Laboratorio Biología Molecular

Informe de laboratorio Biologa Molecular N3
Aislamiento y electroforesis del ADN de Fusarium sp.

Integrantes
1. Programa de Ingeniera Biotecnolgica, Biologa Molecular, Universidad Francisco de Paula Santander.
Ccuta, Norte de Santander, Colombia

Fecha
Resumen:
Como paso preliminar para el desarrollo de tcnicas moleculares que permitan el conocimiento del
genoma de hongos fitopatgenos, en la presente prctica de laboratorio se desarrollo el protocolo de
extraccin y visualizacin del ADN de fusarium sp., enfatizando en las reacciones que ocurren a lo
largo de los procesos de extraccin. Para lisar el micelio se utilizo ruptura mecnica combinada con el
buffer de extraccin (Tris, EDTA, SDS y Na2SO3), la purificacin del ADN se realizo aadiendo
fenol:cloroform, isopropanol y etanol; el anlisis de la calidad y cantidad de ADN se hizo mediante
electroforesis en gel de agarosa a 0,7%, TBE 0,5X y BrEt. En este estudio se obtuvo ADN de alto peso
molecular en la mayora de las muestras. La comparacin de los mtodos de extraccin demostr las
diferencias entre las bacterias, hongos y plantas, estas diferencias se ven reflejadas en sus respectivos
protocolos de extraccin y purificacin de ADN.
Palabras claves: ADN, Fusarium sp., extraccin, electroforesis.

Abstract:
As a preliminary step for the development of molecular techniques that allows to have knowledge about
the genome of pathogenic fungis, in this laboratory practice a protocol for DNA extraction and
visualization of Fusarium sp. was developed, emphasizing in the reactions that occur along the
extraction processes. To lyse the mycelium mechanical disruption was used with an extraction buffer
(Tris, EDTA, SDS and Na2SO3), purification of DNA was performed by adding phenol: chloroform,
isopropanol and ethanol; the analysis for quality and quantity of the DNA was made by electrophoresis
on agarose gel at 0.7%, 0.5 X TBE and EtBr. In this study the DNA that was obtained in most of the
samples had high molecular weight. The comparison of the extraction methods demonstrated the
differences among bacteria, fungi and plants, these differences can be seen in their respective
protocols of DNA extraction and purification.
Key words: DNA, Fusarium sp., extraction, electrophoresis.

2
INTRODUCCIN
electroforesis en gel de agarosa, debido a
Huella de ADN o DNA fingerprinting es uno

de
los
sistemas
ms
grandes
de
identificacin que existen, para reconocer

un organismo individual. Todo ser vivo es
genticamente diferente, quiere decir que
cada individuo contiene una secuencia
especfica. A diferencia de las huellas
digitales, la secuencia de ADN no se puede
cambiar fcilmente una vez que el material
se
deja
en
la
escena
del
crimen,
aumentando as su uso efectivo en anlisis

forenses, y la probabilidad de encontrar
una coincidencia exacta. Este mtodo de
identificacin
es
til
aplicaciones,
tales
en
muchas
la
medicina
como
forense, pruebas de paternidad, y la

arqueologa molecular, entre otros. En
cualquier caso, es evidente que las huellas
dactilares del ADN han revolucionado la
forma
en
que
el
mundo
identifica
coincidencias biolgicas.
Para
hacer
uso
de
esta
tcnica
es
necesario realizar una digestin enzimtica,

utilizando endonucleasas de restriccin que
cortan en fragmentos el genoma en pares
de bases especficas. Los fragmentos
generados por los cortes en el ADN se
clasifican
segn
su
tamao
mediante
su carga negativa el ADN se desplaza

hacia un electrodo cargado positivamente,
los fragmentos pequeos se pueden mover
con mas facilidad que los mas grandes. Las
bandas generadas en la electroforesis se
comparan para determinar similitudes entre
los individuos.
El objetivo de esta practica fue determinar
si algunas de las muestras del Forensic
DNA fingerprinting Kit pertenecen al mismo
individuo
si
son
todas
diferentes,
mediante el uso de enzimas de restriccin y

electroforesis.
MATERIALES Y METODOS
La prctica se llev a cabo en el laboratorio
de Biologa Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander sede Los
Patios, para determinar similitudes entre las
muestras del Kit.
Digestin enzimtica del ADN
Se rotularon los microtubos de la siguiente
forma:
Verde: EC = escena del crimen
Azul: S1 = sospechoso 1
Naranja: S2 = sospechoso 2
Violeta: S3 = sospechoso 3
Rojo: S4 = sospechoso 4
Amarillo: S5 = sospechoso 5

3
Se agregaron 5 L de muestra de ADN del
Para la preparacin de la muestra, se
Kit a los microtubos correspondientes.
agregaron 2l de buffer de carga y 10 l de
Posteriormente se cargaron 5 L de mezcla
DNA. Las muestras fueron cargadas en su
enzimtica
dos
respectivo foso al igual que el marcador de
enzimas de restriccin la EcoRI y PstI en la
peso molecular (Lambda DNA/Hind III
figura 1 se observan las dianas de
Markers). La corrida electrofortica se llev
restriccin:
a 120v durante 30 minutos. Al terminar la
(ENZ)
que
contiene
corrida, se llev el gel a un transiluminador

de rayos UV para visualizar los resultados.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Fig. 1 Dianas de restriccin EcoRI y PstI
Se golpeo con el dedo los tubos y se hizo

un quick en la microcentrifugadora para
que la mezcla quedara en el fondo del tubo.
Electroforesis y visualizacin:
FORMATO CONTROL DE ELECTROFORESIS
Electroforesis No. 2
Fecha: Julio/06/2012
corcho y se llevo a incubar 45 minutos a
% de Agarosa: 1%
Buffer: 0.5x TBE
37C en bao.
Voltaje: 120v
BrEt: 2 l
Se colocaron los tubos en la gradilla de
Tiempo corrida: 30 min
Electroforesis y visualizacin
Para la preparacin del gel, se agreg en
un erlenmeyer 40ml de TBE 0.5X y agarosa
al 1% (0,4 g), llevndolo a plancha de
calentamiento hasta la disolucin completa
de la agarosa; cuando la temperatura
disminuyo a aproximadamente a 65 0C se
agreg 2 l de BrEt, la mezcla se verti en
la cubeta y posteriormente se coloc el
peine para la formacin de los fosos. Una
vez el gel gelifico se lleva a la cmara
cubrindolo totalmente con TBE 0.5X Fig. 2
Muestra: ADN digerido del Kit forense en

el laboratorio de Biologa Molecular, sede
Los Patios.
Carril
1
2
3
4
5
6
7
Muestra
Marcador
Escena del crimen
Sospechoso 1
Sospechoso 2
Sospechoso 3
Sospechoso 4
Sospechoso 5
FOTOGRAFA (Fig. 4, pag. 5)

4
C
A
B
D
F
E
Fig. 3 Electroforesis: A) Calentamiento de agarosa0,7% + TBE 0,5X, B) adicin de 2l de BrEt, C)
vertimiento del gel en la cubeta, D) extraccin de topes y peine, E) corrida electrofortica a 117V
durante 40 min.
Fig. 2
9416
M EC S1 S2 S3 S4 S5
referencia
2027
el
pb
teniendo
marcador
como
molecular
Lambda DNA/Hind III Markers.

Al comparar las muestras en el gel se
observa que el ADN procedente de la
escena del crimen (EC) y el del
sospechoso 3 son idnticos.
De todos los carriles del gel se pudo
concluir que las bandas no estaban
separadas completamente dificultando
el anlisis.
Comentarios:
En todos los carriles del gel se
observaron bandas bien definidas.
El tamao de banda promedio fue
observado
aproximadamente
entre
La maceracin con pistilos o pulverizacin

motorizada de micelio produce lisados
celulares y muchas veces funciona ms
rpido que usando enzimas que degradan

5
la pared celular o altas temperaturas
sustanciales de ADN ( >4000pb) a partir
(Lugert et al., 2006) en ese contexto el
del micelio de Fusarium sp. este resultado
lisado del micelio que se realizado fue
se asemeja al obtenido por Amer et al.,
consistente y permiti acceder al interior
(2011) para el aislamiento de ADN a partir
celular.
de hongos filamentosos donde obtuvo una

concentracin de 0.5 a 1.6 mg/g micelio.
Las nucleasas fngicas, polisacridos, y

pigmentos
dificultan
el
proceso
de
Segn
Valdez
Kahl
(2000)
la
aislamiento de ADN fngico puro por lo que
determinacin de la calidad del ADN se
se obtiene ADN de alto peso molecular por
suele hacer con base en el grado de
contaminacin
degradacin, ya que un ADN de alto peso
con
estos
compuestos
(Blanchard y Nowotny, 1994). Los pigmento
molecular
aparece
como
una
banda
se asocian con las manchas marrones en
definida en la parte superior del gel a poca
el pellet que puede atribuirse a impurezas y
distancia de los posos mientras que el
residuos del protocolo de extraccin, que
material parcialmente degradado forma un
se ven reflejados en el gel cuando se
barrido de fragmentos pequeos a lo largo
obtienen bandas con baja intensidad y alto
del carril. De acuerdo con esta informacin
peso molecular.
y al analizar el gel se observa que las

bandas con el ADN de mejor calidad fueron
La eliminacin de los polisacridos y otros
las de los carriles 1 y 2 correspondientes a
hidratos de carbono contaminantes se basa
las muestras de los grupos 1AI y 1AII. A
en la diferencia de solubilidad del ADN en
excepcin de las muestras del carril 6, 9 y
comparacin con la de los polisacridos de
10
alto peso molecular en medios acuosos
muestras presentaron una banda en la
(Rozman y Komel, 1994). En el protocolo
parte superior del gel cerca a los pozos.
todos
los
carriles
que
contenan
de extraccin se usaron sales (Na2SO3) que

permitieron la solubilizar los polisacridos
En las muestras del carril 6,9 y 10 no se
presentes en el micelio.
distingui ninguna banda definida, ya que

no se consigui una cantidad suficiente de
En el proceso de extraccin de ADN se
ADN que pudiera ser visible en el gel esto
logro
concuerda con lo reportado por Carranza
la
liberacin
de
cantidades

6
(2006) en la extraccin de ADN de
para eliminar los iones metlicos y as
Lactarius.
evitar la accin de DNasas (Rogers y

Bendich, 1998), detergentes, como sodio
Comparacin
de
protocolos
de
dodecilo sulfato (SDS), hexadecil trimetil
extraccin de ADN fngico, vegetal y
bromuro de amonio (CTAB) y Polivinil
genmico bacteriano:
pirrolidona
En la tabla 1 se detallan las diferencias
disolver
entre los protocolos de extraccin en
separar polisacridos y protenas de la
hongos, vegetales y bacterias; los tres
membrana celular, rompiendo las uniones
aislamientos tienen en comn 3 etapas
que mantienen la integridad de la misma
fundamentales para obtencin de ADN de
(Kim et al.,1997; Lodhi et al., 1994 y
alta pureza.
Mygind et al., 2003). Segn Rocha (2002),
(PVP)
lpidos,
son
utilizados
remover
para
polifenoles,
el -mercaptoetanol reduce los grupos

Lisis de la pared celular
y membrana
plasmtica:
sulfuro en protenas de la pared celular

inactivndolas de esta manera.
Para la extraccin de ADN a partir de

plantas, hongos y bacterias, se requiere
El Na2SO3 y el NaCl presentes en los
que el contenido celular sea liberado en
protocolos de hongos y plantas, son sales
una solucin. Dado que las bacterias son
que funcionan solubilizando el ADN en la
clulas
solucin; una caracterstica importante de
individuales
no
contienen
estructuras rgidas el ADN es relativamente
estas
fcil de extraer. En contraste, las muestras
contaminantes como polisacridos y otros
procedentes de hongos y plantas a menudo
metabolitos secundarios (Velasco, 2005).
deben
ser
fragmentos
molidas
antes
de
en
sales
es
la
eliminacin
de
pequeos
continuar
(Karp,
2010).
Digestin y/o precipitacin de protenas

(purificacin):
Los tres tipos de ADN utilizan incubacin a
El buffer de extraccin para los tres tipos de
diferentes temperaturas con el objetivo de
ADN esta compuesto de: Tris cuya funcin
desnaturalizar las protenas. Para separar
es mantener el pH alcalino, el EDTA
los compuestos orgnicos de los cidos
(etileno diamina tetra acetato), se utilizan,
nucleicos se utilizan solventes orgnicos

7
como el fenol:cloroformo (1:1) logrando la
permita comparar las bandas obtenidas en
combinacin
el gel. En la corrida electrofortica se
de la accin de ambos
compuestos,
el
fenol
acta
observo que el marcador utilizado no
desnaturalizando las protenas mientras
permita realizar un anlisis mas detallado
que el cloroformo por su parte puede
de la cantidad de ADN obtenido, se
remover lpidos, solubilizar al fenol y
recomienda el uso de un marcador de
eliminarlo de la solucin (Madriz y Peraza,
mayor peso molecular.
2005).
Extraccin
precipitacin
de
ADN
El uso del SDS como detergente en el
(concentracin):
buffer
de
extraccin
En esta etapa se adiciona isopropanol y
productos de ADN de alto peso molecular,
etanol con el fin eliminar impurezas, como
esto tomando en cuenta que para este
restos de compuestos fenlicos y precipitar
protocolo
el ADN (Mygind et al., 2003). Rocha (2002)
preparados enzimticos. El determinar que
adiciona en la extraccin de ADN vegetal
para las extracciones de ADN de Fusarium
acetato de sodio para ayudar en la
sp. no es necesario hacer uso de estos dos
precipitacin del ADN.
reactivos, se traduce en ahorro de tiempo y
no
se
permite
utiliz
obtener
ARNasas
ni
dinero.
CONCLUSIN
La presente practica logr su objetivo
Mediante este protocolo se pudo obtener
principal el cual era realizar la extraccin de
ADN de buena calidad comprobndose as
ADN y visualizacin en gel de agarosa de
su efectividad, puesto que no presenta
un cultivo de Fusarium sp., ya que se logr
degradacin
demostrar la presencia de ADN en la
encontradas, esto debido a su capacidad
mayora de las muestras, estos resultados
para inhibir la accin de las DNAsas.
parcial
de
las
bandas
pueden ser empleados para desarrollo de

tcnicas moleculares en investigaciones.
Para la eleccin del protocolo adecuado de

extraccin se deben tener en cuenta las
Para
poder
conocer
el
tamao
estructuras presentes en el objeto de
concentracin del ADN se requiere el uso
estudio, puesto que la composicin de
de un marcador de peso molecular que
dichas estructuras puede variar de un

8
organismo a otro, siendo esto un factor
Karp Gerald, 2010. Cell and molecular biology,
determinante en la calidad y cantidad del
concepts and experiments. 6th Ed. John Wiley
ADN.
& Sons, Inc.

Kim, C.; Lee, C.; Shin, J.; Chung, Y. y Hyung,
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conifers using PVP. 1085-1087pp
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Blanchard, M. M., and V. Nowotny. 1994.
Lodhi, M., Guang-Ning, Y., Weeden, N;
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Reisch, B. 1994. A simple and efficient
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cultivars and Vitis species. Plant Molecular

Daz,
Zurisadai,
identificacin
de
2006.
especies
Seleccin
de
BiologyReporter 12: 6-13
hongos
ectomicorrizgenos del estado de Hidalgo mas
Lugert R, Schettler C and Gross U (2006).
competentes en medio de cultivo slido. Tesis,
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Manual A6: 1-10.

10
CUESTIONARIO
Tipos de electroforesis que existen y sus aplicaciones:
1) Inmunoelectrofresis
Es una combinacin de una electroforesis en geles de agarosa seguida de una
inmunodifusin. En la primera parte, se realiza una aplicacin puntual de la muestra, por lo
que al final las distintas protenas estarn distribuidas a lo largo del gel segn el eje de
migracin. Acabada la electroforesis, y sin efectuar la tincin, se practica en el gel un canal
(trinchera) paralelo a la direccin de migracin con un bistur de doble hoja en el que se
deposita un antisuero que contenga anticuerpos especficos frente a una o varias de las
protenas separadas en la electroforesis. Los geles se mantienen a temperatura de (20-22C)
durante 24-48 horas. Los anticuerpos y las protenas se difunden, y si se encuentran en la
proporcin adecuada, producen complejos antgeno-anticuerpo insolubles que precipitan y
aparecen en el gel como bandas elipsoidales.
Figura 1 procedimiento general de la inmunoelectroforesis
La gran especificidad y sensibilidad de las reacciones de precipitacin, permite diferenciar

substancias con movilidades electroforticas idnticas y detectar componentes que se
encuentren en concentraciones mnimas (g), identificar substancias en mezclas muy
complejas y en concentraciones muy bajas. Sin embargo, requiere que dichas substancias
sean inmunognicas y depende de los anticuerpos utilizados, por lo que es difcil de
estandarizar.

11
2) Electrofresis en gel de poliacrilamida (PAGE)

La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel, es
qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y
reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en
agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante
tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros,
se puede modificar de manera controlada el tamao del poro. Los geles de poliacrilamida se
forman por la polimerizacin vinlica del monmero acrilamida y del monmero entrecruzador
N, N'-metilen-bis-acrilamida, el tamao del poro disminuye con el incremento del % de
acrilamida. Al aplicar muestras biolgicas en un gel con gradiente de acrilamida, todas las
macromolculas comienzan su migracin a bajo porcentaje y en la medida en que avanzan se
encuentran con poros ms pequeos que retardan su movimiento, separndose as en
lugares especficos.
Figura 2 Esquema de preparacin del gel para una electroforesis en placa
Formatos de la PAGE
Existen 3 formas diferentes de realizar electroforesis en geles de poliacrilamida: lmina
vertical, varilla cilndrica y lmina horizontal.
PAGE no desnaturalizante.
Se desarrolla en condiciones en las que no se altera la conformacin nativa de las protenas
separadas, por lo que finalizada la electroforesis, pueden realizarse estudios de funcionalidad
de dichas protenas separadas (actividad enzimtica, capacidad de unin de anticuerpos,

12
unin a receptores, etc.). El tampn presente en los reservorios es diferente al que impregna
el gel, el cual tampoco es homogneo, ya que, en realidad, hay dos geles diferentes en uno
solo: una zona de resolucin (donde tiene lugar la separacin de las protenas) que se
polimeriza sin colocar el peine y otra pequea zona de concentracin de 1-3 cm, que se
polimeriza sobre la anterior, que contiene los pocillos de aplicacin de la muestra y cuya
finalidad es concentrar la muestra en la zona de contacto con la zona de resolucin
Figura 3 PAGE en condiciones no desnaturalizantes en sistemas de tampn discontinuo.
PAGE desnaturalizante:
En presencia de algunos compuestos qumicos, las protenas pierden su estructura nativa;
tales compuestos, llamados agentes desnaturalizantes, producen el desplegamiento de la
protena que queda, as, sin la organizacin tridimensional caracterstica de su funcionalidad
biolgica. En la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica,
se utilizan agentes desnaturalizantes de protenas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS),
catropos (p.e. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). Para la visualizacin
de las protenas se utilizan diferentes mtodos de tincin, siendo el ms habitual el azul de
coomassie, la separacin es funcin del tamao (masa molecular), lo que permite determinar
el peso molecular de las protenas. Para ello se compara la movilidad electrofortica de la
protena de peso molecular desconocido con el de protenas de referencia de peso molecular
conocido.

13
Figura 4 Comparacin entre los mtodos no desnaturalizante y desnaturalizante. Las proteinas

separadas mediante el rompimiento de los puentes disulfuro, migran por la diferencia de masas
moleculares.
3) Electrofresis en geles de gradientes

En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro
impida cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite del poro no se produce una migracin
apreciable aunque no se detiene completamente.
Figura 5 Comparacin entre el mtodo sin gradiente de concentracin y con gradiente de

concentracin.

14
Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las
concentra en regiones ms estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares
que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija.
Electrofresis capilar
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas electroforeticas
convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que permiten obtener una serie
de ventajas al respecto. Esta separacin de pptidos es realizada sobre un capilar de silica
fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por
aire. El capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para
darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja, a travs de ella que permite el pasaje de
la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. Con esta tcnica descrita es posible
separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma
simultnea.
Figura 6 Componentes de la electroforesis capilar. a Instrumentacin general. b Capilares
Enfoque isoelctrico
Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfteros se separan segn
su punto isoelctrico (pI; pH al cual la carga neta de la protena es nula) en un gradiente
continuo de pH.

15
La carga neta de una protena est en funcin del pH: pH>pI Carga nula negativa
pH=pI Carga neta nula
pH<pI Carga nula positiva
En este mtodo el efecto de la difusin es mnimo y por ello posee una enorme resolucin,
pudiendo llegar a separar protenas que difieran en 0.001 unidades de pI. Se emplean
compuestos anfteros de bajo peso molecular llamados anfolitos portadores, que son
pequeas poliaminas (alrededor de 750 kDa) con abundantes grupos cidos y bsicos, con un
pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0, con gran capacidad de tamponacin cerca de su pI y con
una gran solubilidad y conductividad.
Puede llevarse a cabo en condiciones que mantengan la estructura nativa de las protenas o
en condiciones desnaturalizantes, incorporando, adems de los anfolitos, urea (8M) o
detergentes ni inicos o anfteros (pero nunca detergentes inicos como el SDS).
Electrofresis bidimensional
Es una sucesin de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones) realizadas sobre
una misma muestra. En la primera de ellas (primera dimensin) se separan los componentes
de la muestra segn un criterio (carga, tamao o pI), y en la segunda (segunda dimensin)
segn un parmetro distinto del anterior.
De esta manera, se combinan dos modos de
separacin diferentes y se consigue el mximo de resolucin posible mediante tcnicas

electroforticas.
Figura 7 Electroforesis bidimensional.

Primera dimensin (SDS-PAGE). En el
pocillo I se aplica el marcador de pesos
moleculares y en los pocillos II y III la
muestra. El carril del pocillo III
(sombreado) se corta y el resto del gel
se tie. El carril III se coloca sobre un
nuevo gel que se ha polimerizado sin
pocillos, donde se desarrolla la segunda
dimensin (EEF) perpendicularmente a
la primera.

16
La primera dimensin puede llevarse a cabo, por ejemplo, en
condiciones no
desnaturalizantes y la segunda en condiciones desnaturalizantes; las protenas ribosomales

se separan en un gel discontinuo en la primera dimensin, seguido por otro continuo en la
segunda, y ambos en presencia de urea. La electroforesis bidimensional puede considerarse
como un criterio de pureza positivo debido a su gran poder de resolucin, aceptndose que la
aparicin de una sola mancha indica una muestra homognea.

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Aislamiento y electroforesis del ADN de Fusarium sp.

Ccuta, Norte de Santander, Colombia

Palabras claves: ADN, Fusarium sp., extraccin, electroforesis.

Key words: DNA, Fusarium sp., extraction, electrophoresis.

Informe de laboratorio Biologa Molecular N3

electroforesis en gel de agarosa, debido a

Huella de ADN o DNA fingerprinting es uno

identificacin que existen, para reconocer

aumentando as su uso efectivo en anlisis

forense, pruebas de paternidad, y la

necesario realizar una digestin enzimtica,

su carga negativa el ADN se desplaza

mediante el uso de enzimas de restriccin y

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Se agregaron 5 L de muestra de ADN del

Para la preparacin de la muestra, se

Kit a los microtubos correspondientes.

agregaron 2l de buffer de carga y 10 l de

Posteriormente se cargaron 5 L de mezcla

DNA. Las muestras fueron cargadas en su

respectivo foso al igual que el marcador de

enzimas de restriccin la EcoRI y PstI en la

peso molecular (Lambda DNA/Hind III

figura 1 se observan las dianas de

Markers). La corrida electrofortica se llev

a 120v durante 30 minutos. Al terminar la

corrida, se llev el gel a un transiluminador

Se golpeo con el dedo los tubos y se hizo

corcho y se llevo a incubar 45 minutos a

Buffer: 0.5x TBE

Se colocaron los tubos en la gradilla de

Tiempo corrida: 30 min

Muestra: ADN digerido del Kit forense en

FOTOGRAFA (Fig. 4, pag. 5)

Informe de laboratorio Biologa Molecular N3

Lambda DNA/Hind III Markers.

La maceracin con pistilos o pulverizacin

Informe de laboratorio Biologa Molecular N3

la pared celular o altas temperaturas

sustanciales de ADN ( >4000pb) a partir

(Lugert et al., 2006) en ese contexto el

del micelio de Fusarium sp. este resultado

lisado del micelio que se realizado fue

se asemeja al obtenido por Amer et al.,

consistente y permiti acceder al interior

(2011) para el aislamiento de ADN a partir

de hongos filamentosos donde obtuvo una

Las nucleasas fngicas, polisacridos, y

aislamiento de ADN fngico puro por lo que

determinacin de la calidad del ADN se

se obtiene ADN de alto peso molecular por

suele hacer con base en el grado de

degradacin, ya que un ADN de alto peso

(Blanchard y Nowotny, 1994). Los pigmento

se asocian con las manchas marrones en

definida en la parte superior del gel a poca

el pellet que puede atribuirse a impurezas y

distancia de los posos mientras que el

residuos del protocolo de extraccin, que

material parcialmente degradado forma un

se ven reflejados en el gel cuando se

barrido de fragmentos pequeos a lo largo

obtienen bandas con baja intensidad y alto