titrated el trypsin bovino. Se aislaron inhibidores de Kazal usados para la
medida de Ka del pavo el plasma seminal segn el S?owi?ska et al. (2008). la
asociacin de equilibrio constante (Ka) los valores eran determinados en 0.1 M
Tris-HCl, 0.005% Tritn X-100, pH 8.3 a 25 C que usan el mtodo de Green y
Trabajo (1953) como descrito por Empie y Laskowski (1982). Las
concentraciones de la enzima [E0] us cumplido con la ecuacin 2b[E0]
Kab50, y las concentraciones de inhibidores [I0] fue de 0 a 2 [E0]. Aument
se agregaron cantidades de inhibidores a una concentracin constante de
trypsin y despus de 15 min de incubacin la actividad de la enzima residual el
usando moderado una produccin del substrate era N -? - el benzoyl-DLarginine-p-nitroanilide (Sigma) cuya ltimo concentracin en el medio de la
reaccin no excedi 0.2 Km. Las medidas cinticas estaban hecho en 405 nm
para 210 s. 2.12. las Copias y el anlisis estadstico Los valores Ka sea
calculado por el algoritmo del tres-parmetro [E] = el f(E0, Ka, F) usando el
programa de anlisis de regresin non-lineal GraFit 3.01 (el Software de
Erithacus S.A., Middlesex, Inglaterra), segn la ecuacin: E = donde [E0] y
[I0] es la enzima total y concentraciones del inhibidor, respectivamente,; [E] es
la concentracin de la enzima residual, el andF es el enzima inhibidor
equimolarity factor. Este experimento se haba reproducido tres veces
independientemente. El experimento de activacin se haba reproducido dos
veces. Las medidas todo bioqumicas eran hecho en el duplicado. 3. resulta
3.1. el Efecto de tiempo de la incubacin en la actividad del amidase y
geltinases de pavo esperma extracto Incubacin al pH 8.0 actividad del
amidase aumentada inducido de extracto de esperma de pavo (Fig. 1A). La

actividad del amidase ms alta se encontr a 110 min de incubacin y la

actividad al punto de tiempo era superior aproximadamente 2 veces que en
momento 0. se muestran Los cambios de perfiles del electrophoretic de
actividad del gelatinolytic al mismo tiempo inFig 1B. Tres formularios
10.
los formularios de gelatinase estaban presentes en el extracto de
esperma en momento 0. Despus de 10 min de incubacin una venda adicional
de masa molecular 28 kDa aparecan y los gelatinase con una masa molecular
de 30 kDa parecan aumentar su intensidad. Nosotros asumimos que la venda
de masa molecular de 30 kDa represent un formulario activo de acrosin y se
sujet a la purificacin extensa (vea debajo). Los gelatinase de una masa
molecular de 33 kDa desaparecieron gradualmente durante el tiempo de la
incubacin (Fig. 1B). La intensidad de los 41 gelatinase del kDa pareca
disminuir con tiempo pero no desapareci completamente durante el tiempo
de la incubacin. Todos los gelatinases se inhibieron por el benzamidine (datos
no mostrados). 3.2. el Aislamiento de acrosin de los espermatozoos del pavo e
identificacin de inhibidor de Kazal en el extracto de esperma El procedimiento
de aislamiento de uno-paso llev a un aumento del 5.8-pliegue de acrosin
purificado con un rendimiento de 24%. Gelifiqese la filtracin en las
condiciones agrias era necesario limitar la activacin de proacrosin y la
generacin continua de formularios del intermedio de acrosin durante el
proceso del chromatography. Este procedimiento nos permiti separar el
acrosin de ms protenas de esperma e inhibidores (Fig. 2A, B). despus de que
la filtracin de gel nosotros obtuvimos dos fragmentos de actividad del
amidase (Fig. 2A). El primer fragmento (FI) se caracteriz por la ms bajo
actividad del amidase, y el segundo fragmento (FII) se caracteriz por el trespliegue la actividad del amidase ms alta que el de FI y contuvo una venda de
la protena dominante (sendas 77-83 en Fig. 2B) qu fue confirmado para ser el
acrosin despus. Por consiguiente, FII se us para el physicochemical extenso y
el anlisis cintico. Despus de FII la cresta de actividad del antitrypsin era el
eluted (vea debajo, los Higos. 2A y 3). El fragmento de actividad del antitrypsin
contuvo dos inhibidores de proporcin de migracin moderada y rpida que
podra visualizarse por el zymography inverso. La proporcin de migracin de
inhibidores caracterizados estaba igual que los inhibidores de Kazal del pavo el
plasma seminal (Fig. 3). 3.3. la Activacin de fragmentos obtuvo despus de
que la filtracin de gel Fracciona me e II obtenidos despus de que la filtracin
de gel se sujet a la activacin. FI contuvo que dos proteolytic muy intensivo
ata con las masas moleculares de 33 y 41 kDa. FII contuvo las vendas
adicionales con una masa molecular de 30 kDa. Despus de la activacin en FI,
se observaron dos vendas de actividad del proteolytic: las vendas con las
masas moleculares de 30 y 41 kDa. Slo la venda con una masa molecular de
30 kDa era visible en FII despus de la activacin (Fig. 4). se encontr Ningn
aumento en la actividad del amidase en FI y FII despus de la activacin (datos
no mostrados). 3.4. el N-trmino de sequencing de aminocido los sequencing

de Edman de la protena principal de FII nos permitieron identificar los primeros

26 aminocidos del N-trmino: VVGGTEALHGSWPWIVSIQNPRFAGT. Esta
sucesin muestra una similitud alta al avian y acrosin del mamfero (vea la
Discusin). 3.5. ADN Complementario que duplica Los identificamos 26
sucesin del aminocido de acrosin fue usado construir los cebadores y
obtener una sucesin del cDNA de los testculos del pavo (Fig. 5). se
depositaron Los nucleotide y sucesiones del aminocido en el EMBL la
Nucleotide Sucesin Base de datos bajo el nmero de asentimiento AM167974
y CAJ45027, respectivamente. El cDNA de cuerpo entero del acrosin era 1240
bp anhelan, incluso una regin de untranslated de 5?-trmino (UTR) de 20 bp,
un 3?-trmino UTR de 179 bp con un polyadenylation cannico la sucesin
sealada AATAAA y poly(A) la cola (Fig. 5). UN codon de ATG putativos y un
codon de la parada que se localizaron TAA al nucleotides 21 y 1059,
respectivamente. El marco de lectura abierto se predice para poner en cdigo
una protena de 346 aminocidos con una masa molecular calculada de
37,950.1 Da y pi 7.60. Hydrolysis de un peptide sealados putativos (el ms
probablemente el sitio de la hendidura entre las posiciones 19 y 20: GHG-FS)
debe producir una protena madura que contiene 327 aminocidos, mientras
consistiendo en luz y las cadenas pesadas (los residuos
11.
1-21 y 22-327, respectivamente) con una masa molecular calculada de
36,0517 kDa y pi 7.33. Un sitio de N-glycosylation potencial est presente en
Asn 128 y tres sitios de O-glycosylation potenciales estn presentes en Thr
184, Thr 300 y Thr 312. 3.6. el anlisis de la homologa de acrosin del pavo La
sucesin de acrosin del pavo era muy similar al cDNA de proacrosin de avian:
la guinea el ave (el meleagris de Numida), la codorniz comn (el coturnix de
Coturnix), pato del pato silvestre (el platyrhynchos de Anas), 84%, 64% y 62%
identidad, respectivamente (Fig. 6). UNA 44%-47% identidad se encontr al
acrosins de la arpa del elefante (el proboscideus de Macroscelides), llama (el
glama de Lama), elefante (el africana de Loxodonta, rufescens de
Elephantulus) y acrosin del antlope (el angarii de Tragelaphus). UNA 45%
identidad se encontr en el acrosin humano (el sapiens de Homo). Estas
identidades incluyen la regin del sitio activa, substrate el sitio obligatorio y la
situacin de cysteine. 3.7. las caractersticas de Physicochemical La masa
molecular de acrosin estimada por el spectrometry de masa era 30,874 kDa.
Los isoelectric apuntan de acrosin estimado con el isoelectric enfocar fue
determinado para ser 6.4. Acrosin se manch positivamente para la presencia
de hidratos de carbono con un equipo de descubrimiento de glycoprotein
fluorescente (datos no mostrados). 3.8. La asociacin de equilibrio constante
(Ka) para el inhibidor del acrosin-Kazal complejo La inhibicin de acrosin de
esperma de pavo por Kazal el inhibidor del plasma seminal se muestra en Fig.
7. La asociacin constante (Ka) fue determinado para ser 7.6107 M?10.65.
4. la Discusin En el estudio presente, el acrosin de los espermatozoos del pavo
fue purificado y se caracteriz. Nosotros identificamos los primeros 26

aminocidos del N-trmino de una cadena pesada de acrosin y entonces

usamos esta informacin para construir los cebadores y obtener cDNA de
proacrosin del avian para el primero
12.
tiempo. El pavo esperma proacrosin-acrosin sistema fue identificado y se
obtuvieron caractersticas del physicochemical de acrosin. El valor alto de
asociacin de equilibrio constante para el plasma del acrosin/seminal el Kazal
inhibidor complejo era determinado qu indica ese acrosin del pavo pueden
inhibirse eficazmente por un inhibidor del plasma seminal naturalmente
ocurriendo como descrito por el S?owi?ska et al. (2008). el extracto de acrosin
de los espermatozoos del pavo pareca ser ms difcil comparado con los
procedimientos normales para la esperma mamfero. La urea y sonication eran
necesarios extraer el acrosin de los espermatozoos del pavo (el Richardson et
al., 1988). UN extracto difcil de acrosin de los espermatozoos del pavo refleja
la fisiologa de esperma de pavo probablemente e indica ese acrosin se ata
fuertemente a los espermatozoos que ya se indicaron por el Richardson et al.
(1988). el extracto de espermatozoos del pavo con 4 la urea de M nos permiti
obtener niveles altos de actividad del amidase (5000 U/l). el Richardson et al.
(1988) sugiri que este mtodo de extracto produca el acrosin en su
formulario activo pero no como un zymogen. Por consiguiente, estos autores
concluyeron que ese acrosin est presente en la esperma del pavo en el
formulario activo. Sin embargo, contrariamente a su trabajo nosotros pudimos
activar el sistema del proteolytic de extractos de esperma de pavo y demostrar
la presencia de vendas que corresponden al proacrosin (41 kDa) y el
intermedio forma de acrosin (33 kDa)? - el acrosin (30 kDa) y productos de la
avera de? - el acrosin (28 kDa). En la conclusin, nuestros resultados sugieren
fuertemente que el sistema del proacrosin-acrosin existe en los espermatozoos
del pavo y este sistema se parece la activacin del proacrosin mamfero (el
Baba et al., 1989a; El castao y Hartree, 1978,; El Eberspcher et al., 1991;
Meizel y Mukerji, 1975,; Meizel y Mukerji, 1976,; Polakoski y Parrish, 1977). Esta
conclusin se apoya por el anlisis de sucesin de cDNA (vea debajo). Nuestro
estudio demostr eso adems del proteinase de serine de acrosin otra enzima
est presente. Nuestro estudio tambin demostrado eso de otra manera que el
proteinase de serine de acrosin est presente en el extracto de esperma de
pavo. Este proteinase se represent por una venda con una masa molecular de
41 kDa (similar al proacrosin). Nosotros no pudimos activar ese proteinase con
el procedimiento que era eficaz para el acrosin de fragmento II. Esto sugiere
que este protease represente una enzima diferente que el proteinase de serine
de acrosin de espermatozoos del pavo. Varios proteinases de serine de
acrosomal de otra manera que el acrosin estn presentes en la varios esperma
mamfero (el Honda et al., 2002). Algunos de ellos se han aislado y
13.
caracterizado, como: el protease de esperma bovino, proteases de serine
de testicular, protease de esperma CTAB-extrado, y sperminogen (el Akama et
al., 1994; El Cesari et al., 2005; El Kohno et al., 1998; Yu y Yi, 2001). El papel

biolgico de estas enzimas no se ha identificado todava. Los estudios futuros

deben enfocar en la identificacin del proteinase del serine antedicho del
extracto de esperma de pavo y el establecimiento de su relacin al acrosin.
14.
En nuestro estudio los fragmentos de filtracin de gel despus de que la
activacin no mostr un aumento en la actividad del amidase aunque la
conversin para madurar formulario de acrosin fue observada (Fig. 4). Estos
resultados sugieren que cualquier proacrosin del pavo se volviera inactivo al pH
agrio o la mayora de la activacin del proacrosin ocurri durante el extracto y
preparacin del extracto para gelificarse la filtracin. Para este mtodos de
aislamiento de razn solicitados el acrosin mamfero no podra usarse para el
proacrosin del pavo. Sin embargo, gelifiqese la filtracin al pH agrio pareca
un mtodo eficaz para ser para el aislamiento de? - el acrosin del extracto de
esperma de pavo. El pH agrio tambin limit la generacin de formularios
mltiples de una enzima. El procedimiento de aislamiento de uno-paso era
eficaz y produjo la preparacin del acrosin como una una venda de la protena
durante el electrophoresis del SDS-PGINA. La sucesin de acrosin del pavo era
homloga a sucesiones de cDNA de avian atribuidas a la protena del
proacrosin (el asentimiento no. ABQ39998; ABQ39999; ABQ4000). la
Informacin acerca de la caracterstica de protena de proacrosin de avian no
est disponible qu lmites el anlisis comparativo de nuestros resultados. Sin
embargo, los acrosin del pavo revelaron una identidad alta al acrosin mamfero.
Estas identidades incluyen sucesiones favorablemente conservadas que rodean
la regin del sitio activa, substrate el sitio obligatorio y la situacin de
cysteines. Esto permite el anlisis de la sucesin de acrosin de pavo en base a
la estructura de acrosins mamfero como descrito por el Baba et al. (1989a). es
probable que el acrosin del pavo, similar al acrosin mamfero, est compuesto
de luz y las cadenas pesadas. El N-trmino los sequencing de Edman de acrosin
del pavo mostraron una similitud alta a la cadena pesada de acrosin mamfero
(Fig. 6) y con tal de que la evidencia directa para la presencia de la cadena
pesada en el acrosin del pavo. El anlisis de la pavo acrosin cDNA sucesin
indica eso delante de la sucesin de Nterminal obtenida de la cadena pesada
hay 21 aminocidos adicionales con un modelo notablemente similar de
homologa de la sucesin al acrosin mamfero alrededor del residuo del
cysteine Cys8-Gly-Leu-Arg11 y Arg 21(Fig 6). Esto sugiere que el acrosin del
pavo - similar al acrosin mamfero - es una molcula de la dos-cadena que
consiste en las cadenas ligeras y pesadas (los residuos 1-21 y 22-327,
respectivamente). puede asumirse que la cadena ligera se sintetiza como una
extensin del N-trmino del acrosin maduro y est separado de la cadena
pesada durante la activacin del zymogen. Es probable que la cadena ligera
sigue siendo covalently atado a la cadena pesada por dos ataduras del
disulfide. La situacin de cysteines que forma el disulfide une entre la luz y las
cadenas pesadas son homlogas al acrosin mamfero y sugieren que dos
cysteines en la cadena ligera a los residuos 5 y 8 formulario el disulfide del

interchain une con dos cysteines en la cadena pesada - probablemente los

residuos 127 y 135. En la cadena pesada de acrosin pueden identificarse varios
residuos caractersticos. La sucesin del N-trmino: VVGG, es indicativo de un
proteinase del serine activados (el Baba et al., 1989a). El proteolytic que el
sitio activo segmenta que se localizan Suyo, Asp y Ser en esta cadena a
posiciones 66, 115 y 215, respectivamente. El residuo de Asp que acta como
un sitio del reconocimiento para el hydrolysis de ataduras del peptide que
contienen Arg o Lys (el Baba et al., 1989a), est presente a residuo 209. Se
forman cuatro ataduras de disulfide de interchain probablemente dentro de la
cadena pesada entre los residuos del cysteine apropiados (entre los residuos
51 y 67, 149 y 221, 184 y 200, y 211 y 241). Cys 301 est probablemente
alejado durante la maduracin del acrosin. Resumiendo, sucesiones
favorablemente conservadas que rodean la regin del sitio activa, el substrate
el sitio obligatorio y la situacin de cysteines estn presentes en la cadena
pesada de acrosin del pavo. El mecanismo de la maduracin de zymogen del
acrosin, el proacrosin del jabal particular, se ha descrito bien para los
mamferos (el Baba et al., 1989a). el proacrosin del Jabal se convierte para
madurar el acrosin por la hendidura de la atadura de Arg23-Val24 despus del
levantamiento del segmento de 14-residuo de C-trmino, mientras produciendo
la formacin de las cadenas ligeras y pesadas. Esta molcula de la dos-cadena
se convierte entonces a la enzima madura por el levantamiento del C-trmino
18 - y segmentos del 43-residuo. Se localizan los sitios de la hendidura en el
segmento del C-trmino al residuo Lys365 - Arg366 y Arg383-Ser384. Estas
hendiduras podran catalizarse por
15.
el acrosin y/o trypsin. Slo hendidura al residuo Arg322-Pro323, la ltima
fase de activacin, puede llevarse a cabo por el acrosin, desde que el trypsin
es incapaz de fraccionamiento que este peptide unen. Un grado alto de
similitudes de la sucesin entre el pavo y el proacrosin del mamfero nos
permite predecir ambos N - y sitios de hendidura de C-trmino de proacrosin
del pavo durante el proceso de la maduracin. El N-trmino
16.
la hendidura se localiza entre Arg21 y Val22 cuando nosotros
describimos antes. Esta hendidura generara una cadena de luz de 21-residuo y
ms tiempo la cadena pesada. Tambin, all el arefive los sitios de la hendidura
potenciales en la porcin del C-trmino de cleaved de proacrosin de pavo por el
trypsin (Lys326-Ala 327, Arg 309 - Glu310, Lys307-Leu308, Arg 273-Thr274 y
Arg265-Ala266). Los sitios de la hendidura mencionados son diferentes de
aqullos descritos para el proacrosin mamfero. Es en la actualidad incierto qu
de estas ataduras es la hendidura durante la activacin. Sin embargo, nosotros
tambin identificamos la atadura de la hendidura Arg246-Pro247 cuya
hendidura fue la ltima fase de activacin de proacrosin del jabal. Por
consiguiente, la maduracin de acrosin del pavo as como el de mamfero se
lograra por la hendidura del Arg - En pro de la atadura. Los estudios extensos
son necesarios proporcionar la informacin detallada acerca de la pavo

proacrosin activacin senda. Informacin presentada sobre indic una similitud

llamativa entre la estructura general de pavo y sistemas de proacrosin-acrosin
de mamfero. Hay diferencias pronunciadas en la biologa de la reproduccin
entre los avian y mamferos y es extrao que estas diferencias no se reflejen
en la estructura y activacin del sistema del proacrosin. Sin embargo, la
similitud entre el pavo y el acrosins del mamfero est de acuerdo con la
sugerencia por el Berln et al. (2008) que la evolucin molecular de genes del
gameto-reconocimiento entre los pjaros y los mamferos no son
dramticamente diferentes. Como el acrosin del pavo anterior, maduro
establecido 246 aminocidos deben contener en dos cadenas, el 21-residuo la
cadena ligera y 225-residuo la cadena pesada. Los isoelectric apuntan y la
masa molecular de acrosin del pavo calcul de la sucesin era 6.41 y 26.9495
kDa, respectivamente. El punto del isoelectric estim a travs de isoelectric
que enfoca (6.4) estaba de acuerdo con el valor de la pi calculado. La masa
molecular de acrosin medida por el spectrometry de masa (30,874 kDa) era
superior 3.924 kDa que la masa molecular calcul de la sucesin. Esta
diferencia los resultados probables del glycoprotein estructuran de acrosin que
se encontr en este estudio y tambin se ha demostrado por el Richardson et
al. (1988) para el acrosin del pavo. El anlisis de sucesin del cDNA indic ese
acrosin del pavo contiene un N potenciales - y un sitios de O-glycosylation
potenciales. Los estudios extensos son necesarios caracterizar la naturaleza del
glycoprotein de acrosin del pavo con respecto a la estructura de la cadena del
hidrato de carbono y su conexin a la cadena de la protena de la molcula del
acrosin.
17.
Un rasgo caracterstico de proacrosin mamfero es la presencia del
segmento proline-rico localizada a la porcin del C-trmino (el Baba et al.,
1989a; El Baba et al., 1989b). Las funciones de proline repiten no se ha
definido bien. El Baba et al. (1989a) sugiri que la presencia del segmento
proline-rico a la porcin del C-trmino de proacrosin puede relacionarse a un
grado alto de hydration necesario para una concentracin alta de proacrosin
(1.6 mm) en el acrosome del jabal. El segmento proline-rico est apagado
hendido durante la conversin de proacrosin madurar formulario de acrosin. Es
interesante que ese proacrosin del pavo no contiene el segmento proline-rico.
Las Proacrosin cDNA sucesiones de otras especies del avian tampoco contienen
el proline repite a la porcin del C-trmino (el asentimiento no. ABQ39998;
ABQ39999; ABQ4000). Como Raterman y Springer (2008) sugiri, exon pueden
sujetarse 5 cdigos para la regin proline-rica a un rgimen de la seleccin
diferente que el resto de la protena. Es posible que esta regin est
evolucionando rpidamente mientras se conservan la regin del sitio activa y la
situacin de cysteines. Una falta del segmento proline-rico localizada a la
porcin del C-trmino de acrosin del avian parece ser distinta para el acrosin
del avian. La importancia de este fenmeno es en la actualidad incierta.
Turqua el plasma seminal contiene un inhibidor de trypsin de peso molecular

bajo que se identific como un Kazal el inhibidor familiar (el S?owi?ska et al.,
2008). El mecanismo de la Kazal inhibitor/enzyme interaccin se describe bien
y es el termed un 'normal' el mecanismo (Laskowski y Kato, 1980). El complejo
del inhibitor/proteinase podra disociar a la enzima e inhibidor en uno de dos
formularios: la virgen y modific (un peptide hendido une). como resultado del
peptide hendido una, el formulario modificado de inhibidor difiere del
formulario de la virgen en la masa molecular ms alta (por 18 Da), cargo ms
negativo al pH alto y la reaccin ms lenta con el proteinase (Laskowski y Kato,
1980,; El S?owi?ska et al., 2008). La presencia de inhibidor en el pavo el
plasma seminal en dos formularios, virgen y modific (un peptide hendido
une), es una seal de su papel regulando los procesos del proteolytic en el
vivo. En este estudio nosotros demostramos para la primera vez la presencia
de un inhibidor de Kazal en el extracto de esperma de pavo. Es desconocido si
este inhibidor puede atarse a los espermatozoos aparezca o localiz en la
esperma. Gelifiqese la filtracin al pH agrio nos permiti disociar el
inhibitor/proteinase de Kazal complejo e identificar dos formularios de inhibidor
de Kazal en el extracto de esperma. La presencia de dos formularios de
inhibidor de Kazal en el extracto de esperma es una seal de su papel activo en
el mando de procesos del proteolytic en los espermatozoos. Segn Laskowski y
Kato (1980), los valores sumamente altos de Ka que va entre 107 y 1013 M?1
indican que el inhibidor del proteinase puede inhibir el proteinase designado
eficazmente. La asociacin constante (Ka) determinado para la Kazal
inhibitor/acrosin interaccin 7.6107 M?1 era. Este valor era dentro del alto de
valores de Ka que sugieren que un inhibidor de Kazal puede inhibir el acrosin
eficazmente en el vivo. Este resultado sugiere fuertemente que la funcin
fisiolgica del Kazal el inhibidor familiar de semen del pavo es el inactivation de
acrosin soltado del muerto o da y/o controla de activacin del sistema del
proacrosin-acrosin. En la conclusin, nosotros hemos demostrado que el
sistema del proacrosin/acrosin existe en los espermatozoos del pavo y este
sistema se parece la activacin del proacrosin mamfero. Un rasgo
caracterstico de proacrosin del pavo est una falta de un segmento prolinerico en la porcin del C-trmino. El acrosin del pavo maduro es una molcula de
la dos-cadena que consiste en las cadenas ligeras y pesadas y fue encontrado
para ser el glycoprotein. La constante de la asociacin determinada para la
Kazal inhibitor/acrosin interaccin era 7.6 107 M?1 que sugieren que la
actividad del acrosin puede controlarse por un plasma seminal el inhibidor de
Kazal bajo las condiciones fisiolgicas.

3. ARCHIVO
La fertilizacin mamfero es un proceso complejo que involucra reconocimiento
del gameto, penetracin, y fusin. Estudios bioqumicos que identificaron el
papel de componentes del acrosome sobre todo durante la interaccin de los

esperma-vulos el pellucida de la zona (ZP) con tal de que los adelantos

mayores en la esperma la biologa celular. Acrosin (un protease del serine
tpicos) las funciones durante la fertilizacin de varias maneras significantes
que incluyen: un) la activacin de componentes del acrosome, b) el ligando
secundario con el ZP, y c) el hydrolysis del ZP. Sin embargo, estudios que usan
el knockout (KO) los ratones acrosin-deficientes lanzaron la duda en el papel
tradicional de acrosin en la fertilizacin. El KO los ratones acrosin-deficientes
exhiben la fecundidad normal salvo la fertilizacin tardada. A pesar de la duda
lanzada en el papel tradicional de acrosin por el KO que el ratn acrosindeficiente estudia, el acrosin sigue siendo todava un protease mayor
involucrado en los procesos mltiples de fertilizacin. En esta revisin, nosotros
evaluamos el perfil funcional de acrosin y brevemente resumimos los recientes
resultados en proteases involucrado en la fertilizacin. Nosotros proponemos
un esquema refinado para el papel funcional de acrosin en la fertilizacin.
Nosotros damos nfasis al papel de acrosin particularmente en el exocytosis
del acrosome y activacin de otros componentes del acrosome basadas en la
tecnologa avanzada como el anlisis de la Radiografa estructural.
1. introduccin que la fertilizacin Mamfero involucra que las interacciones de
los esperma-vulos y reacciones de fertilizacin los dos de que contribuyen con
que al synchronicity de fertilizacin los eventos bioqumicos y moleculares de
la esperma y vulos ocurren en una moda organizada. El estudio de estos
procesos ha elucidado los mecanismos involucrados en el reconocimiento de
los esperma-vulos, el desarrollo de terapias de infertilidad, y estrategias para
el anticoncepcionismo non-hormonal en los humanos. Sin embargo, muchos
mecanismos moleculares involucrados en la fertilizacin permanecen unresueltos, sobre todo en el rea de interacciones de los esperma-vulos. En la
mayora de los mamferos del placental, la fertilizacin es un proceso
favorablemente orquestado que involucra varios eventos que incluyen: un) la
penetracin de esperma del cmulo la capa celular, b) esperma que liga al
pellucida de la zona (ZP), c) la reaccin del acrosome, d) el ZP saliendo del
cascarn, y d) la fusin de esperma con el oocyte la membrana celular (Fig. 1).
El acrosome (Gr. el akros = extremo o ladea, soma = el cuerpo) es un Golgideriv
2. organelle que guarda las enzimas necesario para la penetracin de esperma
y se localiza al fin anterior del spermatozoon entre la membrana celular y el
ncleo compacto. El acrosome guarda las enzimas necesario para la
penetracin de esperma. La esperma sufre una reaccin del acrosome como
resultado de esperma-ZP ligando la matriz del acrosome con que no slo pero
tambin se activa soltado. Algunos proteases distintivos se han identificado
como los candidatos probables en este proceso. Acrosin es uno de estos
proteases distintivos que juegan los papeles mltiples en la fertilizacin y son
un componente muy conocido de la matriz del acrosome (el Adham et al.,
1989; Tyler, 1939). Como un endoprotease del serine tpicos con trypsin-como

la actividad, el acrosin se guarda en su formulario del zymogen inactivo (llam

el proacrosin) y se secreta como un protease del serine despus esperma-ZP
ligando. Acrosin juega los papeles importantes en varios procesos que incluyen:
un) la dispersin de matriz de acrosome, b) esperma-ZP ligando, c) la reaccin
del acrosome, d) la encuadernacin secundaria, y e) la penetracin de ZP. En
esta revisin, nosotros discutimos los rasgos bioqumicos de acrosin y su
participacin en las interacciones de los esperma-vulos. Nosotros resaltamos
cmo los varios estudios en el acrosin han extendido nuestro conocimiento de
fertilizacin en las ltimas dcadas. 2. Acrosin en la reaccin del acrosome y
dispersin de matriz de acrosome Durante la reaccin del acrosome, superficie
que remodela los eventos ocurre en la esperma la membrana celular. Adems,
se activan los componentes del acrosome y soltaron de la vescula del
acrosome en el orden al hydrolyze y penetra las vestiduras que rodean el
oocyte. En esto considere, el acrosin participa en el proceso de exocytosis del
acrosome. En los humanos, en el vivo esperma-ZP los restos obligatorios
relativamente normal despus del tratamiento con el anticuerpo de antiacrosin/proacrosin de monoclonal (AcrC5F10) aunque AcrC5F10 bloquea
proacrosin que causa un defecto en la encuadernacin del proacrosin-ZP. No
obstante, una reaccin del acrosome ocurre a pesar del tratamiento de
AcrC5F10 (el Veaute et al., 2010). la localizacin de Subcellular estudia de
proacrosin revel a ese socios del proacrosin con otros componentes de la
matriz del acrosome (Hardy el al del et., 1991). Esto puede indicar eso activado
el acrosin participa en el exocytosis del acrosome va su proteolytic del serine
funcione soltando una variedad de componentes de matriz de acrosome. Es
decir, los varios componentes de matriz de acrosome pueden servir como el
substrates de acrosin activado y entonces pueden sufrir el descargo de la
matriz. Adems, Acr masculino? /? los ratones con una mutacin disociadora en
el acrosin demuestran un descargo tardado de varias protenas del acrosome
(por ejemplo, sp56, MC101) compar a ratones del tipo salvajes que usan los
acercamientos del immunocytochemical (el Yamagata et al., 1998). Estos
estudios sugieren que el acrosin acelere la dispersin de la matriz del
acrosomal. All est compeliendo la evidencia para implicar el proacrosin
inequvocamente / el acrosin en la reaccin del acrosome y exocytosis del
acrosome. La actividad del proteolytic de resultados del acrosin en la
activacin y aceler descargo de otros componentes del acrosome. Desde que
los proteases del acrosome se guardan como el proenzymes, la probabilidad
que los acrosin pueden pegarse y pueden activar otro proteases del acrosome
se pone clara. En la ausencia de actividad de proteolytic de acrosin de acrosin,
la reaccin del acrosome puede tardarse y del esperma-ZP ligando pueden
afectarse (el Adham et al., 1997). Por consiguiente, la valoracin de actividad
de proteolytic de acrosin por el spectrocolorimetry puede ser una manera
buena de medir la reaccin del acrosome (el Liu et al., 2008).

3. varios preguntas todava permanecen acerca del papel de acrosin que

incluye: un) lo que es los substrates especficos de acrosin? b) los proteomics
de esperma pueden dar algunas pistas acerca del substrates especfico? c) lo
que es el activador de acrosin? d) la activacin Es de energa del acrosin
relacionada? d) lo que es la fuente de la energa? 3. Acrosin en el esperma-ZP
la interaccin: el reconocimiento, respondiendo cascada y penetracin El ZP es
una matriz del extracellular densa de filamentos del glycoprotein cruz-unidos
que forman una vestidura proteccionista que rodea los oocyte y mentiras bajo
el oophorus del cmulo (Primakoff y Myles, 2002). El ZP debe penetrarse por el
prior de esperma a la fusin de la membrana celular (Fig. 1). No obstante, los
mecanismos moleculares que median y los factores en que participan el
esperma-ZP la interaccin permanece polmica. Esperma-ZP ligando requiere
un selectin-como la interaccin en los humanos con que la esperma y
glycoproteins de ZP juegan un papel giratorio en esta interaccin (el Miranda et
al., 1997). En la mayora de los mamferos, el ZP consiste en tres termed del
glycoproteins ZP1, ZP2, y ZP3 todos de los cuales se degeneran y
descomponen durante el embryogenesis. El crosslinks de ZP1 ZP2 y ZP3 (ZP4
juega el mismo papel en los humanos). ZP2 media esperma-ZP ligando
actuando como un receptor secundario (el Lin et al., 2010). ZP3 juega un papel
en el reconocimiento de esperma (el Howes et al., 2001) (Mesa 1). 3.1.
Proacrosin es el ligand potencial de ZP3 para el esperma-vulos reconocimiento
Esperma-vulos reconocimiento ocurre por un mecanismo del ligand-receptor
por que la esperma ata y liga al ZP. Por consiguiente, puede postularse que que
los receptores de ZP existen y ligan el ligand en la esperma aparezca.
Actualmente, ZP3 el ms probablemente es candidato para el receptor de ZP
(el Han et al., 2010; Jimenez-Movilla y Dean, 2011,; Wassarman y Litscher,
2010). ZP3 liga o acta recprocamente con una gama amplia de protenas de
superficie de esperma durante el proceso de reconocimiento de los espermavulos que une el ZP y la esperma por eso. En esto considere, se encontraron
los glycoproteins de ZP para ligar al proacrosin bacteria-expresado en vitro que
indica un posible papel de proacrosin como el ligand para ZP3 (el al de et de
Estadio., 2000). 3.2. Acrosin liga a ZP2 La interaccin entre el
proacrosin/acrosin y ZP2 en los ratones ocurre a travs de un mecanismo llam
encuadernacin secundaria que involucra interacciones inicas fuertes de los
grupos del sulphate en ZP2 con el proacrosin/acrosin (el Howes et al., 2001). En
esto considere, ZP2 demuestra la habilidad obligatoria baja al acrosin la
esperma "nula" en un modelo del ratn (Howes y Jones, 2002). Sin embargo, el
recombinants humano ZPA, ZPB y ZPC (el homologs a ZP2, ZP1 y ZP3)
demuestre una habilidad obligatoria alta al proacrosin y activ el acrosin (el al
de et de Estadio., 2005a, 2005b). Estos resultados indican ese acrosin que liga
al varios glycoproteins de ZP juega un papel importante en la penetracin de
ZP. 3.3. Acrosin y el proteolysis de ZP Los acrosome deben soltar sus
volmenes para facilitar la fertilizacin. Acrosin se ha caracterizado mucho
tiempo como una enzima del hydrolytic que participa en la digestin y

penetracin del pellucida de la zona durante la fertilizacin. En la vista

tradicional del sistema del proacrosin/acrosin, el acrosin activado digiere y
lyses el ZP que ayuda la esperma por eso para penetrar el ZP. Esta vista
tradicional se desarroll en la fertilizacin del jabal estudia (Crosby y Barros,
1999,; El Dunbar et al., 1985). Sin embargo, si el acrosin acta en cierto modo
en los humanos que eso es consistente con la vista tradicional sigue siendo el
unverified. Adems, los substrates de ZP especficos que se digieren de lysed
por el acrosin activado permanecen irresolutos. No se elucidan los mecanismos
subyacentes involucrados en la interaccin entre el acrosin y el ZP totalmente
a pesar de la vista tradicional antedicha. La estructura cristalina de un avian el
homolog de ZP3 mantiene la evidencia el papel de ZP3 como un receptor que
participa en los esperma-vulos iniciales que ligan (el Han et al., 2010; El
Monn et al., 2008). Sin embargo, la estructura cristalina de acrosin no ha sido
determinada. Por consiguiente, un anlisis estructural-funcional se exige no
slo determinar el dominio obligatorio de acrosin pero tambin el substrates de
ZP especfico que los blancos del acrosin durante esperma-ZP ligando. Adems,
varios otras preguntas acerca del cronometrar de activacin del proacrosin, el
mecanismo de ZP substrate reconocimiento, y la regulacin de la proporcin de
hendidura de substrate permanece sin contestar. Desde que el pivotally de
sistema de proacrosin/acrosin participa de una manera giratoria en la reaccin
del acrosome y el esperma-ZP la interaccin, uno podra concluir esa
fertilizacin depende en la presencia de proacrosin/acrosin. Sin embargo,
muchos experimentos han indicado esa fertilizacin no es completamente
dependiente en la presencia de proacrosin / el acrosin. 4. explorando el papel
de acrosin durante la fertilizacin por un ensaye del knockout La idea acerca de
si la penetracin de esperma del ZP ocurre va un evento del lytic se ha
llamado en la pregunta (Bedford, 1998). En esto considere, la esperma puede
penetrar el ZP va un proceso mecnico en lugar de un evento del lytic que
involucra el exocytosis del acrosome y hydrolysis del acrosin del ZP. Esto
desafa la vista tradicional de fertilizacin obviamente. El
4. el proceso mecnico se apoya ms all por los resultados que otras
protenas (el ej., GalTase, TESP4, y TESP5) puede facilitar penetracin de
esperma del ZP el solo o en la cooperacin con el acrosin (el Cesari et al.,
2004; El Honda et al., 2002; El al de et de molinero., 1993; El Ohmura et al.,
1999) y ese otras protenas pueden funcionar en la funcin obligatoria
secundaria de acrosin (el McLeskey et al., 1998; Snell y Blanco, 1996). Por
consiguiente, uno podra cuestionar si el acrosin es una protena esencial para
la fertilizacin exitosa. En esto considere, nosotros sabemos que el knockout
(KO) los ratones acrosin-deficientes todava son fecundos y producen un
tamao de basura comparable. Adems, KO los ratones acrosin-deficientes (el
acrosin? /?) no muestre ninguna diferencia significante en esperma-ZP ligando
contra el acrosin + / + y acrosin + /? los ratones en experimentos que utilizan
un en el vitro esperma-ZP el ensaye de la interaccin (el Adham et al., 1997; El

Baba et al., 1994). Estos resultados en el KO el ratn acrosin-deficiente la

llamada ejemplar en la pregunta el papel esencial de acrosin en la fertilizacin.
De otra perspectiva, el KO el modelo del ratn acrosin-deficiente tambin da la
creencia que otras protenas (o proteases) puede compensar para la prdida de
funcin del acrosin que sugiere que la redundancia funcional existe en el
proceso de fertilizacin. As, se han producido ratones de KO dobles y triples
que involucran acrosin y otro proteases del serine (Mesa 1). Los ratones de KO
dobles que involucran acrosin y TESP5 (un protease del serine) revele un papel
redundante de TESP5 en el proceso de fertilizacin. Los ratones de KO dobles
que involucran acrosin y ratones de TESP5 son los subfertile (en el vivo) pero
no muestra ninguna diferencia contra ratones del mando que usan en la
fertilizacin del vitro ensaya (el Kawano et al., 2010). adems, cinco proteases
testculo-especficos (TESP1-TESP5) se ha identificado aunque su papel en
redundancia funcional relacionada al acrosin no se ha elucidado. As que,
aparece que que una interaccin compleja de factores dentro del repertorio del
acrosome existe que eso lleva a la penetracin de esperma del ZP. 5. el
esquema refinado de estudio de funcin de acrosin Aunque muchos estudios
defienden contra el acrosin como el solo o crtico factor involucrado en
esperma-ZP la interaccin, la importancia de acrosin no puede estar fuera
completamente gobernada. Hay muchos estudios que utilizan la suma de
inhibidores, anticuerpos, y ligands que actan recprocamente con o inhiben la
funcin de acrosin que ha adelantado nuestro conocimiento de fertilizacin (el
Gaboriau et al., 2007; El Gupta et al., 2005; El Veaute et al., 2009a, 2009b).
Estos estudios llevaron a la comprensin que el acrosin participa en la
penetracin de ZP y activacin de los volmenes del acrosome los dos de que
la causa la encuadernacin de ZP. Sin embargo, la evidencia sugiere que un
mecanismo de la compensacin puede existir con que que otros proteases
pueden sustituir para el acrosin durante esperma-ZP la interaccin. Por
consiguiente, los estudios futuros deben tener en cuenta que esperma-ZP las
interacciones involucran un integr, mecanismo complejo con la redundancia
funcional para desenmascarar los misterios de verdad en este paso de
fertilizacin. 6. los comentarios y comentarios A pesar de los esfuerzos de la
investigacin considerables, los problemas acerca del acrosin y esperma-vulos
ligar permanecen ser resueltos. Sin embargo, nosotros proponemos el resumen
siguiente: (1) el evento obligatorio primario con que la esperma ata al ZP no
requiera la actividad enzimtica. El evento obligatorio secundario involucra la
encuadernacin entre el acrosin y el ZP (Fig. 1). Por consiguiente, el papel
giratorio de acrosin no puede involucrar hydrolysis del ZP. En esto considere, la
fertilizacin puede requerir slo una senda para el pasaje de esperma en lugar
de un hydrolysis completo del ZP. (2) el signo del acrosin desaparece dentro de
3 s despus de la reaccin del acrosome mientras el signo de otros
componentes del acrosome (el ej., MN7 y MC41) los restos para por lo menos
15 min (el Nakanishi et al., 1999). La desaparicin rpida del signo del acrosin
indica ese acrosin no pueden participar en la penetracin de ZP a la magnitud

como previamente pensamiento. Es posible que la activacin temprana de

acrosin sea indicativa de un prior del papel a la penetracin de ZP. (3) la
importancia de la actividad enzimtica de acrosin se ha bajo-apreciado. La
participacin de Acrosin en la fertilizacin puede involucrar el proceso de otras
protenas del acrosome o esperma las protenas de la membrana celulares
durante el exocytosis del acrosome en lugar de directamente el hydrolyzing el
ZP. En esto considere, la elucidacin de todo el substrates de acrosin no slo en
el ZP pero tambin dentro del acrosome debe descifrarse. (4) otro evento
importante en la fertilizacin involucra la fusin de membrana de gameto (Fig.
1). La fusin de la esperma la membrana celular con los vulos la membrana
celular requiere IZUMO1 (Mesa 1) y otro proteases que posiblemente se activa
por el acrosin. A pesar de los adelantos en esperma-ZP interaccin
pavimentada por los estudios bioqumicos, el esquema funcional completo de
acrosin y esperma-ZP la interaccin sigue siendo confundiendo. Sin embargo,
molecular y los estudios de manipulacin de gen pueden llevar a una
resolucin del papel exacto de acrosin en la esperma - la interaccin de ZP. El
conflicto de inters Los autores declaran ningn conflicto de inters.
Reconocimientos que Nosotros nos endeudamos a todos los miembros del
Laboratorio de Esperma en la Universidad de Zhejiang para su ayuda
inspirando. La apreciacin de los autores tambin va a Ronald Dudek (El Brody
School de Medicina en la Universidad de Carolina Oriental, NC, EE.UU.), quin
con tal de que el slido y la contribucin constructiva a este manuscrito. Este
proyecto se apoy en parte por la Fundacin de la Ciencia Natural Nacional de
China (Nos. 41276151 y 31072198).
4 ARCHIVO
Resuma El alcance del estudio presente era evaluar la presencia y activacin
de proacrosin/acrosin como una herramienta determinar el estado del
acrosomal de fresco y espermatozoos de perro de frozen/thawed. El anticuerpo
de Monoclonal C5F11, dirigido contra el acrosin humano, cruz-reaccion con los
espermatozoos del perro y etiquet el acrosome de ambos fresco y
espermatozoos de perro de frozen/thawed. Los espermatozoos de
Frozen/thawed tenan una proporcin menor de espermatozoos etiquetados
que los espermatozoos frescos (P <0.05). Cuando se etiquetaron los
espermatozoos vivos con inhibidor de trypsin de soja conjugado con Alexa 488
(SBTI-Alexa 488), la proporcin de espermatozoos frescos acrosomeetiquetados estaba menos de los espermatozoos del frozen/thawed (P <0.05).
usando borrones Occidentales y la actividad enzimtica, los espermatozoos del
frozen/thawed tenan una proporcin mayor de acrosin activo que los
espermatozoos frescos. Adems, beta 1,4-galactosyl-transferase (GalT), una
membrana del plasma limit la protena, permaneca atado a los
espermatozoos del frozen/thawed. Proacrosin se activa durante el
freezing/thawing de espermatozoos del perro, y ese proacrosin/acrosin pueden

ser un indicador bueno de integridad del acrosomal de espermatozoos del

frozen/thawed. 2005 Elsevier B.V. todos los derechos reservados.

1. la introduccin los espermatozoos Mamfero son nicos entre las clulas

secretorias en el sentido que su solo propsito es fertilizar el oocyte. Si
la fertilizacin no ocurre entonces que los espermatozoos se
comprometen para morirse. En el mismo contexto, los spermatozoon
tenan las caractersticas celulares ideales para este propsito, mientras
poseyendo un organelle especfico para realizar cosas as con xito
funciona (el Barros et al., 1996; Ramalho-Santos el al del et., 2002). El
acrosome es una vescula secretoria que cubre sobre dos-tercero de la
superficie nuclear. El acrosome contiene varios enzimas que se cree que
ayuda los espermatozoos cruzan el pellucida de zona de huevo (el
Tulsiani et al., 1998). El acrosome el proceso secretorio, propiamente
nombr la reaccin del acrosome (AR), es un proceso favorablemente
regulado porque slo puede ocurrir en la superficie del pellucida de la
zona que permite la esperma as para cruzar esta barrera (Evans y
Florman, 2002,; Ramalho-Santos el al del et., 2002). El componente del
pellucida de la zona, un glycoprotein nombr ZP3 y la progesterona de la
hormona, el ms probablemente es candidatos para tener un papel
fisiolgico pertinente en este proceso (Wassarman, 1999). Sin embargo,
el mecanismo a travs de que los espermatozoos inducen la reaccin del
acrosome realmente todava es cuestionable. Es importante a la nota
que un AR prematuro puede daar la proporcin de fertilizacin y puede
disminuir el resultado de en el vitro y en la produccin de embrin de
vivo de especies pertinentes. En el AR, se sueltan muchos componentes
y enzimas en el entorno del extracellular y varias enzimas inactivas,
como el proacrosin, se procesa a la estructura ms estable (Howes y
Jones, 2002,; Moreno y Barros, 2000). la activacin de Proacrosin en el
vitro involucra una hendidura del autocatalytic entre Arg23 y Val24 en el
trmino aminado, produciendo una molcula de la dos-cadena unida. Los
recientemente generamos 23 - el fragmento del aminocido (la cadena"
ligera) restos ponteados por las ataduras del disulphide al resto de la
molcula (la cadena" "pesada). Este 49 formulario del kDa es
enzimticamente activo y constituye alfa-acrosin (- Acr) (el Baba et al.,
1989). El segundo y terceras hendiduras tienen lugar en el carboxyltrmino entre Lys363 y Arg367 y entre Arg322 y Pro323,
respectivamente. Estas hendiduras llevan a una prdida secuencial de
18 - y 43 - el residuo fragmenta (el Baba et al., 1989; Moreno y Barros,
2000). stos ltimos eventos del proceso producen la formacin de un
36 kDa estables enzimticamente formulario activo nombrado betaacrosin (- Acr) (el Schleuning et al., 1976; Topfer-Petersen y Cechova,
1990). los estudios Mltiples han mostrado una correlacin entre los

niveles de proacrosin y actividad del acrosin con el potencial fertilizando

de espermatozoos humanos (el Shimizu et al., 1997). adems, el
proacrosin/acrosin se suelta secuencialmente del acrosome bajo
capacitar las condiciones. As, la localizacin de proacrosin/acrosin en el
acrosome es un indicador de la reaccin del acrosome y/o de integridad
de la membrana en varias especies. Helando promueve varios cambios
relacionados al capacitation y senescence de esperma que pueden
modificar la funcin de esperma (Pena y Linde-Forsberg, 2000,; El Pena
et al., 2003). adems, helar es un proceso que puede daar
potencialmente en serio el plasma de esperma y/o membranas del
acrosomal (el al de et de Burguesa., 2001; El Nishizono et al., 2004; El
Rasul et al., 2001). Por consiguiente, el objetivo del estudio presente era
evaluar si el dao de la membrana indujo por el freezing/thawing puede
inducir la activacin del proacrosin en los espermatozoos del perro. C.J.
Corts el al del et. / La Reproduccin animal Ciencia 93 (2006) 165-175
167 2. los Materiales y mtodos 2.1. los Reactivos Todos los reactivos se
compraron de Sigma (la Ca. de Sigma, St. Louis, MO) a menos que por
otra parte especific. El anticuerpo contra el ratn beta 1,4-galactosyltransferase (GalT) era un regalo de Dr. Barry Shur (el Departamento de
Biologa Celular, la Emory Universidad Escuela de Medicina, CO), se
compraron anticuerpos del monoclonal contra el acrosin de BIOSONDA
(Santiago, Chile,; El gato no. AMC-ACRO-C5F10-COMO). 2.2. muestra de
Semen que coleccin Seis eyacula sea reunido de tres perros fecundos
saludables de cra mixta (dos muestras de cada perro, los 2-6 aos
viejos) y examin dentro de 1 h despus de la coleccin. Las muestras
eran reunido por la manipulacin digital en los fragmentos (la presecrecin, fragmento esperma-rico, fragmento esperma-pobre, y el
fragmento esperma-libre). El fragmento esperma-rico se us para los
experimentos. La valoracin de calidad de esperma incluso la evaluacin
de concentracin de esperma, motilidad de esperma, y valoracin de
alteraciones morfolgicas se realiz previamente como describi (el Rota
et al., 1999). Todos eyaculan era de calidad suficiente, como juzgado por
los parmetros de semen convencionales. Se lavaron los espermatozoos
de los fluidos seminales por el centrifugation en un Tris-medio despus
de la coleccin y estimacin de calidad. La pelotilla se us para extracto
de la protena o imaging del acrosome. 2.3. helando y deshelando de
semen del perro prueban la Congelacin se realiz como sigue: el
fragmento esperma-rico de cada uno eyacula estaba extendido en una
yema del Tris-fructosa-huevo medio helado que contiene 2.4 g Tris, 1.4 g
el cido ctrico, 0.8 glucosa de g, 0.06 g Na-benzylpenicillin y 0.1 g
estreptomicina sulphate solubilized en 100 ml de agua destilada (Del los
Reyes el al del et., 2002). se ajustaron los Espermatozoos a una
concentracin de 200 106 spermatozoa/ml y entonces cargaron en
0.25 pajas del ml (L'Aigle Cedex, Francia) y helado a una velocidad de 30

a ?196? C/min. Deshelando se realiz como descrito por el Parrish et al.

(1988) con las modificaciones ligeras: pajas se sacaron de nitrgeno
lquido y pusieron en un bao de agua a las 60? el C para 8 s. Entonces,
0.25 ml de semen deshelado el layered era el 500 Tris-medio de l
encendido en los tubos de Eppendorf. La mezcla se centrifug entonces
a 500 rpm para 5 min. La ltimo pelotilla se re-suspendi en espermaTALP (el Parrish et al., 1988) o en el Tris-medio. 2.4. se chaparon los
Acrosome imaging Espermatozoos en el poly-l-lysine cubri el coverslips.
Despus de 5-10 min, stos eran fijos para 5-24 h en PBS que contiene
4% p-formaldehdo. Los espermatozoos eran entonces los permeabilized
con 100% metanol fro para 10 min y entonces re-hidrataron con 1%
Tritn X-100 en PBS para 1 h. Estas preparaciones se bloquearon con PBS
que contiene 1% albmina de suero bovina (PBS-BSA) para 1 h en una
cmara hmeda a la temperatura del cuarto y entonces incub con un
anticuerpo primario, o un anticuerpo de monoclonal de ratn dirigi
contra el proacrosin/acrosin 168 C.J. Corts el al del et. / La Reproduccin
animal Ciencia 93 (2006) 165-175 (C5F11, la concentracin activa 0.2
mg/ml) o con un anticuerpo de polyclonal de conejo contra beta 1,4galactosyl-transferase (la concentracin activa 0.1 mg/ml). El anticuerpo
primario se incub toda la noche a las 4? el C y entonces lav dos veces
para 3 min en 0.2% PBS-Tween. Las muestras se incubaron para 1 h a las
37? el C en una cmara de humedad con un anticuerpo de anti-ratn de
cabra secundario conjugado con Alexa 488 o anticuerpo de anti-conejo
de cabra conjugados con Alexa 594 (las Sondas Moleculares, Eugenio,
OREGN), se usaron ambos anticuerpos en una dilucin de 1/100. Las
muestras se enjuagaron tres veces entonces y montado con Vectashield
(el Vector, Burlingame, CA). el inhibidor de trypsin de Soja conjug a
Alexa 488 (SBTI-Alexa 488, Sondas Moleculares, Eugenio, OREGN) se
agreg a una suspensin de esperma viva a una ltimo concentracin de
1 g/ml. La suspensin se incub para 15 min a las 39? el C y entonces
observ en un microscopio del epifluorescence (Optiphot-2, Nikon, Japn)
con un 460-500 nm (la excitacin) y 510-560 nm (la barrera) el filtro. 2.5.
el extracto de la protena y el extracto de Esperma de borrn Occidental
eran hecho homogeneizando una pelotilla de esperma en el pulidor UN
(1% Tritn X-100, NaCl 1 M, EDTA 1 mm, PMSF 10g/ml, Tris-HCl 20 mm
pH 7.0), y entonces centrifug para 10 min a 10,000 rpm. La muestra se
corri en un 12% polyacrylamide gelifiqese (el SDS-PGINA) bajo
reducir y condiciones del denaturant, y entonces transfiri a
Nitrocellulose a 100 V para 1.5 h. Nitrocellulose se bloque con 2% BSA
en PBS, pH 7.4, y entonces incub toda la noche a las 4? el C con un
ratn el anticuerpo del acrosin anti-humano (C5F11, dilucin 1:1000).
Despus del lavado extenso con PBS ms 0.05% Tween 20 (PBS-Tween),
la membrana se incub con un anticuerpo de anti-ratn de conejo
conjugado al peroxidase (KPL, Gaithersburg, MD) diluy 1:10,000 en PBS-

BSA para 1 h a la temperatura del cuarto. Se revelaron las vendas de la

protena usando el Oeste Sealado Excelente el Pico chemiluminescent
substrate (Agujeree, Rockford, IL). 2.6. la actividad de Acrosin la
actividad de Acrosin el spectrophotometrically moderado estaba en las
25? el C siguiendo el hydrolysis de N-benzoyl-larginine-etilo-ester (BAEE)
y por la suma de 50 o 100l de la solucin de la enzima, a 253 nm. Los
ensaye se realizaron en 3 volmenes del ml, mientras usando una
mezcla del substrate de 50 mm Tris, 50 mm CaCl2, y 500 M BAEE a pH
8.0. UNA diferencia de absorcin molar de 1150 cm?1 de M?1 fue usada
para convertir los cambios en la densidad ptica al micromoles de
hydrolyzed de BAEE (Pena y Linde-Forsberg, 2000). Una unidad
internacional de actividad se defini como esa cantidad de hydrolyzing
del acrosin 1mol BAEE/min a las 25? C. 2.7. el anlisis Estadstico anlisis
Todo estadstico que us el SPSS para Windows Release 11.5.0 Versin
Normal se realiz, de las Tecnologas de Primaca Inc. Las diferencias
significantes eran determinadas cuando P <0.05, cuando prob usando
el Bonferroni la prueba estadstica. Se expresan los resultados como un
malo la desviacin normal (S.D.) (la Muralla, 1995). C.J. Corts el al del
et. / La Reproduccin animal Ciencia 93 (2006) 165-175 169 3. Resulta
3.1. el imaging de Acrosome en viva y los espermatozoos del perro fijos
La meta inicial era determinar si o no dos anticuerpos del monoclonal
contra el proacrosin humano podran cruz-reaccionar con los
espermatozoos del perro frescos. Los resultados mostraron C5F11 a ese
anticuerpo del monoclonal (Fig. 1(A y D)) hizo un signo luminoso encima
del acrosome de espermatozoos del perro frescos. Los espermatozoos de
Frozen/thawed dieron un modelo similar; sin embargo, el porcentaje de
espermatozoos etiquetados era menos de para los espermatozoos
frescos (Fig. 2, P <0.05). SBTI-Alexa 488 (Fig. 1(B y E)) dio un modelo
que apareca como dos dominios en lugar de uno, como ocurrido con el
anticuerpo del anti-acrosin (Fig. 1(A y D)). el Acrosomal manchar era
especfico porque ningn signo fue obtenido cuando el anticuerpo de
C5F11 no era incluido en el procedimiento (datos no mostrados). SBTIAlexa 488 etiquet 12% de espermatozoos del perro frescos (los Higos.
1(B) y 2). Considerando que se etiquetaron 48% de espermatozoos del
frozen/thawed con SBTIAlexa 488, este nmero que es
significativamente mayor que para los espermatozoos frescos (Fig. 2; P
<0.05). adems, apareca como si la etiqueta de SBTI-Alexa 488 en los
espermatozoos del frozen/thawed fuera ms fuerte que con los
espermatozoos frescos. Estos resultados sugieren fuertemente que los
espermatozoos del frozen/thawed haban perdido la mayora del acrosin
probablemente debido al acrosome dae durante la congelacin o
deshelando el proceso. Para evaluar Fig. 1. Imaging de fresco y
espermatozoos de perro de frozen/thawed que usan los anticuerpos del
anti-proacrosin/acrosin. Los modelos manchando para el anticuerpo de

anti-proacrosin/acrosin de monoclonal C5F11 (UN y D), SBTI-Alexa 488

sonda (B y E), y galactosyl-transferase (el C y F) en los espermatozoos
del perro. Los espermatozoos frescos (el UN-C), espermatozoos del
frozen/thawed (D-F). El modelo obtenido con SBTI-Alexa 488 aparece
como dos dominios en lugar de uno como visto con el anti-acrosin (UN y
D) y anticuerpos de GalT (el C y F). Amplificacin 400. 170 C.J. Corts
el al del et. / La Reproduccin animal Ciencia 93 (2006) 165-175 Fig. 2. la
Cuantificacin de immunolabeling de fresco y espermatozoos del
frozen/thawed. El porcentaje de espermatozoos del frozen/thawed (las
barras blancas) etiquet con el anticuerpo del anti-acrosin estaba
significativamente menos de eso de espermatozoos frescos (la barra
negra). Ninguna diferencia se descubri entre las muestras con el
anticuerpo del anti-GalT. El porcentaje de espermatozoos frescos (la
barra negra) etiquet con SBTI-Alexa 488 era significativamente baje a
frozen/thawed unos (las barras blancas). el Asterisco (*) indica P <0.05
entre fresco y muestras del frozen/thawed. Por lo menos se contaban
100 espermatozoos para cada determinacin, N = 3. la membrana del
plasma, los anticuerpos contra beta 1,4-galactosyl-transferase, una
esperma superficie plasma membrana protena involucr en el
reconocimiento del gameto y en el AR se us (el Pena et al., 2003). Los
resultados mostraron que el anticuerpo del anti-GalT hizo un signo fuerte
encima del acrosome entero en ambos fresco y espermatozoos del
frozen/thawed (Fig. 1(C y F)). la Cuantificacin de la proporcin de
espermatozoos etiquetados mostr que no haba ninguna diferencia
entre ambas poblaciones de esperma (Fig. 2). Como un mando, ningn
signo se descubri cuando las muestras dnde incubaron sin el
anticuerpo primario (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que
la mayora de los restos de GalT atara al acrosome en los espermatozoos
de perro de frozen/thawed. 3.2. la activacin de Proacrosin en los
espermatozoos de perro de frozen/thawed para determinar el estado de
proacrosin, actividad enzimtica en ambos fresco y se ensayaron los
espermatozoos del frozen/thawed. La actividad de Acrosin de muestras
del frozen/thawed era ms alto que en los espermatozoos frescos (P
<0.05; Fig. 3). Despus de en la activacin del vitro en Tris-HCl pH 8.0
para 30 min, fresco y las muestras del frozen/thawed no eran diferentes
en la actividad del acrosin (Fig. 3). Interesantemente, Fig. 3. Acrosin la
actividad especfica en fresco y espermatozoos del frozen/thawed.
Acrosin la actividad especfica en los espermatozoos del frozen/thawed
(la barra blanca) era significativamente mayor que en los espermatozoos
frescos (la barra negra) en las muestras non-activadas (P <0.05). Un
aumento en la actividad del acrosin ocurre en la activacin (activ),
permitiendo las muestras frescas para emparejar la actividad
encontraron en los espermatozoos helados non-activados. No se
descubri el aumento en la actividad del acrosin en las muestras del

frozen/thawed. Las cartas diferentes indican las diferencias significantes,

P <0.05, N = 3. C.J. Corts el al del et. / La Reproduccin animal Ciencia
93 (2006) 165-175 171 Fig. 4. el Descubrimiento de proacrosin y acrosin
en fresco y en las muestras del frozen/thawed. Proacrosin est presente
en ambos fresco (senda 1) y espermatozoos del frozen/thawed (senda
2). Alfa-acrosin se descubri como una venda de 36 kDa y beta-acrosin
como una venda de 27 kDa slo presente en los espermatozoos del
frozen/thawed (senda 2). la actividad del acrosin aument el tres-pliegue
aproximadamente en las muestras frescas, pero el mismo procedimiento
que usa las muestras del frozen/thawed no indic un aumento
significante en la actividad del acrosin (Fig. 3). Estos resultados implican
que todo el acrosin en los espermatozoos del frozen/thawed ya fue
activado, como opuesto a los espermatozoos frescos era casi todos
acrosin era como el proacrosin. Si el volumen total de acrosin como la
actividad de la enzima alcanzada despus en la activacin del vitro es
considerado (es decir 100%), era determinado que 67% de la actividad
observada eran como el proacrosin, y 33% como el acrosin activo en los
espermatozoos frescos. Los espermatozoos de Frozen/thawed, sin
embargo, mostraron slo un 10% aumento en la actividad del acrosin
despus en la activacin del vitro. As, slo 10% de la actividad
enzimtica observada eran como los proacrosin y 90% era como el
acrosin. Los borrones occidentales mostraron que el anticuerpo C5F11
reconoci una venda de 40 y 36 kDa en los espermatozoos frescos,
mientras correspondiendo al proacrosin y alfa-acrosin, respectivamente
(Fig. 4, senda 1). En los espermatozoos del frozen/thawed, sin embargo,
el anticuerpo C5F11 reconoci el proacrosin, alfa-acrosin y una venda de
27 kDa que corresponden a beta-acrosin (Fig. 4, senda 2). Estos
resultados sugieren fuertemente que el proacrosin se activara en el alfa y beta-acrosin en los espermatozoos del frozen/thawed. 4. discusin que
se ha informado que helando y/o deshelando de espermatozoos
mamfero inducen capacitation-como los cambios como la activacin de
la enzima, ruptura de membrana de plasma, y un aumento en la
concentracin de calcio de intracellular (Bravo el al del et., 2005; Ms
lleno y Whittingham, 1997,; El Schembri et al., 2002). El hallazgo mayor
era que haba la activacin y descargo de proacrosin/acrosin en los
espermatozoos del frozen/thawed sin la prdida de protenas de
membrana de plasma como GalT. Adems, nosotros mostramos ese
SBTI-Alexa 488 puede ser un proceso fiable y eficaz para evaluar la
integridad del acrosome en ambos fresco y muestras de espermatozoos
de frozen/thawed. Un 172 C.J. Corts el al del et. / La Reproduccin
animal Ciencia 93 (2006) 165-175 anticuerpo del monoclonal contra el
acrosin humano se us en el estudio presente. El anticuerpo C5F11 ha
sido un recurso excelente para estudiar la reaccin del acrosome en el
humano, conejo, toro, y marmota (el Yunes et al., 1992; El Valdivia et al.,

1994; Ramalho-Santos el al del et., 2000; Moreno el al del et., 1998).

Este anticuerpo etiqueta el acrosome de ambos fresco y espermatozoos
de perro de frozen/thawed. Esta etiqueta parece ser especfica porque
ningn signo fue descubierto cuando slo el anticuerpo secundario fue
usado. Adems, en los ensaye del borrn Occidentales el anticuerpo
reconoci proacrosin y ambos sus formularios activados (el alfa - y betaacrosin). Es ms, este anticuerpo reconoce el polysulphate el dominio
obligatorio de acrosin que es muy conservado entre las especies
diferentes. Por consiguiente, aunque este anticuerpo se construy contra
el acrosin humano, el anticuerpo C5F11 cruz-reacciona con el acrosin del
perro y puede usarse como un recurso fiable para estudiar el acrosomal
funcione en los espermatozoos del perro. Helando y deshelando los
impactos probables la membrana del acrosomal a la magnitud que ms
proacrosin/acrosin est disponible actuar recprocamente con los
anticuerpos. En este contexto, anticuerpos al acrosin humano tambin
igualmente el proacrosin de la mancha y alfa-acrosin qu puede
intensificar el signo y puede sobrestimar la cantidad de molculas del
acrosin que estn presente en el acrosome de los espermatozoos. La
cantidad de acrosin en el acrosome no se estim por la intensidad de
fluorescencia; sin embargo, nosotros cuantificamos el porcentaje de
espermatozoos etiquetados no importa cmo intenso, y de esta manera
nosotros superamos este problema. Despus del AR, el proacrosin se
convierte a alfa-acrosin que permanece limitado al acrosome. Alfaacrosin se convierte entonces automvil-catalizadoramente en betaacrosin eso se suelta al entorno del extracellular (el Baba et al., 1989; El
Hermans et al., 2003; Howes y Jones, 2002). En vivo que procesa y la
activacin de proacrosin ocurre gradualmente e incluso despus de 4-6 h
de incubacin, es posible descubrir una proporcin pequea de
proacrosin/acrosin en el acrosome de humano y los espermatozoos
bovinos (el Barros et al., 1992; Kim el al del et., 2001). Por consiguiente,
la proporcin de espermatozoos el proacrosin/acrosin carente y/o la
magnitud de activacin del proacrosin son un indicador exacto del AR. La
proporcin de espermatozoos del perro con el acrosomal daa y la
prdida del acrosin era significativamente mayor en el frozen/thawed
que en los espermatozoos frescos en el estudio presente. Estos
resultados sugieren que el acrosin, probablemente en el formulario de
beta-acrosin, est perdido del acrosome durante o despus de
cualquiera helando y/o deshelando. Si ste es el caso, se especula que la
prdida de proacrosin/acrosin del acrosome puede ser un resultado de la
activacin de proacrosin en el acrosin. Esta hiptesis era inveterada por
borrn Occidental que mostr ese espermatozoos del perro frescos tiene
dos vendas de 40 protena del kDa que corresponde al proacrosin y una
venda dbil que corresponden a alfa-acrosin que puede haber resultado
de alguna activacin durante el extracto o por activacin del proacrosin

inducida por la reaccin del acrosome. La mayora del acrosin descubri

en los espermatozoos del frozen/thawed, sin embargo, correspondidos al
alphaand beta-acrosin. Cmo los proacrosin se activan en los
espermatozoos de perro de frozen/thawed? Los estudios anteriores han
mostrado los espermatozoos bovinos a ese frozen/thawed aumenta ms
calcio que la esperma fresca prueba, ms probable debido a alteraciones
de membrana de plasma inducidas durante el procedimiento del
cryopreservation (el Collin et al., 2000). Sin embargo, la activacin del
proacrosin no depende de las concentraciones fisiolgicas de Ca2+,
Mg2+ o Zn2+, todava fuertemente confa en el pH del intra-acrosomal
(Meizel y Deamer, 1978,; El castao y Hartree, 1978,; El castao y
Harrison, 1978). As, es posible que el dao de membrana de plasma, en
los espermatozoos de perro de frozen/thawed, permita un aumento en el
pH del intracellular que a su vez promueve la activacin del proacrosin y
en el futuro el descargo de beta-acrosin del acrosome. Esto explicara la
actividad del acrosin mayor y la proporcin menor C.J. Corts el al del et.
/ La Reproduccin animal Ciencia 93 (2006) 165-175 173 de etiqueta del
anti-acrosin encontraron en los espermatozoos del frozen/thawed
comparado con los espermatozoos frescos. El GalT media la fertilizacin
en los ratones ligando al ligands del oligosaccharide O-unido especfico
en el glycoprotein de chaqueta de huevo ZP3 (el al de et de Molinero.,
2002). Antes de ligar al huevo, esperma GalT es enmascarado por el
cobertizo del glycosides epididymal-derivado de la superficie de esperma
durante el capacitation. Despus de ligar el huevo, los oligosaccharides
del esperma-lmite en ZP3 inducen la reaccin del acrosome por la
agregacin del receptor, mientras involucrando GalT probablemente (el
al de et de Molinero., 2002; Wassarman, 1999,; El Wassarman et al.,
2001). los estudios Anteriores han mostrado que el anticuerpo contra el
ratn GalT reconoce esta enzima en el acrosome de ratn, ganado,
cerdo, conejo, rata, y espermatozoos del cuy (Larson y Molinero, 1997).
adems, ningn signo fue descubierto cuando slo se incubaron las
muestras con el anticuerpo secundario o con el suero pre-inmune. As, es
muy probable que el signo observ en espermatozoos del perro que
usan este anticuerpo es especfico a GalT (el al de et de Molinero., 2002;
Wassarman, 1999,; El Wassarman et al., 2001). se ha mostrado que la
mancha de GalT est perdida durante la reaccin del acrosome. Se
supone que si los espermatozoos de perro de frozen/thawed hubieran
perdido su acrosome, una disminucin en la proporcin de GalT
etiquetada los espermatozoos ocurriran. Sin embargo, en el estudio
presente la proporcin de espermatozoos frescos etiquetada con GalT es
similar a los espermatozoos del frozen/thawed. La explicacin ms
probable para estos resultados en el estudio presente es eso a pesar del
acrosome fracture, slo una porcin pequea del acrosome est perdida
durante este proceso, as el immunofluorescence no alcanza este nivel

de resolucin. Es, sin embargo, posible que a pesar de la fusin de la

membrana y activacin de protease de acrosome, una porcin de la
membrana del plasma del acrosome permanece todava despus de que
el AR est acabado. En este guin, GalT podra permanecer en los
espermatozoos acrosome-reaccionados y podra habra, por
consiguiente, no sea un marcador fiable de dao del acrosome o la
reaccin del acrosome. Semejantemente, Larson y Molinero (2000)
mostr ese GalT no es un marcador fiable de habilidad de fertilizacin en
los toros. Por consiguiente, los resultados del estudio presente indican
que la magnitud de la activacin del proacrosin y/o el porcentaje de
espermatozoos etiquet con un anticuerpo del acrosin puede ser un
mtodo eficaz para evaluar el acrosomal dae de espermatozoos de
perro de frozen/thaw. Adems, la evidencia sugiere que las fracturas
pequeas en la membrana del plasma y/o en la membrana del
acrosomal exterior la activacin del proacrosin puede inducir. Los
reconocimientos Parten de este trabajo se apoy por una concesin del
Concilio de la Investigacin chileno (FONDECYT) No. 1030380 a Mnica
Del los Reyes. IM era un destinatario de un compaerismo de
PROGRESAR.
5 ARCHIVO
RESUMA La interaccin entre la esperma acrosome-reaccionada y no se
entienden todava totalmente las protenas de pellucida de zona. Se han
propuesto Serine protease acrosin y sus proacrosin del zymogen al ll del
fulfi esta funcin debido a su capacidad de ligar el glycoproteins de
pellucida de zona. Sin embargo, el mecanismo molecular que est
debajo de esta interaccin ha sido meramente especulativo. Aqu
nosotros mostramos ese fucoidan (un polisacrido del sulfated) y
solubilized zona pellucida glycoproteins, pero no el inhibidor de trypsin
de soja, puede destacar espermatozoos limitados que sugieren que los
lazos de esperma vivos al pellucida de la zona de una manera del nonenzymatical. Interesantemente, digestin del proteolytic apacible con el
acrosin o el trypsin no modifica la estructura del pellucida de la zona,
sino resultados en menos espermatozoos que ligan a la zona. Estos
resultados estn de acuerdo con un modelo dnde el sitio activo de
compendios del acrosin los pellucida de la zona y lazos a travs del
dominio polysulfate-obligatorio a travs de una estructura de la zona
tridimensional en lugar de un solo ligand. Las palabras de la llave: La
fertilizacin, el acrosin, el acrosome, el pellucida de la zona, la esperma,.
* El autor correspondiente: Dr. Ricardo D. Moreno, Departamento de
Fisiologa, Facultad de Ciencias Biolgicas, cia de Pontifi Universidad
Catlica de Chile. Alameda 340, Santiago, Chile. Tel: (562) 686 2885, el
facsmil,: (562) 222 5515, el correo electrnico,: rmoreno@bio.puc.cl

Received: El 19 de agosto de 2010. En el formulario revisado: El 10 de

enero de 2011. Aceptado: El 11 de enero de 2011. INTRODUCCIN que
se reconocen Tres protenas como los componentes estructurales de
pellucida de zona de ratn, a saber ZP1, ZP2 y ZP3 (Wassarman, 2008).
para penetrar el pellucida de la zona, cuando una hiptesis declara, la
esperma acrosome-intacta reconoce y liga con un solos oligosaccharides
O-unidos encadene que probablemente es ZP3 (Florman y Wassarman,
1985,; El Wassarman et al., 2001). por otro lado, un ZP2 hendidura
modelo se ha propuesto recientemente que defiende que en lugar de
esperma que liga a un solo ligand, el esperma ligando se apoya por una
estructura de la zona tridimensional (el Gahlay et al., 2010; El Rankin et
al., 2003). Este modelo es el predicated en el estado de la hendidura de
ZP2, mientras o dando el pellucida de la zona permisivo (el uncleaved
ZP2) o non-permisivo (el cleaved ZP2) para responder de esperma que
liga al pellucida de la zona los huevos circundantes, pero no a esos
embriones dos-celulares circundantes (el Gahlay et al., 2010; El Rankin
et al., 2003). ZP2 tambin se ha propuesto como un compaero
obligatorio de esperma acrosome-reaccionada (el Bleil et al., 1988;
Howes y Jones, 2002). la evidencia Experimental sugiere que ZP2 ligue y
que es el substrate de acrosin, un serine-protease localiz en el
acrosome (el Howes et al., 2001; Howes y Jones, 2002). los
espermatozoos Acrosome-intactos llevan un non-activo (en pro de)
acrosin que se activa en la reaccin del acrosome (el Barros et al., 1996;
El Codelia et al., 2005; Corts el al del et., 2006; Moreno y Alvarado,
2006). los estudios Diferentes han mostrado ese acrosin pueden digerir
el glycoproteins de pellucida de zona y se cree que su actividad de la
enzima est envuelta en la hendidura de ZP2 durante la fertilizacin
(Florman y Wassarman, 1985,; El Gahlay et al., 2010). hay ninguna
evidencia experimental que los huevos del zonaintact trataron con el
acrosin Sin embargo, u otro serine-protease, es impenetrable a la
fertilizacin. Este tipo de evidencia experimental ayudara apoyar o
refutar al ZP2 hendidura modelo de zona la penetracin difana.
Proacrosin y acrosin son capaces de compuestos del polysulphated
obligatorios, como el fucoidan, los sulfatos del chondroitin UN, B, el C y
sulphate del dextran, as como el glycan encadena de solubilized zona
pellucida glycoproteins (ZPG) (el Crosby et al., 1998; Jones, 1989,; Jones,
1991). Este dominio polysulphated-obligatorio (PSBD) debe ser diferente
del sitio activo desde que ningn specifi inhibidores de c o mutaciones
en los aminocidos del activo-sitio afectan la interaccin del acrosin con
esos compuestos (Lo el Leggio et al., 1994; Moreno y Barros, 2000,;
Moreno el al del et., 1999; Moreno el al del et., 1998). Muchos
bioqumico y sitio-mutagenesis los estudios de especies diferentes han
mostrado que el PSBD abarca el aminoacids bsico (el Crosby et al.,
1998; El Jansen et al., 1998; Moreno y Barros, 2000,; Richardson y

O'Rand, 1996). adems, un peptide cidos 18-aminados, mientras

conteniendo esos residuos bsicos, puede inhibir la activacin de
proacrosin inducida por fucoidan o solubilized zona pellucida
glycoproteins (ZPG) (el Crosby et al., 1998; El Jansen et al., 1998;
Moreno y Barros, 2000,; Richardson y O'Rand, 1996). El papel del
segundo PSBD en esperma-zona pellucida que liga durante la
fertilizacin permanece ser determinado. Los objetivos de este trabajo
eran determinar si los cation de modifi de proteolytic del pellucida de la
zona por el acrosin pueden modificar la encuadernacin y/o penetracin
de espermatozoos, y para evaluar en ms detalle la contribucin del
PSBD en el pasaje de esperma a travs del pellucida de la zona. Los
MATERIALES Y Reactivos de los MTODOS A menos que por otra parte
declar, se compraron todos los qumicos y reactivos de Sigma (St Louis,
MO) o Merck (Darmstadt, Alemania). Biol Res 44: 145-150, 2011 146
MORENO ET AL. Biol Res 44, 2011, 145-150 coleccin de gameto de
Marmota y en el vitro fertilizacin Marmota esperma capacitation: Se
obtuvieron los espermatozoos de la marmota del epidydimidis caudal de
animales 3-4-mes-viejos y mantuvieron en medio de TALP-10K
complementado con 10 mg/ml la albmina de suero bovina (el Jedlicki et
al., 1988). los espermatozoos se incubaron en las gotas de 100 ml bajo
el aceite de mineral para 3 h a una concentracin de 1.5 x 106 lograr el
capacitation, por el ml, en una 5% atmsfera de CO2. La coleccin de
oocyte de marmota: Se indujeron las marmotas hembras adultas al
superovulate con una inyeccin de 30 IU de PMSG (el gonadotropin de
Suero de Yegua Embarazada), en un da de descarga del prooestrous (el
Jedlicki et al., 1988). Cincuenta a 60 horas despus, ellos se inyectaron
con 30 hCG de IUof (el godanotrophin del chorionic humano) y sacrific
14-15 horas despus. Los oocytes de la marmota en el cumuli estaban
alejados y pusieron en TALP - 10K, complement con 10 mg/ml BSA,
incubado para 3-5 min con 0.1% hyaluronidase preparados en TALP-10K,
y lav completamente en tres cambios de medio fresco. El ratn y
marmota que los huevos zona-intactos se usaron entonces para en la
fertilizacin del vitro. La marmota En la Fertilizacin del vitro: La
marmota en la fertilizacin del vitro se logr agregando el oocytes zonaintacto a la esperma capacitada deja caer, e incub durante 3 horas.
Despus de la co-incubacin del gameto, el nmero de lmite de
esperma a y habiendo penetrado el pellucida de la zona, as como la
proporcin de penetracin y fertilizacin, se evalu por la microscopa de
contraste de fase (el Jedlicki et al., 1988; Moreno el al del et., 2001). el
extracto de Proacrosin y proacrosin de Jabal de activacin fueron
obtenidos por el extracto como descrito previamente (Moreno el al del
et., 1999; Moreno el al del et., 1998). Briefl y, el semen del jabal eyacula
se ajust con 1M benzamidine a una concentracin de nal de fi de 50
mm y ltered del fi a travs de Miracloth. Veinte-ml se pusieron los

alcuota cuidadosamente en 25 ml de 1M sacarosa, 50mM benzamidine,

0.02% azide de sodio, y se centrifug para 30 min a 500 rpm en un IEC
HNS el centrfugo clnico a la temperatura del cuarto. El acrosin del jabal
se extrajo en una solucin cida que contiene 1 mm HCl, 10% glycerol,
0.02% azide de sodio y 50 benzamidine del mm a pH 3.0, y sali toda la
noche a las 4?C. Esta suspensin se centrifug entonces a las 27,000g
para 30 min en un Sorvall RC2-B ejemplares centrifugan y los
supernatant guardaron a las -20?C. Prior al experimento, un 200
alcuota del ml de proacrosin del jabal helado estaba el dialyzed de
noche contra 2L de 1mM HCl en pH 3.0. el Acrosin actividad ensaye la
actividad de Acrosin estaba el spectrophotometrically moderado en las
25?C siguiendo el hydrolysis de N-benzoyl-L-arginineethyl-ester (BAEE),
despus de la suma de o 50 o 100 ml de la solucin de la enzima
(Moreno el al del et., 1999; Moreno el al del et., 1998). Los ensaye se
realizaron en 3ml volmenes, mientras usando una mezcla del substrate
de 50 mm Tris-HCl, 50 mm CaCl2 y 500 mm BAEE a pH 8.0. UN
coeficiente de absorcin molar de 1150 M-1 centmetro-1 fue usado para
convertir los cambios en la densidad ptica al mmoles de hydrolyzed de
BAEE. Una unidad internacional (IU) se defini como la cantidad de
hydrolyzing del acrosin 1 mmol BAEE / el min a las 25?C. el Zona
pellucida aislamiento y solubilization el Solubilized boass zona pellucida
glycoproteins (ZPG) se obtuvo de los ovarios se aisl de refresc (4C) el
matadero segn un trabajo anterior (Moreno el al del et., 1999; Moreno
el al del et., 1998). Examinando microscopa del electrn Fertilizada se
procesaron los oocytes de la marmota por examinar la microscopa del
electrn como descrito antes (el Jedlicki et al., 1988). Briefl y, los huevos
inseminados eran xed del fi, deshidratados en una serie de
concentraciones crecientes de acetona, el crtico-punto sec en CO2
(Sorvall, el Newton, CT,; modele 49300), ech saliva al hablar y cubri
con palladium-oro (SEM Coating Unidad 9000; Pelco, Redding, CA), y
analiz usando un microscopio del electrn examinando (JeolJSM-25 SII;
Peabody, MA) el anlisis Estadstico el anlisis Variante (ANOVA) fue
usado para comparar los medios despus de la transformacin del arcoseno de EQUIVALENCIAS, como descrito antes (Sokal, 1995). Cuando la
prueba de ANOVA mostr las diferencias estadsticas, el EstudianteNewman-Keuls (SNK) la prueba fue usada para comparar los grupos; la
prueba del t-estudiante fue usada para comparar la frecuencia. El cance
de Signifi es el ned del defi como p <0.05 o p
Biolgico Ensaya 1. el Efecto de fucoidan, ZPG y SBTI en el nmero de
lmite de esperma a la superficie de oocytes de la marmota zona-intacto
el oocytes de la marmota Zona-intacto (pre-incub con o sin el acrosin)
se incub para 3-4 h con las espermas capacitadas como descrito
previamente. Las gotas se expusieron al fucoidan (10 mg/ml), solubilized

ZPG (5mg/ml) o inhibidor de trypsin de soja (SBTI) (10-40 mg/ml).

Despus de estos tratamientos, los oocytes se lavaron completamente
en PBS-BSA y entonces examinaron por microscopa de contraste de fase
o xed del fi por examinar la microscopa del electrn. Por lo menos se
contaban 100 oocytes en cada grupo. 2. la Pre-incubacin de oocytes de
la marmota zona-intacto con acrosin del jabal o trypsin se pre-incubaron
los oocytes de la marmota Zona-intactos con 1.5 o 3 U de extracto del
acrosin (155 protena de U/mg), y 1.5 U de trypsin (15.5 x 103 protena
de U/mg) para 5 y 10 min en TALP - 10K medio sin BSA. Despus del
tratamiento, los oocytes se lavaron varios tiempos en medio de TALP10K que contiene 10mg / el ml BSA y entonces agreg a las gotas de
esperma capacitadas. Al final de la incubacin los huevos se examinaron
por la microscopa de contraste de fase para determinar la proporcin de
penetracin y el nmero de espermatozoos limitados por el oocyte.
MORENO ET AL. Biol Res 44, 2011, 145-150 147 Efecto de los
RESULTADOS de fucoidan, ZPG y SBTI en el nmero de lmite de esperma
a la superficie de oocytes de la marmota zona-intacto En la marmota
normal, el en vitro fertilizacin xito proporcin de 65-80%, con un
nmero alto de espermatozoos limitados (Higo 1 UN). Nosotros
supusimos que si el PSBD de proacrosin/acrosin participa en este
proceso, nosotros podemos soltar aqullos acrosome-reaccionaron el
lmite de esperma a la zona agregando fucoidan o solubilized ZPG. de
hecho, fucoidan (Higo 1B) y solubilized ZPG (Higo 1C) suelte casi todos
espermatozoos competitivamente en el proceso de penetracin. Es
notable que la superficie del pellucida de la zona era marcada con
muchas huellas de esperma, un specifi firma de c salida por las
espermas en el proceso de penetracin de pellucida de zona (el Fig. 1B
insercin). adems, la superficie de pellucida de zona se cubri con
muchos fantasmas del acrosomal salidos por esperma que sufra la
reaccin del acrosome (el Fig. 1C y 1B, puntas de flecha). al contrario,
SBTI no destac los espermatozoos una vez ellos ya se ligaron al
pellucida de la zona (Higo 1D). la Pre-incubacin de oocytes de la
marmota zona-intacto con acrosin del jabal o trypsin Nuestra prxima
meta era determinar si los cation del modifi enzimticos de oocytes de la
marmota zona-intacto modifican la encuadernacin y / o proporcin de
fertilizacin. Con este fin, nosotros incubamos el oocytes de la marmota
zona-intacto para 5 o 10 min con 1.5 o 3 U de acrosin, o para 5 min con
1.5 U de trypsin (vea Materiales y Mtodos). Ningn trypsin o
tratamiento del acrosin tenan cualquier efecto en la apariencia de la
superficie del pellucida de la zona, como evaluado bajo el microscopio
del electrn examinando (Higo 2A). Trat los huevos desplegaron un
pellucida de la zona con los ventanaje tpico de aqullos observados en
los mandos (Higo 2A, insercin). la Fertilizacin de oocytes tratada para
5 min con 1.5 U de acrosin era similar a los mandos (Higo 2A, 3A, B). Sin

embargo, huevos tratados para 10 min con 1.5 o 3 U de acrosin

mostraron la ms bajo proporcin de fertilizacin y nmero de
espermatozoos limitados a un cantly del signifi como comparado con los
mandos (Higo 3A, B, p,
La DISCUSIN Desde las observaciones seminales que el ed del purifi
ZP2 no inhibe la encuadernacin de esperma acrosome-intacta al ratn
incita en el vitro, y slo liga a la esperma acrosome-reaccionada, este
glycoprotein era fuertemente implcito como el receptor secundario para
la esperma (el Bleil et al., 1981; El Bleil et al., 1988). no est todava
claro qu azcares estn envueltos en esta interaccin, pero en los
estudios del vitro ha sugerido que es el specifi estereofnico c, con la
participacin de residuos de azcar de polysulphated (Jones, 1991,; Lo el
Leggio et al., 1994). Uno un trmino es? -1,3 galactose (Bleil y
Wassarman, 1988) y el otro es un N-acetylglucosamine terminal propuso
ligar? -1,4 transferase del galactosyl, un receptor de esperma putativo
(Molinero y Hachea, 1990; El al de et de molinero., 2002). Adems, la
fertilidad continuada de ratones mutante que o faltan la enzima que
agrega el trmino? -1,3 galactose (el Thall et al., 1995)or
galactosyltransferase del b-1,4 (el Shi et al., 2001) lo hace
improbablemente que stos los solos determinants de ratn esperma
ligar son. Por consiguiente, el mecanismo de interaccin entre el
pellucida de la zona y la esperma sigue siendo el unsolved. Aqu
nosotros hemos mostrado que el nmero de esperma los sitios
obligatorios en el pellucida de la zona cambian con el tratamiento del
protease, sin cambiar la estructura macroscpica de la zona. Sin
embargo, la proporcin de fertilizacin disminuy bajo esta condicin.
Recientemente se ha propuesto que un specifi que los supramolecular de
c estructuran de pellucida de la zona mamfero es importante lograr
fertilizacin y polyspermy bloquee en los mamferos (el Gahlay et al.,
2010; El Rankin et al., 2003). Este modelo viene de los resultados dnde
el ratn ZP1 y ZP3 se ha reemplazado por su homologus humano en los
ratones del transgenic. No obstante, las protenas humanas pudieron
formar un pellucida de la zona estables y bien-organizados al nivel
macroscpico; la zona no es funcionalmente activa, como con las
protenas del ratn (el Gahlay et al., 2010; El Rankin et al., 2003). As, la
explicacin ms simple para nuestros resultados es ese tratamiento del
acrosin rompe y/o desorganiza los supramolecular estructuran de
pellucida de zona de marmota, (principalmente las mitades de los
hidratos de carbono), haciendo los sitios obligatorios para los
espermatozoos no disponible. Interesantemente, el nmero ms alto de
espermatozoos limitados se observ con la cantidad ms alta de acrosin
en los momentos de la incubacin ms largos. Es posible que esta
condicin pueda ser similar al pasaje de esperma a travs del pellucida
de la zona dnde probablemente una concentracin del acrosin alta se

suelta localmente para desenmascarar los nuevos sitios obligatorios

secundarios en un estreo-specifi la orientacin de c, permitiendo la
activacin de un nuevo juego de proteases del acrosomal y el adelanto
extenso de la esperma. Esta hiptesis pone la actividad de protease de
acrosomal como un elemento importante para exponer los sitios
obligatorios secundarios. El hecho que despus del tratamiento con el
acrosin nosotros observamos un nmero aumentado de lmite de
esperma a la zona, pero una disminucin en la proporcin de
fertilizacin, sugiere que los sitios obligatorios recientemente
desenmascarados no estn en la orientacin apropiada permitir la
penetracin de esperma completada. Por qu la exposicin de nuevos
sitios obligatorios disminuye la proporcin de fertilizacin? Una posible
explicacin es que un aumento en el nmero de lmite
los espermatozoos a la zona llevarn a una asociacin de cient de ineffi
entre ellos. Los estudios del ultrastructural ms tempranos han sugerido
que para penetrar el oocyte, los spermatozoon deban asociar en una
moda oblicua a travs del dorsal/ventral y el margen anterior. De hecho,
en la fertilizacin del vitro con las concentraciones de esperma altas
(48,000 sperms/ml) lleva a ambos una disminucin en el nmero de
esperma limitada a la zona y una ms bajo proporcin de fertilizacin (el
Jedlicki et al., 1988). los estudios de Ultrastructural han mostrado eso a
esta concentracin, los espermatozoos eran asociados en un
perpendicular y no la moda oblicua. Una explicacin alternativa es que
ese protease-tratamiento expone los nuevos sitios obligatorios en los
pellucida de la zona y aumentos la interaccin con la esperma. Los
espermatozoos se entramparn en la zona debido al aumento en el
nmero de ligar los sitios en la zona en este modelo. Esta idea refuerza a
una modelo anterior en que la interaccin de espermatozoos acrosomereaccionados debe ser muy bien bastante para apoyar su
encuadernacin a la zona, pero debe debilitar para permitir el
movimiento de la esperma a travs de la zona. En este modelo, el
proacrosin / el acrosin se previo como la protena zona-obligatoria
principal en el acrosome. Proacrosin que liga a la zona induce su
activacin en acrosin que ya no acta recprocamente con la zona y se
suelta al entorno del extracellular (el Barros et al., 1992; Moreno el al del
et., 1999; Topfer-Petersen y Cechova, 1990). Entonces, la esperma
mueve y una nueva ronda de salidas del attachment/detachment por de
nuevo. Durante mucho tiempo se haban considerado los acrosin de
protease de acrosomal como la zona principal la protena obligatoria (el
Barros et al., 1996). El mecanismo de interaccin involucra
reconocimiento de grupos del polysulphate en el glycoproteins de ZP por
los residuos bsicos en la superficie de proacrosin/acrosin, de una
manera similar a eso para el heparin-anti-thrombin III (Moreno y Barros,
2000). Ligando de grupos del sulphate requiere la presentacin correcta

de residuos bsicos positivamente cobrados de la superficie del

proacrosin/acrosin. Nosotros hemos mostrado ese polysulfates del
modelo previamente como el fucoidan prevenga activacin de proacrosin
en el acrosin, un proceso que se medi por un containin de peptide de
18-residuos) un racimo de tres aminocidos bsicos (residuos 59-76)
(Moreno y Barros, 2000,; Moreno el al del et., 2002). En este estudio
nosotros mostramos para el rst del fi cronometra que el fucoidan y
solubilized zona pellucida glycoproteins destacan la esperma limitada del
pellucida de la zona, mientras sugiriendo que el PSBD est de hecho
envuelto en la encuadernacin de espermatozoos acrosomereaccionados a la zona. Interesantemente, SBTI, un inhibidor de la
actividad catalizadora de acrosin no destac los espermatozoos del
pellucida de la zona, mientras sugiriendo que el sitio activo de acrosin no
est envuelto en este proceso durante la fertilizacin.
Subsecuentemente, la actividad de la enzima es necesaria para permitir
el pasaje de esperma a travs de la zona difano, nuestros datos apoyan
la hiptesis que el acrosin tiene dos sitios funcionales por lo menos: el
sitio activo involucr en el proteolysis de pellucida de zona, y el PSBD,
envuelto en la encuadernacin al glycoprotein del sulphated del
pellucida de la zona. Adems, nuestros resultados sugieren que el PSBD
ligue a una tres estructura dimensional de polisacridos en el pellucida
de la zona, mientras poniendo al ZP2 hendidura modelo de interaccin
del spermzona adelante. RECONOCIMIENTOS que Este manuscrito se
dedica a nuestro mentor y amigo Prof Claudio Barros. Su consejo todava
nos gua a travs del camino de ciencia.