Fundacin REDBIO Internacional

Juan Izquierdo y Alicia Diamante

Conjunto de estudios de caso

sobre biotecnologas simples, sostenibles
y de bajo costo para la agricultura familiar

Editora
Sandra Sharry
Diseo y diagramacin
Eva C. Godoy Contreras
Impresin
XXXX
ISBN: XXXX

ndice
La Fundacin REDBIO Internacional

Presentacin

Prlogo

Autores

13

Captulo I

La pequea agricultura: un escenario para la intensificacin sostenible

de la produccin incluyendo la aplicacin de las biotecnologas simples.
Juan Izquierdo Fernndez , Sandra Sharry y Marcos Rodrguez Fazzone

17

Captulo II

Cultivo de Tejidos Vegetales

Mara de los Angeles Basiglio

29

Captulo III

Infraestructura para aplicar biotcnicas simples. Ideas para el diseo

de un laboratorio econmico de cultivo in vitro de tejidos vegetales
Alejandro Escandn

39

Captulo IV

Cultivo de Tejidos vegetales. Medios de cultivo para plantas

Alicia Rangel Cano

51

Captulo V

Micropropagacin
Rosa Mara Oviedo de Cristaldo

57

Captulo VI

Cultivo de meristemas
Teresa Avila Alba

75

Captulo VII

Biorreactores de bajo costo para micropropagacion. Elaboracion de biorreactores

de bajo costo para micropropagacion de especies de interes
Iselen Trujillo

87

Captulo VIII

Marcadores moleculares
Mara de Lourdes Torres y Lorena Meja

99

Captulo IX

Biofertilizantes. Microorganismos benficos en agricultura

Elizabeth Hodson de Jaramillo, Ph.D. y Lucia Ana Daz-Ariza, M.Sc.

109

Captulo X

Conservacin in vitro de los recursos genticos vegetales

Ana Abdelnour Esquivel

125

Captulo XI

Agroinfeccion: una tecnica sencilla para el mejoramiento de plantas

Rosa Mara Rangel Cano

145

Glosario

157

Bibliografa

159

La Fundacin REDBIO Internacional

Conocimiento Biotecnolgico Integrado

Fundacin Redbio Internacional es una organizacin No Gubernamental sin fines de
lucro que promueve el desarrollo y la utilizacin responsable de la biotecnologa como
elemento clave para el crecimiento competitivo y sustentable de la produccin agropecuaria
y forestal de la Regin.
Lanzada como idea en 1998 y creada en el ao 2002 como una Organizacin no
Gubernamental sin fines de lucro, la Fundacin REDBIO Internacional (FRI) acta como
brazo ejecutor de la REDBIO, con el objetivo principal de facilitar y promover la cooperacin,
la investigacin en conjunto, y la transferencia de biotecnologa agropecuaria como parte de
las actividades designadas como prioritarias de la red REDBIO/FAO.
La Fundacin es el brazo ejecutivo de la REDBIO (Red de laboratorios de biotecnologa
agropecuaria de Amrica Latina y el Caribe). Esta RED promovida por la Organizacin de
las Naciones Unidas para la Agricultura y la alimentacin (FAO), congrega a investigadores
y universidades, as como pequeas y grandes empresas de Amrica Latina y el Caribe,
para facilitar el intercambio del conocimiento que se generan dentro y fuera de la Regin y
potenciar esfuerzos reduciendo costos I+D.
El fin ltimo y ms preciado de Fundacin Redbio Internacional es dar a conocer los
beneficios que conllevan el desarrollo y la aplicacin de las biotecnologas y concientizar a la
sociedad del aporte que la misma supone a la modernizacin e integracin de la regin en
el contexto global, a la mejora de la calidad de vida en general y al alcance de la soberana
tecnolgica y alimentaria en particular.
Son objetivos de Fundacin Redbio Internacional el promover la concrecin de los fines
de la Redbio/FAO:
1- Impulsando el intercambio de conocimientos, tecnologa y materiales biolgicos entre las
instituciones y organizaciones pblicas y privadas de los pases de Amrica Latina y el Caribe.

2- Fomentando, el estudio, uso racional y conservacin de la biodiversidad de la regin.

3- Favorecimiento la gestin de proyectos de investigacin y desarrollo entre institutos, laboratorios y
empresas de la regin, con similares a nivel mundial.
4- Auspiciando la capacitacin tcnica y generacin de recursos humanos calificados a todo nivel en temas
de biotecnologa.
5- Asesorando a los gobiernos, organizaciones regionales e internacionales para la consolidacin de estrategias
de desarrollo en biotecnologa.
6- Promoviendo polticas nacionales y regionales de desarrollo de biotecnologa para los sectores productivos
y agroindustriales.
7- Obteniendo contribuciones nacionales e internacionales para cumplir con sus fines.
Desde el ao 2002 La Fundacin Redbio Internacional coordina en la regin acciones para desarrollar
capacidades, formar recursos humanos y brindar asistencia tcnica a los gobiernos e instituciones en temas
relacionados con las biotecnologas.
A tal efecto la FRI cuenta con puntos focales en diferentes pases que recopilan informacin correspondiente a
su mbito especfico a fin de lograr la mejor calidad, mayor seriedad y profesionalismo en los productos y servicios
brindados.Todos los esfuerzos se congregan en el sistema de informacin en biotecnologa agrcola para Amrica
Latina y el Caribe: infoREDBIO, el cual permite acceder a la base de datos que congrega ms de 643 laboratorios
de 32 pases y alrededor de 4000 investigadores.(www.redbio.org)
La FRI basa su accin en 4 mbitos, dentro de los cuales ha coordinado y gestionado varios proyectos.
1. mbito innovacin e investigacin
3. Ambito educacion y comunicacin
2. Ambito marco regulatorio y bioseguridad
4. mbito biotica y aspectos legales.
Conctese a nuestra pgina web www.fundacionredbio.org e infrmese sobre todo lo que hay que saber
sobre las biotecnologas en la regin o al portal de Redbio/FAO www.redbio.org

Alicia Diamante Vice Presidente

Fundacin REDBIO Internacional

Presentacin

El presente manual ha sido preparado a sugerencia de la Fundacin REDBIO Internacional y como parte
de un acuerdo de colaboracin con la Oficina Regional de la FAO. El manual compila contribuciones de
autores investigadores latinoamericanos del sector acadmico y cientfico quienes han volcado su experiencia
en biotecnologas de bajo costo y han aportado los resultados de sus investigaciones.
El objetivo de este trabajo es difundir el uso de las biotecnologas con el propsito de orientar a los
sistemas de pequeos agricultores en el uso de tcnicas novedosas pero simples, sostenibles y de bajo costo.
Se ha basado en la transferencia de conocimientos desde el sector acadmico al productivo mediante
casos ajustados y validados que han permitido su uso por agricultores familiares.
Este aporte busca apoyar el camino de una agricultura sostenible y ecolgicamente segura, obtener
productos inocuos y de mayor calidad, contribuir a la seguridad alimentaria a travs de la generacin de
ingresos por acceso a mercados y mejorar las condiciones laborales de los productores y de sus familias.
El manual est dirigido a facilitadores de procesos de desarrollo rural, tcnicos y extensionistas agrcolas,
organizaciones de productores, maestros de escuelas rurales, pobladores urbanos y peri-urbanos y a los
grupos de Agricultura Familiar y pequeos agricultores en general.
Su edicin ha respondido a las siguientes preguntas:
Cmo facilitar el acceso de los pequeos productores a nuevos conocimientos para que puedan
ayudarles a resolver sus problemas?
Cmo promover el uso de experiencias exitosas en laboratorio entre los pequeos agricultores?
Esperamos que sea til y que cumpla con el propsito pautado.

Sandra Sharry, Dr.

Secretaria Ejecutiva

Alicia Diamante, MSc.

VicePresidente

Juan Izquierdo
Presidente

Prlogo

En los ltimos cincuenta aos la agricultura latinoamericana ha vivido un profundo proceso de transformacin:
se ha integrado fuertemente al mercado; se ha industrializado; ha complejizado su proceso productivo
modernizndolo a travs de la aplicacin de adelantos tecnolgicos en la produccin y utilizando insumos
modernos comprados a la industria, ha modificado sustantivamente sus sistemas de gestin y administracin,
Sin embargo, esta modernizacin ha tenido un carcter desigual e incompleto en todo el continente lo que fue
creando y desarrollando una agricultura fuertemente heterognea. Es por ello que hasta hoy se visualiza en el
continente, un espectro amplio de unidades productivas de diferente dimensin, pero tambin con diferentes
racionalidades.
Vale la pena citar la definicin de agricultura familiar correspondiente a la Plataforma Tecnolgica Regional
sobre Agricultura Familiar del PROCISUR2, en tanto se trata de una definicin consensuada entre equipos
tcnicos oficiales de los pases del MERCOSUR y asociados :
La Agricultura Familiar es un tipo de produccin donde la Unidad Domstica y la Unidad Productiva estn
fsicamente integradas, la agricultura es la principal ocupacin yfuente de ingreso del ncleo familiar, la familia aporta
la fraccin predominante de la fuerza de trabajo utilizada en la explotacin, y la produccin se dirige al autoconsumo
y al mercado conjuntamente.
Segn lo manifestado por los participantes del Foro nacional de Agricultura Familiar (2006), reunido en
Mendoza, Argentina, la agricultura familiar es una forma de vida y una cuestin cultural, que tiene como
principal objetivo la reproduccin social de la familia en condiciones dignas, donde la gestin de la unidad
productiva y las inversiones en ella realizadas es hecha por individuos que mantienen entre s lazos de familia, la
mayor parte del trabajo es aportada por los miembros de la familia, la propiedad de los medios de produccin
(aunque no siempre de la tierra) pertenece a la familia, y es en su interior que se realiza la transmisin de valores,
prcticas y experiencias.
Se incluye en esta definicin genrica y heterognea distintos conceptos que se han usado o se usan en
diferentes momentos, como son: Pequeo Productor, Minifundista, Campesino, Chacarero, Colono, Productor
familiar, y en nuestro caso tambin los campesinos sin tierra, los trabajadores rurales y las comunidades de
pueblos originarios, lo cual es compartido por el enfoque de este manual.

Tanto a nivel nacional como regional es fundamental considerar el carcter multifuncional de la Agricultura
Familiar, sobre todo en lo que se refiere a la produccin de alimentos de alta calidad y seguridad, al mantenimiento
del equilibrio de los ecosistemas, al desarrollo de actividades econmicas no agropecuarias que fortalecen el
desarrollo territorial y local, a la generacin y mantenimiento de puestos de trabajo, a la ocupacin territorial, y la
posibilidad de evitar la expulsin masiva de agricultores y poblacin rural a las zonas urbanas.
Segn el investigador brasileo Elibio Rech, la introduccin de la tecnologa en la agricultura familiar puede
ser un derecho fundamental y crucial para la participacin efectiva y ms continua en este importante sector de los
agronegocios en el desarrollo econmico y social de los pases de latinoamerica. Sin embargo, la tecnologa debe ser
configurado como parte de una estrategia de desarrollo que requiere un anlisis ex ante en relacin con la naturaleza y
la fuerza, combinado con un conjunto de intervenciones complementarias que permitan maximizar los efectos positivos
y mitigar los costos sociales. El uso de la biotecnologa podra ayudar a resolver diferentes problemas y ampliar los
resultados obtenidos por la agricultura familiar, con profundas consecuencias en la calidad de vida de las familias de
agricultores y la agroindustria moderna.
Las biotecnologas comprenden el uso de organismos (tambin partes de organismos
o sus procesos) para obtener bienes, productos y servicios.
Las biotcnicas abarcan desde las simples herramientas del cultivo de tejidos hasta la complejidad de la
tecnologa del ADN recombinante y la genmica.
Por ejemplo, dentro de las biotcnicas mas difundidas, la micropropagacin permite obtener plantas sanas
y libres de enfermedades (captulos 5 y 6), las nuevas tcnicas de reproduccin animal permiten aumentar la
productividad, los kits de diagnstico se utilizan para la identificacin de las enfermedades (capitulo 8), el uso
de de cultivos tolerantes a la salinidad, la sequa, el fro y aumentando el valor nutritivo de diferentes alimentos
permite la expansin de la produccin en reas que no podan ser utilizadas en el pasado (capitulo 11), el uso
de tecnologas de ADN recombinante permite aumentar el tiempo de maduracin de la fruta, lo que facilita
su comercializacin y reducir de las prdidas postcosecha, la biorremediacin minimiza el impacto ambiental, el
cultivo de tejidos in vitro permite aumentar la variabilidad gentica (capitulo 2), la biofertilizacin facilita practicas
mas amigables con el ambiente (capitulo 9) y varias biotcnicas facilitan la conservacin de los recursos genticos,
como semillas y brotes (capitulo 10), entre otros.
Con esta disponibilidad de opciones de uso y aplicacin de nuevas tcnicas, este Manual Conjunto de
estudios de caso sobre biotecnologas simples, sostenibles y de bajo costo para la agricultura familiar ha sido
diseado como una herramienta de apoyo al quehacer diario del pequeo productor agrcola.

La

distribucin de los captulos del manual por BIOTECNICAS, permite que cada tema sea tratado en forma
independiente. Por lo tanto, su lectura no necesariamente debe seguir el orden clsico de cualquier libro, sino que
se acomodar a la necesidad del lector.
De esta manera, se recomienda acercarse al manual desde la perspectiva de la duda o la necesidad de
informacin. En cada captulo se encontrar una visin general inicial a modo de introduccin, un cuerpo del
captulo, conceptos centrales, guras e imgenes explicativas, en algunos casos una ficha o protocolos para seguir.
Es importante destacar que el usuario del manual puede contar con apoyo par ampliar la informacin, a travs de
la Fundacin REDBIO Internacional y su sitio web. www.fundacionredbio.org.
Pasar de una actividad de autoconsumo a una de proyeccin comercial, necesita un soporte tecnolgico
que es necesario adecuar a las condiciones de produccin para asegurar su sostenibilidad y la eficiencia en
el uso de los recursos en agricultura familiar. Por ello, la idea general del manual es transferir biotecnologas
simples ajustadas en el sector acadmico a agricultores familiares que puedan utilizarlas. Estos protocolos, y
experiencias han sido validadas por los autores y colaboradores.

Una tecnologa validada es aquella tecnologa que ha sido puesta en prctica con xito con agricultores,
especialmente en un entorno rural y que puede ser fcilmente replicable.
La informacin aqu compilada queda disponible como un bien pblico y ha sido desarrollada mediante un
enfoque participativo, contribuyendo a la seguridad alimentaria y al aumento de rendimiento de la tierra y de la
productividad.
Las biotecnicas aqu explicadas, pueden ser adaptadas en varios lugares y son fciles de adoptar por diversos
grupos de usuarios. En general, requieren un aporte bajo de insumos y son acordes con el uso sostenible de los
recursos naturales
Confiamos que la aplicacin de un novedoso y prctico equipo de tcnicas permita
vislumbrar horizontes de mayores beneficios para los pequeos productores.
Nuestra misin es promover el desarrollo e implementar participativamente
biotecnologas de punta, simples, eficientes y de bajo costo en los procesos productivos,
como una herramienta tecnolgica que permita incrementar rendimientos, reducir
costos de produccin y mejorar la calidad de los procesos productivos de los pequeos
agricultores.
Sandra Sharry, Editora.

Autores
Juan Izquierdo Fernndez
Presidente, Fundacin REDBIO Internacional
Director del Magister de Gestion Tecnolgica-Biotecnologa, Universidad de Talca, Chile
juanizquierdo813@gmail.com / jizquierdo@talca.cl

Mara de los Angeles Basiglio

Licenciada en Ecologa
CEPROVE, Centro Experimental de Propagacin Vegativa
Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad nacional de La Plata
maribasiglio@hotmail.com

Alejandro Escandn
Instituto de Gentica Ewald Favret (INTA-Castelar)
REDBIO de Argentina Asociacin Civil
aescandon@cnia.inta.gov.ar

Rosa Mara Oviedo de Cristaldo

Ingeniero Agrnomo, Doctor en Fitotecnia. Docente-Investigador
Centro Multidisciplinario de Investigaciones Tecnolgicas (CEMIT) Universidad Nacional de
Asuncin (UNA). Campus Universitario, San Lorenzo, Paraguay
rosa.cristaldo@gmail.com
Teresa Avila Alba
Ing. Agronoma, Master en Biotecnologa.
Responsable del Area de Recursos genticos y Biotecnologa
Centro de Investigaciones Fitoecogenticas de Pairumani
Casilla de correo 128, Cochabamba, Bolivia
t.avila@fundacionpatino.org
Iselen Trujillo
Dra en Ciencias. Mencion Botanica. Area Biotecnologia Agricola. Profesor Asociado. Investigadora.
Universidad Nacional Experimental Simon Rodriguez
Instituto de Estudios Cientificos y Tecnologicos-IDECYT. Altos de la Mariposa. Sector El Cuji.Via
San Antonio de los Altos. Edo. Miranda. Venezuela
iselen03@yahoo.com

Rosa Mara Rangel Cano

Irapuato Km. 9.6 lib NTe Carretera Irapuato - Leon. Irapuato, Gto. Mexico
mail de contacto: ali.raca@hotmail.com
Tcnico de Investigacin
Departamento de Inegniera Gentica

Alicia Rangel Cano

Irapuato Km. 9.6 lib NTe Carretera Irapuato - Leon. Irapuato, Gto. Mexico
mail de contacto: ali.raca@hotmail.com
Tcnico de Investigacin
Departamento de Inegniera Gentica

Ana Abdelnour Esquivel

Centro de Investigacin en Biotecnologa,
Instituto Tecnolgico de Costa Rica. Cartago, Costa Rica.
aabdelnour@itcr.ac.cr

Elizabeth Hodson de Jaramillo

Profesora Emrita Facultad de Ciencias - Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia
Carrera 7 N 40-62 Tel 571 3208320 Ext 4042
ehodson@javeriana.edu.co

Sandra Sharry
Secretaria Ejecutiva, Fundacin REDBIO Internacional y Profesora
Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata
ssharry@gmail.com

Marcos Rodrguez Fazzone

Consultor FAO en Buenas Prcticas Agrcolas y Agricultura Familiar
marcos.rod@gmail.com

Lorena Meja
Licenciada en Biotecnologia Universidad San Francisco de Quito.
Asistente de Laboratorio de Biotecnologia Vegetal USFQ.
Maestrante de Maestria en Microbiologia USFQ
marilo.mc@gmail.com

Mara de Lourdes Torres

Maria de Lourdes Torres
Vicedecana, Coordinadora Biotecnologa
Colegio de Ciencias Biolgicas y Ambientales
Universidad San Francisco de Quito
ltorres@usfq.edu.ec
Lucia Ana Daz-Ariza
Profesora Asociada, Coordinadora Laboratorio Asociaciones Suelo-Planta-Microorganismo
LAMIC. Unidad de Biotecnologa Vegetal, Departamento de Biologa - Facultad de Ciencias,
Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia
Carrera 7 N 40-62 Tel 571 3208320 Ext 4056
luciana@javeriana.edu.co

Captulo I

La pequea agricultura
un escenario para la intensificacin sostenible de la produccin
incluyendo la aplicacin de las biotecnologas simples

Juan Izquierdo Fernndez

Sandra Sharry
Marcos Rodrguez Fazzone

19

El presente artculo se ha preparado como captulo introductorio al presente

manual de biotecnologas simples para la agricultura familiar que ha sido
compilado y editado bajo al coordinacin de la Fundacin REDBIO internacional
y la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata,
Argentina. El documento recoge la accin anterior de la secretaria tcnica de la
red REDBIO realizada por el autor principal en apoyo al desarrollo y aplicacin
de biotecnologas simples y apropiadas a las condiciones de la pequea
agricultura familiar.

Antecedentes y contexto
En el contexto global, los sistemas actuales de produccin y distribucin de alimentos no estn
consiguiendo alimentar correctamente al mundo1. El nmero total de personas subnutridas en 2010
se estim en 925 millones, cifra mayor que la existente hace 40 aos, y en los pases en desarrollo la
prevalencia de la subnutricin asciende al 16%2. Cerca del 75% de las personas ms gravemente afectadas viven en zonas rurales y sus medios de subsistencia dependen directa o indirectamente de la
agricultura.
Adicionalmente, se estima que la poblacin de la Tierra pasar de aproximadamente 6 900 millones
de personas en 2010 a unos 9 200 millones en el 20503, por lo que la seguridad alimentaria mundial se
ver amenazada por diversos acontecimientos.
El empleo de productos agrcolas en la produccin de biocombustibles tambin continuar aumentando. En 2020, en los pases industrializados se podran consumir 150 kg per cpita anuales de maz en
forma de etanol, cifra similar a los ndices de consumo de cereales en los pases en desarrollo4.
Tales cambios en la demanda motivarn la necesidad de aumentar notablemente (70%) la produccin mundial de todos los principales cultivos para la alimentacin de las personas y los animales y en
especial en la pequea agricultura. Dicha cifra equivale a una produccin anual de 1 000 millones de
toneladas adicionales de cereales y 200 millones de toneladas adicionales de carne para 2050 en comparacin con la produccin registrada entre 2005 y 20075.
Este escenario ha llevado a revalorizar la vigencia de la Agricultura Familiar (AF) como un sector
fundamental en el abastecimiento de alimentos para la sociedad y ms an, como actor protagnico en

1 FAO. 2011. Ahorrar para crecer. http://www.fao.org/ag/saveand-grow/es/index.html

2 FAO. 2010. El estado de la inseguridad alimentaria en el mundo: La inseguridad alimentaria en
crisis prolongadas. Roma.
3 Naciones Unidas. World urbanization prospects, the 2009 revision population database (http://
esa.un.org/wup2009/ unup/).
4 Rosegrant, M.W., Ringler, C.
y Msangi, S. 2008. International
model for policy analysis of agricultural commodities and trade
(IMPACT): Model description.
Washington, DC, IFPRI.

5 Bruinsma, J. 2009.The resource

outlook to 2050: By how much
do land, water and crop yields
need to increase by 2050? Documento presentado en el Foro
de Expertos de Alto Nivel de la
FAO sobre como alimentar al
mundo en 2050, 2426 de junio
de 2009. Roma, FAO

20

la lucha contra la inseguridad alimentaria. Es que su importancia en

Amrica Latina es indudable: en promedio las unidades productivas
en manos de este grupo representan el 80%; absorben ms del
60% del empleo sectorial y aportan entre e 30 y el 40 % del valor
bruto de la produccin agropecuaria. (FAO BID, 2007).
En Argentina, el 66% de las unidades agropecuarias son manejadas por agricultores familiares; absorben ms del 53% del empleo permanente rural, el 29% del empleo transitorio, y aportan el
20% del valor bruto de la produccin agropecuaria. En la cadena
hortcola, especialmente en zonas peri urbanas de la Provincia de
Buenos Aires, concentran entre 70 y 80% de las unidades, lo que
representa el 47% del total de la superficie dedicada a esta actividad (IICA/PROINDER, 2007).
A pesar de que an no existe un concepto claro y consensuado sobre este grupo, los valores mencionados son un indicativo de
que la Agricultura Familiar excede ampliamente a los productores
vinculados con la pobreza rural y por el contrario, se evidencia un
claro potencial productivo. FAO identifica una tipologa que permite
concluir que, si bien un 52% del total de las unidades de la AF en Argentina est relacionada con estados de subsistencia, el 48% restante
se encuentra en una situacin de transicin y consolidacin de su actividad econmica, siendo la agricultura comercial su principal fuente
de ingresos. En este segmento es posible encontrar una estructura
heterognea de produccin que, en funcin de sus activos, puede
ir desde explotaciones minifundistas hasta niveles ms elevados de
tierra y capital, pero con similares problemas de gestin, manejo tcnico y comercializacin que no les permite prosperar.
Lo anterior deja de manifiesto la necesidad de priorizar el diseo de programas especficos para cada subgrupo tipolgico, pero
con un mismo objetivo de inclusin, sostenibilidad y produccin
con inocuidad. en su posicin como productores y abastecedores
de alimentos para la sociedad.

Agricultura familiar: estrategias de desarrollo rural

basadas en la seguridad alimentaria
y las buenas prcticas

En este contexto, surgen la Buenas Prcticas Agrcolas (BPA)6

como un desafo adicional para la pequea agricultura, en especial
para aquellas explotaciones que no han logrado una consolidacin
de su actividad agrcola. Pero desde otra perspectiva, las BPA tambin pueden transformarse en una oportunidad para desarrollar
el potencial productivo de este grupo e impulsarlo hacia procesos
ms competitivos y sostenibles.
Las BPA consisten, en una visin amplia, en la aplicacin del
conocimiento disponible a la utilizacin sostenible de los recursos naturales bsicos para la produccin, en forma benvola, de productos
agrcolas alimentarios y no alimentarios inocuos y saludables, a la vez
que se procuran la viabilidad econmica y la estabilidad social7.
De esta definicin se desprende que las BPA no deben ser concebidas solamente como una norma o un requisito estrictamente
comercial para acceder a mercados externos exigentes. En el plano operativo, la aplicacin y cumplimiento de las BPA enfrenta un
conjunto de dificultades que no necesariamente se relacionan con
la buena voluntad de los productores. Los problemas se vinculan
con deficiencias productivas, econmicas y con aspectos socioculturales y ambientales que hoy caracterizan a gran parte del sector
rural. Por lo tanto, si bien el marco regulatorio es importante, desde
la accin, las BPA deben ser fomentadas como una estrategia de
desarrollo rural integral.
Por lo tanto el desafo es implementar BPA a partir de tecnologas sostenibles (incluyendo
a las biotecnologas simples) y
programas de incentivos para

6 www.rlc.fao.org/es/agricultura/bpa/docfao.htm
7 www.rlc.fao.org/es/agricultura/
bpa/docfao.htm

21

8 Una experiencia valiosa en

terminos de metodologas de
extensin y asistencia tcnica
para el pequeo productor, se
viene desarrollado en Antioquia,
Colombia, Uno de los enfoques
de formacin de los agricultores
para incorporar prcticas de gestin sostenible de los recursos
naturales a sus sistemas agrcolas
que ha obtenido mejores resultados, es la metodologa de extensin conocida como Escuelas de
Campo para agricultores. El enfoque de las escuelas de campo
para agricultores, introducido por
primera vez en Asia suroriental
a finales de la dcada de 1980
como parte de un programa
regional de la FAO de manejo
integrado de plagas para el arroz,
ha sido adoptado en ms de 75
pases y en la actualidad abarca
una gran variedad creciente de
cultivos y cuestiones relativas a la
produccin agrcola. Un reciente
proyecto de FAO en Antioquia,
Colombia ha demostrado la
generacin de ingresos significativos en cadenas agrcolas en
donde a travs de BPA y comercializacin de productos inocuos
diferenciados con una marca
social, asociaciones de pequeos
agricultores familiares estn mejorando su seguridad alimentaria
y ofreciendo al mercado productos sanos y de calidad.

la Agricultura Familiar, ms que como una norma

o exigencia que pueda excluir de la dinmica de
los mercados a los productores que no cumplen.
Estos incentivos implican necesariamente una estrategia integral, guiada por la innovacin tecnolgica, el uso de semillas y propgulos mejoradas
de calidad controlada, bioinsumos( biopreparados,
bioinculos, bioprocesos) y un eficiente manejo
del cultivo, junto a un constante acompaamiento
de la gestin predial, la organizacin y la comercializacin.
Ello implica un desarrollo endgeno e integral, donde en una primera instancia, las BPA se
enfoquen en mejorar la productividad de la Agricultura Familiar y sus vnculos con los mercados
locales formales y ms competitivos, para en una
segunda etapa acceder a procesos de certificacin y acercarse a las exigencias de las cadenas
agro-exportadoras.
Intensificacin sostenible de la produccin agrcola (ISPA) incluyendo la aplicacin de las biotecnologas simples.
La intensificacin sostenible ha sido descrita por FAO como un proceso de aprendizaje
social, dado que los conocimientos necesarios
suelen ser ms amplios que los empleados en la
mayora de los enfoques agrcolas convencionales.
Por ello, la ISPA requerir un refuerzo notable de
los servicios de extensin de fuentes tanto tradicionales como no tradicionales para respaldar su
adopcin por parte de los agricultores8.

En la mayora de los pases en desarrollo existe poco margen para ampliar las tierras cultivables.
En Amrica Latina en cambio, aunque existen
tierras disponibles, la gran mayora de ellas estn
afectadas por la degradacin o sufren limitaciones
relativas al suelo y al terreno. Por lo tanto, entre
2015 y 2030 aproximadamente el 80% del incremento necesario de la produccin de alimentos
tendr que proceder de la intensificacin en forma de aumento del rendimiento y de la intensidad
del cultivo a travs de prcticas sostenibles. Categricamente no se pueden continuar con las prcticas de degradantes de monocultivo, cultivo convencional del suelo, uso irracional de insumos. En
este sentido PNUMA ha calculado que las prcticas actuales insostenibles de uso de las tierras
cultivadas resultan en prdidas netas de del 0,2%
anual. En los prximos aos la intensificacin de
la produccin agrcola ser necesaria de manera
creciente en zonas de produccin ms marginales
con unas condiciones productivas menos fiables,
como menor calidad del suelo, menor acceso a
agua y climas menos favorables.
Un desafo de magnitud global es la necesaria adaptacin al cambio climtico en escenarios
variables de alteracin de la temperatura, precipitaciones e incidencia de las plagas, lo que determinar qu cultivos se pueden producir y cundo,
adems de su rendimiento potencial. A corto plazo se prev que aumenten la variabilidad climtica
y los episodios meteorolgicos extremos en todas las regiones y que tengan efectos negativos en
los rendimientos.

22

Es conocido que la agricultura produce cerca

de una tercera parte de las emisiones de gases
de efecto invernadero lo que supone un reto aun
mayor para los sistemas agrcolas convencionales
que requieren una gran cantidad de recursos que
adems se mueven en niveles de incertidumbre
debido al precio y la disponibilidad de la energa
necesaria para garantizar el funcionamiento de
las explotaciones. Esto hace necesario considerar
diversificar notablemente las fuentes de energa
para reducir el costo de los combustibles con vistas a incrementar la intensificacin agrcola.
En este escenario anterior, los pequeos productores, quienes dependen en gran medida de
los bienes y servicios ecosistmicos para proporcionar alimentos, combustible y fibra para sus familias y el mercado, son ms vulnerables a la reduccin de la calidad y la cantidad de los recursos
naturales y a los cambios climticos.
La intensificacin sostenible propuesta por
FAO se ha definido como el incremento de la
produccin a partir de la misma rea de tierra al
tiempo que se reducen los efectos negativos para
el medio ambiente y se aumenta la contribucin al
capital natural y el flujo de servicios ambientales9.
En lnea con lo anterior los estudios demuestran
que los sistemas agrcolas que conservan servicios
ecosistmicos mediante el empleo de prcticas
como la labranza de conservacin, la diversificacin de cultivos, la intensificacin de las leguminosas y el control biolgico de las plagas obtienen
tan buenos resultados como los sistemas intensivos que requieren gran cantidad de insumos.

El enfoque ecosistmico debe aplicarse a lo

largo de toda la cadena alimentaria con vistas a
incrementar la eficiencia y a reforzar el sistema
alimentario, especialmente a nivel de la pequea
agricultura. Entre tales sistemas y prcticas se incluyen el mantenimiento del suelo sano para mejorar la nutricin de los cultivos, el cultivo de una
gran diversidad de especies y variedades en asociaciones, rotaciones y secuencias, el uso de variedades bien adaptadas y de alto rendimiento y de
semillas de buena calidad, el manejo integrado de
plagas, enfermedades y malas hierbas y la gestin
eficiente del agua.
Lo anterior implica la identificacin de los sistemas productivos insostenibles que requieren
atencin prioritaria (salud del suelo, calidad del
agua, conservacin de la biodiversidad, etc.).
En todos ellos y aunque el documento citado
de FAO no lo menciona, la aplicacin de biotecnologas simples apropiadas cobra relevancia a la
hora de elaborar este tipo de programas.

En un sentido amplio,
biotecnologas incluye
por lo tanto conocimientos tradicionales y
locales, prcticas orgnicas y agroecolgicas,
mejoramiento gentico,
aplicacin de cultivo de
tejidos y de tcnicas genmicas, mejoramiento
con ayuda de marcado-

El International Assessment of Agricultural

Knowledge, Science and Technology for Development, por sus siglas IAASTD10, defini las biotecnologas en la forma en que lo hace la Convencin
sobre diversidad biolgica (CBD), esto es, como
cualquier aplicacin tecnolgica que usa sistemas
biolgicos, organismos vivientes, o derivados de estos,
para elaborar o modificar productos o procesos para
un uso especfico.

res e introduccin de
genes, por ejemplo.

9 FAO. 2011. Ahorrar para crecer. http://www.fao.org/ag/saveand-grow/es/index.html

10 http://www.agassessment.org/

23

La biotecnologa ha hecho
contribuciones enormes a
la agricultura y hay algunas
biotecnologas tan antiguas
como la fermentacin

En cambio las biotecnologas modernas son definidas por el Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad y se conocen comnmente como la
manipulacin de material gentico y fusin de clulas ms all de las barreras
normales de mejoramiento gentico, y el ejemplo ms comn es la ingeniera
gentica que se utiliza para generar organismos genticamente modificados
(OGM). La IAASTD observa que el uso del trmino moderno es slo convencional y que en ninguna forma sugiere que estas tcnicas son ms sofisticadas o pertinentes que otras biotecnologas con una historia ms extensa.
Resumiendo, las biotecnologas comprenden el uso de los organismos
o partes de los seres vivos con el fin de obtener bienes y servicios. Su
zona de estudio est entre la biologa, la bioqumica y la ingeniera y tiene
adems gran repercusin en la farmacia, medicina, microbiologa, acuicultura, la ciencia de los alimentos y la agricultura, entre otros campos.

Las nuevas biotecnologas comprenden el uso de tecnologas de ADN

recombinante o ingeniera gentica asociadas con la bioinformtica y las
omicas11. Las biotecnologas se asocian a los animales transgnicos o plantas
transgnicas, siendo estos slo uno de los productos biotecnolgicos de
avanzada. Las biotecnologas tambin estn, por lo comn, asociadas con la
investigacin de nuevas terapias y dispositivos de diagnstico12.
Segn la FAO (ABDC-2010), el objetivo de las biotecnologas, tanto
la convencional como la moderna, debera reorientarse en beneficio de
los campesinos pobres en los pases de escasos recursos.

Las biotecnologas agrcolas en los pases en desarrollo deben abordar

las necesidades especficas de los pequeos productores, por lo que deben
fomentar su participacin y la de todas las partes interesadas en el proceso
de toma de decisiones y la necesidad de polticas nacionales efectivas y favorables que faciliten el desarrollo y uso de biotecnologas apropiadas en los
pases en desarrollo, es imperativo. Las biotecnologas agrupan a una amplia
gama de herramientas y metodologas que se aplican en cierta medida en

11 Ingeniera gentica es la tecnologa que permite la manipulacin y transferencia de ADN

de un organismo a otro, lo que
permite la creacin de nuevas
variedades de plantas, animales
y microorganismos, la correccin
de defectos genticos y la fabricacin de numerosos compuestos.
La tecnologa de ADN recombinante permite aislar y manipular
un fragmento de ADN de un
organismo para introducirlo en
otro
Omicas: El trmino micas hace
referencia a las disciplinas como
la genmica, la protemica, la
transcriptmica y la metabolmica. A estas tres ltimas tambin
se las agrupa bajo la denominacin de genmica funcional, ya
que estudian a los productos de
la expresin de los genes. Todas
las micas se basan en el anlisis
de un gran volumen de datos, y
por lo tanto se valen de la bioinformtica y de tcnicas rpidas y
automatizadas de alto rendimiento (high-throughput techniques).
http://www.argenbio.org/
12 Sharry S. 2011. Biotecnologas
modernas: la responsabilidad del
no hacer.In press

24

Las biotecnologas pueden

coadyuvar al desarrollo
sustentable: desde marcadores de ADN para apoyar al fitomejoramiento, la
micropropagacin, hasta la
caracterizacin molecular
para desarrollar cultivos
microbianos mejorados

cultivos, ganadera, sector forestal, pesca y acuacultura, y agroindustrias, para contribuir a la reduccin
del hambre y la pobreza, la adaptacin y mitigacin
del cambio climtico y para mantener la base de
recursos naturales en los pases en desarrollo.El
debate que rodea a los organismos genticamente modificados (OGM) frecuentemente dificulta
el desarrollo de otras biotecnologas agrcolas en
donde no existe controversia sobre sus posibles
impactos ambientales y sus beneficios para los pequeos productores, as como sobre su importante
papel frente al cambio climtico.

para alimentos, biocontroladores, biofertilizantes y

bebidas fermentadas.

13 IZQUIERDO, Juan and DE LA

RIVA, Gustavo A. Plant biotechnology and food security in Latin America and the Caribbean.
Electronic Journal of Biotechnology [online]. 15 April 2000, vol.
3, no. 1 [cited February 2006].
Available from Internet: http://
www.ejbiotechnology.info/content/vol3/issue1/full/1/index.html.
ISSN 0717-3458.

Los productos y servicios agrobiotecnolgicos

comerciales (cultivos transgnicos, agentes de
biocontrol, mtodos de diagnsticos, bioprospeccin, propgulos indexados y micropropagacin
masificada), estn siendo gradualmente comercializados en el sector agrcola latinoamericano. Sin
embargo, para su insercin como biotecnologa
apropiadas a las condiciones de produccin y a la
realidad socioeconmica y cultural de la Regin,
se deben superar un conjunto de obstculos cientficos y tecnolgicos, legales y regulatorios, que
impiden la eficiente y equitativa utilizacin de estos productos y servicios.
Biotecnologas apropiables significan he-

14 Wendt, J. Izquierdo, J. 2003.

Management of appropriate
agricultural biotechnology for
small producers: case study
Ecuador. Electronic Journal of
Biotechnology Vol. 6 No. 1, Abril
15 de 2003.

rramientas biotecnolgicas que contribuyen

al desarrollo sostenible al ser tcnicamente
factible dentro del nivel de desarrollo tcnico-cientfico de un pas; al proveer beneficios
tangibles a los destinatarios y ser ambiental-

mente seguras, y socio econmicamente y

culturalmente aceptables. Son aquellas biotecnologas que promueven el desarrollo de
una agricultura sostenible a travs del uso de
recursos genticos y procesos de transformacin de dichos recursos considerando la cultura y tecnologa local13.

Para que la aplicacin de las tcnicas biotecnolgicas no resulte en actividades aisladas con
poca relevancia y con aceptacin por parte de
los productores y consumidores, es necesario enmarcar dichas tecnologas en el concepto de una
biotecnologa apropiable y apropiada. Este concepto tiene como objetivo orientar la aplicacin
de la biotecnologa de una manera responsable y
viable, orientada a las necesidades reales, tanto de
los productores como de los consumidores.
La biotecnologa tiene que verse desde la
perspectiva de los impactos de la investigacin en
los beneficiarios, la aceptacin del producto por
parte de los beneficiarios y consumidores finales, la concrecin de capacidades en investigacin
conjuntamente con la viabilidad cientfica y econmica y finalmente con la evaluacin de los riesgos
potenciales para la salud y el medioambiente.
En ste contexto, segn Wendt e Izquierdo
(2002)14, es sumamente importante que antes de
realizar cualquier actividad se deba analizar:
La relevancia de la investigacin para los beneficiarios

25

La aceptacin del producto por parte de los

beneficiarios y consumidores
La disponibilidad real de insumos para realizar la investigacin (recursos humanos y financieros, tecnologas, etc.) y su viabilidad
El riesgo potencial para el medio ambiente
y la salud
La oportunidad y pertinencia segn el cultivo y el estado de avance tecnolgico local. Antes
de soluciones biotecnolgicas pueden haber alternativas ms baratas y viables desde tecnologas
tradicional y/o convencional para responder a un
determinado problema.
La sostenibilidad econmica, en la medida en
que la solucin debe tender al auto sostenimiento
y permanecer en el tiempo, aun cuando el apoyo
o soporte inicial termine y el proceso quede en
manos de los agricultores o autoridades locales.
La sostenibilidad ambiental, en la medida en
que la biotecnologa clsica o moderna puede tener un impacto ambiental en el corto, mediano y
largo plazo que debe ser evaluado antes de iniciar
su aplicacin.
Con base en esta concepcin, la biotecnologa
ofrece oportunidades para la pequea agricultura
dentro del siguiente marco:
1. Seleccin del material en campo
con base en sanidad y productividad en
diferentes regiones geogrficas.
2. Conocimiento del nivel de diversidad gentica y tamizaje de la especie.

3. Dependiendo de la respuesta de la
especie a factores biticos y abiticos, la
bsqueda de soluciones mediante aplicacin de bioinsumos, sistemas de control
integrado de plagas y enfermedades y el
mejoramiento gentico convencional o
moderno.
4. Multiplicacin de la especie por mtodos convencionales o por cultivo de tejidos para incrementar la oferta de material vegetal, lo que contribuye a fortalecer
los programas de fomento, y
5. Implementacin del paquete tecnolgico y prcticas culturales apropiadas
para el establecimiento del material promisorio en campo.
Los estudios de caso realizados por REDBIO
en Argentina15, Bolivi16, Colombia17, Ecuador18 y
Per19 demuestran que si bien en la aplicacin
de la biotecnologa moderna ha habido importantes influencias de las multinacionales que controlan el mercado de las semillas transgnicas
con avances muy significativos en la siembra de
variedades geneticamente modificadas (OGMs),
existen oportunidades para la utilizacin sostenible de la agrobiodiversidad a travs de las biotecnologas simples y que es necesario un marco
institucional y poltico que permita el establecimiento de las capacidades necesarias para el
aprovechamiento efectivo del potencial que representa la biotecnologa en especial enfocando
a la seguridad alimentaria20.

15 www.argenbio.org/adc/
uploads/pdf/manejo_y_gestion.
doc
16 http://www.redbio.org/
estud_casos.htm
17 www.cauca.gov.co/.../
Manejo_y_gesti_n_de_la_
biotecnolog_a_agr_cola_
18 www.rlc.fao.org/es/agricultura/pdf/ecuador.pdf
19 http://www.bio-nica.info/
biblioteca/Pastor2004BiotenologiaPequeos.pdf
20 Izquierdo, J y de la Riva, G.
2000. Plant biotechnology and
food security in Latin America
and the Caribbean. EJB Electronic
Journal of Biotechnology, 3 (1)
April 15.

26

Para que la biotecnologa

beneficie a los pequeos
agricultores, sus requerimientos, capacidades,
prioridades y limitaciones
deben ser incorporados
en los proyectos de desarrollo de esta tecnologa.
Por aadidura, y para el
caso de las agrobiotecnologas, en general la gente
local sabe priorizar las
soluciones que le harn
economizar esfuerzos y
dinero. Es el entramado
social el que tracciona
para que estos cambios
se produzcan y para que
la generacin, adopcin o
adaptacin de nuevos productos biotecnolgicos se

En particular el cultivo de clulas y tejidos

Las biotecnologas simples, como se vern

vegetales in vitro incluyendo la micropropaga-

en el presente manual representan un apoyo

cin, la embriognesis somtica, el rescate de

directo a la intensificacin sostenible de la pro-

embriones, la regeneracin de plantas a partir

duccin para la pequea agricultura. El objetivo

del callo y suspensiones celulares, as como el

es no slo valorar el conocimiento cientfico

cultivo de protoplastos, anteras y microsporas,

que sustenta cada una de las biotcnicas (com-

estn permitiendo la conservacin y multipli-

pila los desarrollos de destacados investigado-

cacin a mayor escala de numerosas especies

res de Amrica latina), sino especialmente el

y la obtencin de material vegetal libre de vi-

conocimiento prctico que permite el empleo

rus. La conservacin de germoplasma in vitro

de varias biotecnologas con sentido de utilidad

ha sido trabajada con xito en la regin, tanto

social-productiva, amigable con el ambiente: un

para plantas cultivadas como silvestres.

conocimiento prctico que ofrezca respuesta a

Estas estrategias de conservacin a travs de

biotecnologas simples constituyen un complemento y soporte de los sistemas tradicionales para el
mantenimiento de muchos fenotipos, en especial
para aquellos que presentan problemas fisiolgicos, en particular aquellos relacionados con la viabilidad de las semillas. Las biotecnologas simples,
como se vern en el presente manual representan
un apoyo directo a la intensificacin sostenible de
la produccin para la pequea agricultura.

concrete.
El acceso a la tecnologa
es clave: siempre que se
garantice dicho acceso, las
biotecnologas representan una oportunidad para
que el pequeo agricultor
rompa el crculo vicioso
de la pobreza rural21

A manera de conclusin
En un contexto global caracterizado por el ritmo acelerado y no planificado de la urbanizacin,
el aumento en el precio de los alimentos y los impactos del cambio climtico, las polticas comienzan
a revalorizar la importancia de la pequea agricultura como sector estratgico para la seguridad alimentaria.

los siguientes interrogantes del saber y, especialmente, del saber hacer: qu es cmo es
cmo se usa cmo se mantiene para qu
es para qu se hace para quin es

Las biotecnologas simples son las biotecnologas

que la gente comn puede utilizar para su propio
beneficio y en beneficio de su comunidad
Ello implica el diseo de programas que vinculen a la Agricultura familiar en procesos competitivos y sostenibles, reconociendo su heterogeneidad
y con el objetivo dar garantas sobre la calidad e
inocuidad de los alimentos. Es responsabilidad de
los actores del desarrollo, el de generar, adaptar y
promover prcticas simples y tecnologas que favorezcan este proceso.
La intensificacin sostenible, la
adopcin de Bue-

21 Severino de Melo Araujo,

Subdirector General, Representante Regional para Amrica
Latina y el Caribe, FAO. 1995

27

nas Prcticas y la promocin de biotecnologas simples asumen

un rol preponderante para impulsar a la nueva agricultura.
Ante estos desafos, debemos ser capaces de dejar los dogmas de lado, y orientar todo el conocimiento disponible hacia la
bsqueda de la seguridad y la soberana alimentaria

Captulo 2

Cultivo de Tejidos Vegetales

Mara de los Angeles Basiglio

31

Antecedentes y contexto
El concepto de cultivo de tejidos vegetales incluye las tcnicas y procedimientos de laboratorio
utilizados en el cultivo In vitro de clulas, rganos y/o
plantas completas. Dichas tcnicas son utilizadas ampliamente en biotecnologa y fisiologa vegetal.
Es un conjunto muy heterogneo de tcnicas
donde se asla una porcin de la planta o explanto (pueden ser protoplastos- clulas desprovistas de
pared-, clulas, tejidos u rganos) proporcionndoles todas las condiciones fsicas y qumicas para que
las clulas expresen todo su potencial, cultivndolas
aspticamente en un medio artificial de composicin
qumica definida e incubndolas en condiciones ambientales controladas. (Mroginsky, L et al; 2004).
Tambin se lo conoce como cultivo In vitro de
plantas por realizarse en recipientes de vidrio.
El cultivo de tejidos vegetales es utilizado como
herramienta fundamental en un nmero importante
de reas y tcnicas de la investigacin y produccin

vegetal, todas ellas relacionadas a lo que hoy conocemos como Biotecnologa Vegetal.

Cultivo de tejidos
puede definirse como el

Para el establecimiento de los cultivos utilizando

cualquiera de los sistemas existentes es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes
relacionados con:

conjunto de tcnicas que

el explante (planta donante, estado fisiolgico, posicin de las yemas, tamao del explante)
Factores fsicos (luz, fotoperiodo, calidad, temperatura, humedad)
la asepsia.
el medio de cultivo (seleccin, composicin qumica, forma fsica)
condiciones de incubacin.

protoplastos.

Existen tres conceptos bsicos que fundamentan

el cultivo In vitro de clulas y tejidos vegetales:
Totipotencialidad celular
Desdiferenciacin / Rediferenciacin
Balance de reguladores del crecimiento vegetal

permiten el cultivo en
condiciones aspticas de
rganos tejidos, clula y

El Cultivo de Tejidos
Vegetales es, desde
muchos puntos de vista,
una tecnologa sustentable
que representa una buena
respuesta a muchos problemas de suministro de
alimentos y de materias
primas para la industria y
consumo humanos.

32

La teora de la totipotencialidad celular, postula que toda clula

vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de
un cultivo In vitro, sin importar el grado de diferenciacin alcanzado.

Esquema bsico de uso de reguladores de crecimiento para obtener

plantas In vitro.

Para ello se requieren condiciones especficas referidas al medio

del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc.
La desdiferenciacin consiste en la transformacin y prdida
de las caractersticas de especializacin de un tipo celular para dar
lugar a clulas de tipo meristemtico. El siguiente paso involucrado
en la regeneracin de una planta es la redifereciacin de las clulas
previamente desdiferenciadas.
Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance
entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Grupos bsicos de reguladores del crecimiento:
Auxinas
Citoquininas
Giberelinas
Acido abscsico
Etileno
Generalidades:
Actan a bajas concentraciones
Interactan unos con otros (los resultados estn determinados por
las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).
Los reguladores endgenos del crecimiento estn presentes en la
planta durante todo su ciclo de vida pero su concentracin flucta.
Su concentracin relativa vara en funcin del estado fisiolgico de
la planta y en cada uno de los rganos de sta.
Estn involucrados en numerosos procesos fisiolgicos.

La totipotencialidad celular es caracterstica de un grupo de clulas vegetales conocidas como meristemticas,

presentes en los distintos rganos de
la planta.
La potencialidad de una celula diferenciada (una celula de conduccin, epidrmica, etc) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciacin
alcanzado por esa celula, pero puede revertirse parcial o completamente segn las condiciones de cultivo a las que se la someta.
El xito en la propagacin de una planta depender de la posibilidad de expresin de la potencialidad celular total, es decir, que algunas
clulas recuperen su condicin meristemtica. (Segretin, M; 2008).
Los mtodos de cultivo de tejidos vegetales In vitro tienen numerosas aplicaciones, entre ellas:
Obtencin de plantas libres de virus
Produccin de semillas sintticas
Propagacin masiva de plantas
Clonacin de individuos con caractersticas deseadas
Mejora gentica

33

Conservacin de germoplasma
En todo cultivo de tejidos vegetales
pueden identificarse distintas etapas o
fases bien definidas, cada una con sus
objetivos especficos. Dos de ellas son
comunes a todos los protocolos seguidos, son las Fase 0 o preparativa y
la Fase I tambin llamada de establecimiento o iniciacin de los cultivos.
Fase 0
Es preparativa. Se seleccionan y
preparan las plantas donantes, segn
el estado fisiolgico de las mismas.
Fase 1
Establecimiento de los cultivos
axenicos: Se elige el explanto ms
adecuado y se lo somete al proceso
de desinfeccin para eliminar los microorganismos con el menor dao
posible.
Qu se puede hacer con una tecnologa que multiplica plantas a
una velocidad alta y exponencial, que permite obtenerlas a partir incluso de una sola clula, y que permite manipular incluso dicha clula?
Aplicaciones del CTV
micropropagacin
mejoramiento de plantas
produccin de compuestos de inters comercial

produccin de metabolitos secundarios

produccin de protenas

produccin de polmeros biodegradables
establecimiento de plantas transgnicas

plantas resistentes a virus

plantas con rutas metablicas modificadas
plantas mejoradas en cuanto a composicin de protenas,
aceites, etc.
fitorremediacin

remocin de xenobiticos

remocin de metales pesados
Ventajas de la tecnica:
Incremento acelerado del nmero de plantas derivadas por genotipo.
Reduccin del tiempo de multiplicacin.
Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una
superficie reducida, a bajos costos y en tiempos econmicamente
costeables.
Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga.
Facilidad para transportar el material In vitro de un pas a otro, con
menos restricciones aduaneras.
Posibilidad de multiplicar rpidamente una variedad de la cual
solo existan pocos individuos.
Vas de Regeneracin de plantas mediante CTV.
Para la obtencin de individuos por medio del CTV existen dos
lneas de regeneracin, llamadas organognesis y embriognesis.
Ambas pueden darse de manera directa o indirecta:
Posibles vas morfogenticas:
Organognesis
Embriognesis

34

La directa supone la formacin de

rganos directamente del explanto

La via indirecta se produce a travs

de la formacin de un callo.

35

Cultivo de callos

1) Embriognesis somtica:
La embriognesis somtica
(asexual o adventicia, consiste
en el desarrollo de embriones
a partir de clulas que no son
el producto de una fusin gamtica, o en otras palabras, es
un proceso por el cual se produce una estructura bipolar (embrin) a partir de una clula somtica.
Es la va ms conveniente
debido a que permite
saltar las etapas de formacin de yemas y enrai-

Embriones
somticos en diferentes estadios
de desarrollo.

zamiento regenerando
plantas en una forma mucho ms rpida y eficiente,
disminuyendo el riesgo de
variacin somaclonal.

Esquema de embriognesis somatica. Agrobiotecnologia, UBA.

Diferencias entre las dos posibles vas:

2) Organognesis:
Es el crecimiento de brotes y races en forma sucesiva. Puede
darse por induccin de yemas axilares o adventicias. La organognesis directa sucede cuando los rganos se originan directamente
del explanto en ausencia de la proliferacin del callo. Cuando sucede con fase de callo la organognesis es indirecta.

La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de

clulas del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego
rediferenciarse dando lugar a un rgano vegetal. No se obtienen
por esta va plantas completas.
La embriognesis se presupone de origen unicelular. Una clula
del explanto se asla y constituye el punto de partida para la obtencin de un embrin somtico.

36

Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es una planta completa.

Organogenesis

Embriogenesis

Tipos de cultivos Vegetales:

Cultivo de Meristemas. (ver capitulo 6)
Esta tcnica consiste en el aislamiento del domo apical, ms
uno o dos primordios foliares. El cultivo de meristemas fue utilizado en un inicio, para la eliminacin de hongos y bacterias en
plantas, y poco despus, para la produccin de plantas libres de
virus. Utilidad:
obtencin de plantas libres de patgenos
mantenimiento de plantas libres de enfermedades
clonacin
conservacin de germoplasma
Esquema de embriognesis somatica. Agrobiotecnologia, UBA.

Cultivo de semillas, cotiledones y embriones

(Rescate de embriones):

37

Es posible rescatar al embrin inmaduro y cultivarlo In vitro hasta obtener una planta completa. El cultivo de cotiledones y embriones permite, tambin obtener respuestas que con otro tipo de
explante no se obtendran o se demorara mucho ms tiempo.
Utilidad:
acortar el ciclo de reproduccin
prevenir el aborto embrionario
material de partida para la obtencin de callos y embriones
somticos
superar la latencia de algunas semillas
rescate de embriones hbridos derivados de cruzamientos
interespecficos e intergenricos
estudios de requerimientos nutricionales de embriones en
desarrollo
Cultivo de anteras y granos de polen:
Al comienzo se induce la formacin de microcallos colocando
las anteras en un medio de cultivo cuya composicin estimule selectivamente la divisin celular mittica. El medio para inducir esa
formacin debe tener una alta concentracin de auxinas. Una vez
que los microcallos han alcanzado una longitud de 2mm. son transferidos a un medio de cultivo con menor concentracin de auxinas,
pero alto en citoquininas, para su propagacin.
El sueo de todo fitomejorador es la obtencin de un nuevo
cultivar mejorado en el menor nmero posible de generaciones.
Con esta tcnica, es posible la obtencin de plantas haploides, mediante el cultivo de clulas sexuales, ya sean las microsporas o los
vulos (aunque es ms comn el cultivo de anteras y granos de
polen), y la subsiguiente regeneracin de plantas. El nmero de
especies en la que se produjeron plantas haploides es importante
e incluye a plantas hortcolas (aj, tomate, berenjena, papa, nabo),

frutcolas (manzano, vid, cerezo), cereales (trigo, centeno, cebada,

maz), forrajeras (ray grass, festuca), forestales (lamo).
Utilidad:
Produccin de haploides
Obtencin de plantas homocigotas en todos sus caracteres
Acortar los ciclos de mejoramiento
Cultivo de embriones somticos.Semillas sinteticas
Los embriones somticos tienen, al igual que los cigticos, la
capacidad de formar una nueva planta despus de un proceso de
germinacin, con la diferencia de que la embriognesis somtica es
un proceso asexual por lo que la nueva planta ser exactamente
igual a la donadora de la clula inicial.
Este no es un proceso que sucede nicamente en cultivos In vitro, de hecho es relativamente comn en algunas familias de plantas y se conoce como
apomixis.
Como embriones somticos, asexuales o adventicios se han definido los iniciados a partir de clulas que no son el producto de
la fusin de gametos. Son estructuras bipolares con un eje radicalapical, y no poseen conexin vascular con el tejido materno; las
estructuras bipolares deben ser capaces de crecer y formar plantas
normales.
Utilidad:
altsima tasa de multiplicacin
seleccin de super genotipos
obtencin de semillas de especies que no las forman
desarrollo de semillas artificiales

38

Cultivo de callo en medio lquido.

Se inicia por transferencia de callos friables a un medio en estado lquido, que se disgregan para formar agregados celulares y
clulas libres. Las clulas en suspensin tienen mayor disponibilidad de nutrientes, se dividen y crecen rpidamente, tienen mayor
inestabilidad gentica y bioqumica y requieren de una re-seleccin
continua de lneas celulares.
Utilidad:
obtencin de protoplastos
obtencin de material de partida para crioconservacin
produccin de metabolitos secundarios
biotransformacin
estudios fisiolgicos
Cultivo in vitro
de plantas

Captulo 3

Infraestructura para aplicar biotcnicas simples.

Ideas para el diseo de un laboratorio econmico
de cultivo in vitro de tejidos vegetales

Alejandro Escandn

41

Este captulo tratar sobre el diseo y la organizacin del laboratorio

sencillo y econmico de CTV que permita iniciarse en la actividad
con la inversin ms baja posible.

Introduccin
El desarrollo del cultivo de tejidos vegetales (CTV)
comenz al principio del siglo XX con los trabajos de
Haberlandt (1902), quien intent, por primera vez
(sin mucho xito), cultivar callos con la tecnologa y
la infraestructura disponible en esa poca.

denomina explanto) proporcionndole en esterilidad

y de forma artificial, todas las condiciones fsicas y
qumicas para que las clulas expresen todo su potencial.

Posteriormente el trabajo de investigacin llevado a cabo en la primera mitad del siglo pasado por
botnicos y fisilogos vegetales, el descubrimiento de
las hormonas vegetales y el aprendizaje sobre el uso
de los reguladores del crecimiento vegetal, por un
lado, y por el otro, el avance de la tecnologa (cmaras de cra; zonas estriles; instrumentos de precisin,
entre otros), hicieron posible el desarrollo, a partir
de los 50, de esta disciplina biotecnolgica (el CTV)
que, actualmente, se ha convertido en una muy poderosa herramienta para la seleccin, cruzamiento,
control de enfermedades y produccin en masa de
diferentes especies vegetales, tanto agrcolas, hortcolas, forestales, ornamentales y frutales.

Flujo de trabajo y laboratorio

Bsicamente, el CTV es una prctica por medio

de la cual se asla una porcin de la planta (que se

Definido de esta forma, el

CTV, es un conjunto de
tcnicas que permite la
propagacin de una planta
en forma controlada y libre de patgenos. Se hace

Un laboratorio de CTV debe disponer al menos

de tres sectores: uno para la preparacin del medio
de cultivo y lavado y esterilizacin del material de
vidrio, otro microbiolgicamente limpio, para el establecimiento y la transferencia del cultivo y el tercero,
destinado al cultivo propiamente dicho.

evidente que el desarrollo

Cada uno, como se ver ms adelante, adecuado

y equipado para la actividad correspondiente.

vegetal de inters.

La Figura 1 muestra el sentido del flujo de la

secuencia de la propagacin in vitro de plantas, esta
secuencia se corresponde con las cinco etapas establecidas para una micro propagacin (ver capitulo 5):
preparacin de la planta madre, introduccin in vitro,

de esta actividad requiere

de una infraestructura
mnima que permita la
manipulacin, en forma
adecuada, del material

42

multiplicacin, enraizamiento y aclimatacin. Cada una con sus diferentes grados de complejidad y dificultad. Esto ser determinante
en el diseo de un laboratorio de CTV, dado que la ubicacin de
los sectores donde se lleven a cabo las actividades correspondientes a cada etapa, deberan ajustarse a la secuencia en cuestin.

La Figura 2 muestra el plano de un laboratorio tipo que rene los requisitos propuestos. El sector de laboratorio debe ser el
nexo entre el resto de los componentes del edificio, el vestuario
del personal, as como el sector de lavado y esterilizacin tiene un
contacto directo y libre con el laboratorio, en cambio los sectores
de los cuartos de cultivo y de flujos, si bien adyacentes al laboratorio, el acceso a estos debe ser restringido y controlado, con un
compartimento estanco entre ambos locales a fin de minimizar
el intercambio con el exterior, esto es una puerta ser bloqueada
hasta no cerrar la otra.
Este mismo criterio deber aplicarse con la conexin entre el
laboratorio y el sector fitosanitario, todo material que salga de ese
sector debe ser rigurosamente controlado en cuanto a su sanidad
y el personal responsable deber mudar de ropa al entrar y salir
de ese sector.
Es importante remarcar algunos detalles a tener en cuenta, tanto la zona estril y el sector de cuarto o cmaras de cultivo, as
como el sector de cuarentena/fitosanitario, tienen que estar ubicados de tal forma que queden como fondo de saco o sea, no
deben ser lugares de trnsito, tambin esto se debe a una cuestin
de mantener los sectores lo ms limpios posible, para el sector de
cmaras y estril, por lo que se recomienda es que ambos locales
tengan, cada uno, su puerta independiente y adems una conexin
entre ellos.

Figura 1. El esquema indica los pasos y el flujo de trabajo en un

proceso de rutina de multiplicacin in vitro de plantas.

El local correspondiente al laboratorio propiamente dicho debera ser un ambiente amplio y bien iluminado a fin de permitir un
sector de observacin y anlisis de los materiales. Debe contar con
dos locales anexos, uno para lavado y esterilizacin del material y
otro para depsito de insumos y reactivos, en ambos casos se debe
prever una muy buena ventilacin de los locales, del lavadero en funcin del bienestar de los operadores y el depsito para la evacuacin
adecuada de la posible evaporacin de algunos solventes. Por su par-

43

te, el rea de aclimatacin y el invernculo normal pueden ubicarse

adyacentes al edificio principal y levantarse ambos en una misma
estructura acondicionando cada sector segn corresponda.

Elementos que componen un laboratorio de CTV

(insumos e instrumental)
Siendo el laboratorio de CTV un lugar destinado al cultivo de
clulas y de rganos, los elementos bsicos para tal fin son: contenedores para cultivo (frascos y tubos), gradillas. A continuacin se
har una revisin sobre el instrumental e insumos con los que se
debe equipar el laboratorio de CTV.\
rea de laboratorio y preparacin de medio:
Mesadas.
Reactivos en uso.
Heladeras, freezer.
Destilador.
Balanzas (granataria y de precisin).
pHmetro, agitador magntico.
Vortex.
Sonicador.
Dispensador.
Juego completo de pipetas automticas esterilizables.
Horno micro ondas y anafe.
Material de vidrio (volumtrico, cultivo, etc.).
Material descartable.

Figura 2. Diagrama de laboratorio. Ver texto principal

rea de esterilizacin y lavado

Mesadas.
Autoclave y/o olla de presin.
Destilador de agua.
Estufas de esterilizacin y secado.
Bandejas y/o gradillas de secado,
Lavavajilla y Lava pipetas.
Dispensador de agua destilada.
Cinta indicadora de esterilizacin.
Bandejas para el descarte del material contaminado.
Guantes.

44

rea estril
Flujo laminar
Microscopios estereoscpicos
Herramientas para diseccin
Mesadas
Mechero
rea de cultivo
Buen aislamiento trmico
Estantes
Luces fluorescentes
Acondicionadores de aire
Temporizador
Indicador de temperatura

reducidos; pero presenta el inconveniente que sus

costos son muy elevados respecto a los de los mtodos convencionales tanto para el montaje de un
laboratorio como para el proceso de produccin en
si mismo. En los pases en desarrollo, tanto los reactivos, como los insumos, as como la energa elctrica
son tems relevantes en la composicin de ese costo
(Ges Junghams et al, 2009).
Para iniciar un emprendimiento comercial de
micropropagacin es relevante buscar la manera de
incrementar la eficiencia de produccin y la disminucin de sus costos, por lo que se deber buscar la
manera de optimizar cada etapa del proceso a fin de
incrementar su productividad.

Disminuyendo costos y simplificando el proceso

Hasta aqu se han volcado ideas y conceptos generales para el diseo de un laboratorio de investigacin/produccin, esto no es ms que la opinin
del autor y se pueden hacer muchas variantes sobre
la aqu propuesta, con la salvedad que la experiencia
acumulada remarca fuertemente sobre la importancia de acomodar las estructuras del laboratorio al
flujo del proceso rutinario del cultivo de tejidos, independientemente de la escala que se intente alcanzar. Incluso en el montaje de un laboratorio casero,
con un mnimo de compartimentos, se recomienda
seguir estas indicaciones.
La micropropagacin ofrece una serie de ventajas sobre la propagacin tradicional, entre otras, la
posibilidad de producir un elevado nmero de plantas homogneas y de una muy alta calidad fitosanitaria en un menor plazo de tiempo y en espacios

Los componentes del costo para una micropropagacin, se reparten segn la siguiente proporcin:
mano de obra: 40%; gastos administrativos: 30%; gastos varios (electricidad, mantenimiento): 20% y 10%
para insumos y reactivos (Ahloowalia y Savangikar,
2004), estas proporciones pueden modificarse segn de que pas se trate, pero la tomaremos como
referencia en funcin de mostrar, en los prrafos siguientes, algunas estrategias para reducir los costos
de produccin.
Medios y recipientes de cultivos
El proceso de micropropagacin de plantas,
como se indica en la Figura 1, incluye 5 etapas bien
definidas:

La ejecucin adecuada
de cada una de ellas es la
primera herramienta que
se dispone para disminuir
los costos de produccin
de un laboratorio de CTV.

45

Etapa 0, el precultivo, que se refiere al tratamiento de la planta madre.

Etapa 1: introduccin in vitro, que incluye al proceso de desinfeccin y establecimiento del cultivo.
Etapa 2: multiplicacin: implica el incremento
de la masa de material vegetal.
Etapa 3 de enraizamiento: se induce el desarrollo de races y, por ltimo, la
Etapa 4 de aclimatacin: en la que se adapta a la
planta a vivir fuera de la condicin in vitro.

La estrategia que se
propone es que, para el
ajuste inicial de un protocolo de multiplicacin,
se recomienda utilizar los
reactivos testados como
aptos para cultivo de
tejidos, una vez ajustado
el protocolo se puede
comenzar a introducir, de
a una, variantes de menor
costo y comparar con
el protocolo original la
relacin costo/beneficio
que se obtenga.

En la etapa 2 en la que se desarrolla la fase

de multiplicacin, que justifica todo el proceso,
el medio de cultivo juega un papel fundamental,
sus componentes principales son, bsicamente, el
agua, las sales minerales y la fuente de carbono
(sacarosa, en general). Adems, se utilizan vitaminas (suplementos orgnicos), reguladores del
crecimiento y agentes gelificantes (ver capitulo 4).
Si bien la proporcin de sus componentes depende de cada especie, la formulacin propuesta por
Murashige y Skoog (1962) es, por lejos, la ms
utilizada. En este contexto es impor tante sealar
que los costos del medio de cultivo pueden alcanzar el 15% de los costos de produccin y que
el agente gelificante contribuye con un 70% de
ese porcentaje. Existen alternativas para reducir
los costos, reemplazando el agente gelificante y
la sacarosa, disminuir el costo del agua empleada
(Prakash et al. 2004), as como tambin, probar
con marcas alternativas de reactivos (i.e.: sales minerales) de produccin nacional, cuyo costo es
sensiblemente ms bajo que las marcas de los distribuidores tradicionales.

Alternativas para el agar

El desarrollo de yemas o races bajo condiciones
in vitro est altamente influenciado por la consistencia fsica del medio de cultivo. Asimismo, se debera
considerar que la disponibilidad de los nutrientes
est altamente afectada por el potencial agua del
medio y en esto el soporte utilizado es fundamental.
Varios autores han probado el reemplazo del agar
por diferentes gomas vegetales y almidones, como
el de mandioca al 8%, que dio buenos resultados en
cultivo in vitro de papa (Ges Junghams et al, 2009).
La fibra de algodn es una buena alternativa para el
reemplazo del agar y segn Prakash et al. (2004) ha
sido probado con xito en la multiplicacin de varios
cultivos, como papa, orqudeas, crisantemo y banana.
Fuentes de carbono alternativas
El azcar ms utilizado en el cultivo de tejidos
vegetales es la sacarosa. En su estado de mxima
pureza es un producto cuyo precio oscila entre los
10,00 y los 120 us$ de acuerdo a su calidad, es posible reemplazarlo por el azcar comn, de consumo
humano, el producto ms refinado que se consiga en
el mercado local, cuyo precio es alrededor de 1,00
us$ el kilogramo.
De todas formas, dada la posible presencia de inhibidores del crecimiento vegetal en estas sustancias,
es aconsejable previamente probar el agente gelificante sustituto con el cultivo de inters.

46

Otros componentes del medio

Como se indic antes, es posible disminuir los
costos de produccin utilizando reactivos de produccin local e incluso aquellos de menor pureza
(probar previamente), la diferencia de costos puede
ser hasta 10 veces menor para alguna de las sales.
Tambin es posible encontrar reportes donde se
indica el reemplazo de la sacarosa, las vitaminas y
los micro-nutrientes, por la melaza de caa de azcar (Dhamankar, 1992, citado por Ges Junghams
et al, 2009). Quizs sean las orqudeas el cultivo
para el cual se desarrollaron la mayor cantidad de
medios de menores costos, como el Phytamax
, el KC (Knudson, 1946) el V&W (Vacin y Went,
1949). Incluso muchas especies de orqudeas tropicales fueron multiplicadas en medio conteniendo,
peptona, inositol, agua de coco o pulpa de banana,
estas dos ltimas, muy ricas en hormonas vegetales
(Prakash et al. 2004).

de lluvia en zonas urbanas dado que el alto contenido de contaminantes de la atmsfera, pueden afectar
el desarrollo de los cultivos.

Cualquier recipiente
de vidrio transparente
y de tamao adecuado,

Recipientes para el cultivo

Durante la etapa de multiplicacin el uso de frascos de vidrio de 250-300 ml de capacidad, con boca
ancha, que permiten introducir y cultivar varios brotes
en cada uno, son los ms adecuados.

es apropiado como frasco

de cultivo.

El agua
Es el componente mayoritario del medio de cultivo, normalmente se utiliza agua bidestilada, destilada o deionizada para la preparacin del medio, es
posible reemplazarla por agua comn de red (libre
de metales pesados y contaminantes), de hecho, este
tipo de agua, ha sido utilizado para la multiplicacin
de jengibre y banana (Ges Junghams et al, 2009).
En zonas rurales puede usarse el agua de lluvia
recolectada en recipientes adecuados libres de xido u otra fuente de contaminacin tanto orgnica
como inorgnica. No se recomienda el uso de agua

Los frascos de cultivos denominados Magenta,

son muy utilizados en algunos pases desarrollados,
pero su costo es muy alto y si vida til relativamente
corta, dado que se van opacando con los continuos lavados y esterilizaciones, lo que afecta la luz que reciben
los explantos en cultivo.
Para micropropagacin a gran escala es posible el
uso de sacos de plstico transparente y estril o en
bolsas tipo Ziploc, con cierre hermtico. Esto abarata considerablemente los costos pero tiene el inconveniente que el plstico no permite el intercambio de

Diferentes tipos de
envases para CTV

47

gases, por lo que el uso de esta alternativa implica prestarle mucha atencin a la
evolucin del cultivo a fin de evitar el fenmeno de vitrificacin.
En este contexto es apropiado remarcar la importancia que tiene la tapa del
frasco de cultivo, para la eleccin de este tem se debe priorizar la capacidad del
elemento para aislar microbiolgicamente al explanto tanto como la de permitir el
intercambio de gases con el exterior, favoreciendo la disponibilidad de oxgeno y
dixido de carbono, evitando la acumulacin de etileno (hormona vegetal responsable de la senescencia y que produce un fenmeno en las plantas in vitro, llamada
vitrificacin, dando un aspecto de vidrio a las clulas vegetales) y la condensacin
de la humedad en el interior del envase (gotas de agua cerca de la tapa son buenos
vehculos para el ingreso de contaminantes).

Frascos de cultivos
denominados

Existen diversas clases de tapas, de algodn envuelto en gasa, de metal, de polipropileno, de espuma de poliuretano, film de polietileno, entre otras.

Magenta,SIGMA

Bolsas tipo Ziploc

En la opinin del autor las ms apropiadas son las de algodn/gasa, permiten un

muy buen intercambio de gases, son una buena barrera microbiolgica, son econmicas (salvo el hecho que hay que fabricarlas), pero tienen el inconveniente que
no son las ms adecuadas para la produccin en masa ya que se adaptan mejor en
tubos y no en frascos de boca ancha, de todas formas, para los frascos de produccin, es posible perforar el centro de las tapas de polipropileno o de metal y colocar
algodn en el centro de la misma a fin de permitir el intercambio de gases en este
tipo de envases.
Sector de multiplicacin

Tubo de
ensayo
con
tapn de
algodn.

Es el sector ms delicado del laboratorio, tiene, como mnimos requerimientos, que ser una habitacin sin corrientes de aire, con superficies fciles de limpiar y desinfectar, adems se debe contar con las herramientas de diseccin, un
microscopio estereoscpico y una cmara de flujo laminar, estos dos ltimos son
los elementos ms costosos del equipo, si bien con el microscopio se puede conseguir uno econmico en plaza (us$ 650), es de por si un artculo caro pero casi
imprescindible para ciertos trabajo de micropropagacin.

Diferentes tipos de tapas

para envases utilizados
en el CTV.

48

Cuartos y cmaras
de cultivo
Figura 3. Esquema y
medidas de una cmara
asptica casera. A) Con
la cortina plegada. 1) Acceso. 2) Cortina. B) Con
la cortina desplegada. 3)
Cortina. 4) Ojales para
introducir las manos del
operador.

La cmara de flujo laminar

puede improvisarse
utilizando una pecera de
vidrio volteada de lado, de
tamao adecuado, la medida del espesor mnimo
estar dada por el tamao
de la lupa binocular que
se disponga. La cara de
acceso puede cubrirse con
una cortina de plstico
transparente que pueda
plegarse y desplegarse de
acuerdo a las necesidades
(Figura 3).

Esta cmara representa

una muy interesante
alternativa que permitir,
sumada las condiciones
enunciadas previamente,
poder iniciar la actividad
de la micropropagacin sin
desembolsar los us$5.000
promedio, que cuesta una
cmara de flujo laminar
horizontal.

Cmara asptica
casera realizada en
plstico. Se utiliza en
reemplazo de la campana de flujo laminar.
Una vez limpia y desinfectada la superficie externa
e interna de la cmara con alcohol 70% o lavandina al
20% a lo que se le puede sumar el uso de una lmpara
UV porttil y la utilizacin de un mechero en el interior
para generar una zona de esterilidad, se considera que
la cmara es apta y adecuada para realizar la siembra o
multiplicacin de material bajo condiciones in vitro.

En general el cultivo in vitro se lleva a cabo en cuartos de cultivos que requieren disponer de una buena
iluminacin, fotoperiodo controlable y un buen sistema
de control de temperatura (Figura 5).
Si bien en pases en desarrollo la construccin del
cuarto de cultivo es relativamente econmica, se requiere de una habitacin bien aislada y de fcil limpieza,
estanteras con un sistema de iluminacin adecuado
cuyos costos dependern de la cantidad de estantes
y, por supuesto, tendr variaciones por pases, en Argentina, por ejemplo, el precio por una estantera de 2
m de altura y 0,90 de ancho por 0,43 de profundidad
con 5 estantes us$ 55,00 + us$15 por dos lmparas
bajo consumo + us$ 20,00 por un temporizador y
us$ 5 de cables.
El principal problema del cuarto de cultivo radica en los costos de la energa que se consume para
la iluminacin y la aclimatacin, que pueden alcanzar
hasta 60% y 25%, respectivamente, de los costos de
produccin (Dooley, 1991, citado por Ges Junghams
et al, 2009).
La Figura 4 muestra una estantera de un cuarto
de cultivo tpico, ntese que los tubos de luz fluorescentes han sido reemplazados por lmparas de bajo
consumo con las que se logra un importante ahorro
de mantenimiento tanto en dinero (se prescinde de los
arrancadores y balastos y su correspondiente cableado) como en trabajo.

49

De todas formas es importante dejar en claro que la iluminacin artificial es un mtodo poco eficiente (para la planta) y muy
costoso (para el productor).

Los colegas cubanos han diseado y montado biofbricas

para la multiplicacin de plantas que basan su funcionamiento
en los bajos costos de produccin debido a la implementacin

Se han desarrollado diseos de cuartos de cultivo que permiten el aprovechamiento de la luz natural lo que implica un importante ahorro de energa y una considerable merma en los costos
de produccin (Prez Ponce et al. 2000).

y utilizacin de cuartos de cultivo iluminados por luz natural,

En efecto, debido a que proveen poca energa en el color rojo

del espectro la luz de las lmparas fluorescente son poco eficientes
para activar el sistema fotosinttico, as como tampoco al fitocromo, lo que trae como consecuencia una pobre fotomorfognesis;
a esto se suma que la luz artificial genera calor que es necesario
contrarrestar

cin menores,

que de acuerdo a su propuesta presenta las siguientes ventajas:

1) No requiere instalaciones complejas y costos de construc2) no hay costos para iluminar los cultivos,
3) Bajo mantenimiento, y
4) debido a su menor grado de estrs, el cultivo supera mejor
la fase de aclimatacin (Prez Ponce et al. 2000).

La iluminacin natural se logra a partir de luz zenital, sea por una

o varias claraboya/s, de buenas dimensiones, en el techo del cuarto;
tambin, es posible recurrir a sistemas pre armados capaces de direccionar la luz exterior al interior del cuarto, existen varias alternativas
en el mercado, como ser: http://www.solatube.com/ o http://naturallight.com.mx/, entre otras (Figura 5).

Figura 4. Cuarto de cultivo clsico. Construido con carpintera

metlica estndar pintada de blanco con pintura antixido. Cuenta
con 2 o 4 lmparas larga vida segn estante en particular, este posee una irradiancia de 3500 lux en la zona del explanto.
Con una mayor potencia de los acondicionadores de aire, lo que
trae como consecuencia un mayor gasto de energa restndole eficiencia al sistema de produccin.

Al sistema de luz zenital se puede agregar una amplia superficie

vidriada en los laterales que den al exterior, a fin de lograr un mayor
aprovechamiento de la luz del da. Como todo, este sistema tiene sus
aspectos negativos y es que si bien se gana en calidad lumnica, se
hace ms difcil el control de temperatura, dado que el vidrio no es
un buen aislante, a no ser que se coloque doble cristal con aislamiento, pero eso encarece los costos de instalacin. Tambin es posible
colocar placas de vidrio en el techo de la cmara, siempre teniendo
en cuenta la consideracin hecha previamente respecto del control
de temperatura.

50

Control de temperatura
C

Figura 5.Tubos para luz zenital A) Modelo para techo a dos aguas.
B) Para techo plano. C) Esquema de del funcionamiento del difusor
de luz desde el exterior hacia el interior del ambiente.

Es un hecho generalizado la utilizacin de acondicionadores de

aire para el control de temperatura de los explantos cultivados in vitro,
a pesar de esto, hay opiniones que cuestionan esta costumbre argumentando que esto lo nico que genera es incremento en los costos
y no contribuye en nada a la calidad de los cultivos.
De hecho, el control de temperatura se efecta, ms que nada,
para contrarrestar el calor generado por el sistema de iluminacin artificial. Sera importante probar el cultivo de inters bajo condiciones
de iluminacin con luz natural y sin control de temperatura.
Las alternativas propuestas en este captulo pretenden mostrar
que es posible la incorporacin de tecnologa accesible, en cuanto a
costos, e los procesos de produccin de plantines, lo que contribuir largamente en el incremento de la calidad del producto ofrecido
y en la productividad del emprendimiento.

Captulo 4

Cultivo de Tejidos vegetales

Medios de cultivo para plantas

Alicia Rangel Cano

53

Introduccin
Como se vio en el capitulo anterior, los cultivos
de tejidos vegetales llamados tambin cultivos in vitro involucran el manejo en condiciones controladas
de clulas, tejidos, rganos y plantas completas para
poder obtener, clulas, tejidos, rganos y/o plantas
completas en condiciones aspticas.
Para llevar a cabo esto debemos de cuidar tanto
condiciones fsicas (la temperatura, la humedad la luz,
etc.) como qumicas (nutrientes, azucares y vitaminas
y/o aditivos).
Los cultivos in vitro se hacen en frascos cerrados y
en condiciones controladas y estriles que contienen
el sustrato o medio de cultivo, que contiene todo lo
necesario, donde la plantas deber crecer sana.
Los medios de cultivo, han sido utilizados en diferentes organismos, y pueden estar formulados con
materiales netamente naturales o con componentes
completamente artificiales.

Son esencialmente una mezcla de nutrientes en

los que se encuentran macro (nitrgeno, fosforo, potasio, etc.) y micronutrientes (magnesio, manganeso,
zinc, etc.) y carbohidratos como el azcar o la glucosa,
tambin se pueden agregar vitaminas y algunos otros
aditivos, que en el caso de las plantas pueden ser reguladores de crecimiento y/o extractos de frutos conocidos. Adems del elemento que le de consistencia al
medio que puede ser agar, algodn, vermiculita, entre
otros. La adicin de extracto de levadura es beneficiosa ya que le proporciona al medio de vitaminas, algo
de nitrgeno en forma de aminocidos, oligoelementos y cofactores.

Antecedentes
Los medios de cultivo destinados a las plantas
han sido elaborados por mltiples investigadores con
recetas muy variadas. Podemos decir que a inicios del
siglo pasado fue cuando los intereses hacia los organismos en general se potenci gracias a entre otras
cosas a los diferentes avances en las ciencias.

El objetivo final siempre

ser, obtener una mezcla
adecuada para el crecimiento y proliferacin
de un organismo determinado (bacteria, hongo,
plantas o clulas animales).

54

Schleiden y Schwan (1887) en su teora celular, mencionaron

que la clula es capaz de subsistir por si sola siempre y cuando las
condiciones externas le sean favorables, fijando las bases para lo
que posteriormente se atribuye a Morgan (1901) el trmino de
la totipotencialidad celular propiamente dicho, donde menciona
que cada clula contiene la informacin necesaria para poder desarrollarse hasta formar un organismo completo si las condiciones
ambientales le son favorables y si se le aplican los estmulos adecuados. Ver capitulo 2
Pero no fue hasta 1934 cuando Gautheret logra la proliferacin celular in vitro de tejidos provenientes de plantas adultas. En
1939 tanto Gautheret y Nobecourt en Francia usando tejidos de
zanahoria y White en estados unidos con tejidos de tabaco, publican casi simultneamente la formacin de una masa de clulas
parenquimatosas llamado callo a partir de los explantes (trozos
de planta) utilizados en sus experimentos usando un medio semislido. Este hecho significativo constituye en s el despegue de las
tcnicas de cultivo in vitro.
Aunque al inicio los avances en el rea fueron muy lentos, fue
White en 1934, el primero en cultivar tejidos vegetales con xito,
logr cultivar pices de races de tomate en medios enriquecidos
con sales, azcares y levadura. Demostr adems, que las levadura
se pueden sustituir por tres vitaminas del grupo B:Tiamina, Piridoxina y Niacina y que son necesarias en el desarrollo de las plantas.
Un factor importante en el desarrollo de las tcnicas de cultivo
de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de
crecimiento, compuestos internos que ayudan al desarrollo y organizacin de las clulas en tejidos, para formar plantas completas.
A un inicio se les llamo hormonas vegetales, ya que se comportan
como las hormonas animales, en el sentido de que se producen en
un sitio y actan en otro.

Overbeek en 1941, observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco, que estimulaba la divisin celular (efecto
citocnico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2, 4, D (un
herbicida con efecto de regulador de crecimiento) tena un efecto
positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y
Steward 1948, 1952).
Skoog y col. observaron que el esperma de arenque desnaturalizado por medio de calor, tena un efecto muy marcado en la
formacin de brotes a partir de tejidos de tabaco. De este cido
desoxirribonucleico (ADN) desnaturalizado Miller y colaboradores
en 1955 aislaron un compuesto de naturaleza purnica denominado, 6 furfuril-amino-purina o cinetina.
Steward en1952, utiliz agua de coco como medio enriquecedor (endospermo lquido). Este se ha usado dentro de diferentes
formulaciones de medios de cultivo con buen xito.

Cmo hacer un medio de cultivo casero?

Materiales que se necesitan:
Olla de presin comn de casa, entre ms grande mejor.
Estufa, cocina y/o microondas.
Balanza
Pinzas de metal de punta delgada
Bistur y tijeras pequeas de punta afilada
Frascos de vidrio de diferentes tamaos hasta un litro para esterilizar los medios, botes desechables de plstico nuevos con tapa en
su bolsa (de esos donde se venden postres)
Hojas de papel aluminio
Bandas elasticas medianas
Plstico adherible del que se usa para cubrir alimentos (un rollo)

55

Mechero
Frasco con etanol; absoluto para
flamear las pinzas y al 70% para limpiar el rea de trabajo.
Toallas de papel
Olla a presin para esterilizar
los medios de cultivo

Material para los medios de cultivo

Agar o vermiculita
Agua destilada
Abono mineral comercial 20 20 20 (sin urea) 1 gr/L
Azcar comercial 20 gr/L (se consigue en cualquier tienda)
Extracto de levadura 1 gr/L
Una ampolla de complejo de vit B.
Uno de los siguientes aditivos
por litro medio de cultivo
Agua de coco proveniente de un coco tierno 200 o,
Jugo de pia natural pasado por un filtro de papel, del que se usa
para preparar caf (25 mL/L) solo si se cuenta con material para
controlar el pH, potencimetro o tiras de pH, y reactivos (hidrxido de sodio y cido clorhdrico) ya que este es muy cido (el pH
deber estar entre 5.5 y 6) o,
Pltano entre verde y amarillo (medio pltano mediano por litro
de medio) pelado y en trozos pequeos, o
Papa 200 g/L (pelada y en trozos pequeos)

Nota importante.
El agua de coco ha sido ms usada para la germinacin o
cultivo de tejidos.
El pltano es mejor para el desarrollo de plntulas. No
debern usarse juntos.
El agua destilada es importante aunque puede usarse una
comercial baja en sales o bien agua de lluvia colectada en
recipientes limpios y sin basura.
Si se usa vermiculita no se le agrega agar y se usa sin
calentar, nicamente se disuelven los componentes y se le
agregan los aditivos y se reparte en los frascos para su esterilizacin.
La papa se usa para el cultivo de algunas bacterias y hongos, como Agrobacterium.
El abono mineral puede conseguirse en cualquier comercio de agroqumicos y si contiene magnesio, hierro y otros
elementos mejor.
El agar, la vitamina B y el extracto de lavadura se consiguen
en tiendas para deportistas y nutricin.

Preparacin
La forma de preparar los medios de cultivo es simplemente
mezclar todo en una parte de agua, disolver y mezclar los componentes, ajustar al volumen final y agregar el agar, para luego calentar,
esto puede hacerse en el horno de microondas, dndole pulsos
de 1 minuto y agitando en cada intervalo o bien en una estufa
o plancha caliente. Se debe hacer con agitacin constante as se
incorporarn de forma homognea adems que se evitar que se
peguen y/o se caramelicen los componentes del medio.
Si se cuenta con bolsas de plstico y/o botes de plstico nuevos
se pueden considerar como estriles (siempre y cuando sus empa-

56

ques no hayan sido violados) y usarse de inmediato,

por lo que el procedimiento cambia de la siguiente
manera.
Una vez hecha la mezcla de los componentes se
pone en frascos de vidrio de un litro, se tapan con
su tapa (sin apretarla) o con papel aluminio y se esteriliza.
NOTA

tenga el etanol alejado del fuego), ayudado de una

tolla de papel eliminar el exceso de etanol y suciedad
y deje que el resto del etanol se evapore completamente. Posteriormente, coloque el material estril
(frascos, bolsas o empaques) y el medio de cultivo,
cuando ste se enfre pero antes de gelificarse, se
vierte en los recipientes (cuando usted pueda mantener su mano en el frasco por 30 segundos tendr
una temperatura entre 45 y 50C).

Una vez incorporados

todos los componentes se
reparte en frascos (entre

Nota importante:

20 y 40 mL c/u) se tapan
ya con hojas de papel
aluminio y se acomodan
en la olla de presin. Se
esterilizan durante 20 mi-

Frascos con medio

de cultivo

nutos, se espera a que baje

la temperatura, se abre la
olla, se sacan con cuidado
de no quemarse y de que
no se derramen y se dejan
enfriar.

Una vez transcurrido el tiempo de esterilizacin

y enfriamiento de la olla se saca y se lleva a la zona
de trabajo, si hay campana de flujo en ese lugar y si
no en una mesa perfectamente limpia con dos mecheros y con mucho cuidado se vierte el medio en
los recipientes.

Detalles prcticos
Antes de iniciar cualquier trabajo, lavarse perfectamente con jabn manos, uas y antebrazos y secarlos con toallas de papel, limpiar la zona de trabajo
completa con una solucin de etanol al 70% (man-

Un mechero da un dimetro de aproximadamente 50 cm de proteccin estril, de

tal manera que usando 2 en cada lado y el
material estril en medio podemos trabajar
con seguridad, si adems limpiamos perfectamente manos y espacio.
Podemos tambin hacer una especie de
campana, delimitando los lados y la parte superior con acrlico, para proteger an ms,
evitando as contaminacin por corrientes
de aire.

Captulo 5

MICROPROPAGACIN

Rosa Mara Oviedo

de Cristaldo

59

Introduccin
La propagacin de plantas utilizando partes de
ella es una prctica antigua y tradicional entre los
agricultores, sobre todo entre los que se dedican a la
produccin de plantas frutales, ornamentales, algunas
hortalizas y especies forestales. Se utilizan partes de
la planta o propgulos, con el objetivo de obtener
nuevas plantas idnticas a la planta madre de la cual
fueron extrados. Las plantas resultantes son clones,
de manera que son todas iguales, con el mismo ciclo
de produccin, manejo agronmico, caractersticas
sanitarias y rendimiento.
Qu es la clonacin?
Para entenderlo puede ser til
pensar en el proceso de fotocopiado... este consiste en obtener
copias de un mismo original
En las plantas, el proceso de
fotocopiado lleva el nombre
de propagacin vegetativa. Esta
propagacin puede ser macro o micropropagacin...

La macropropagacion utiliza propagulos de

mayor tamao y se realiza in vivo ( esquejes, estacas, estolones, bulbos, tubrculos o rizomas)
La micropropagacin es una tcnica de propagacin de plantas a gran escala, utilizando plantas
seleccionadas y tcnicas de cultivo de tejidos. Con
ella se consigue la obtencin de un gran nmero
de individuos con caractersticas deseables de alto
valor agronmico, ornamental y forestal.
Consiste en colocar el propgulo, en este
caso llamado explanto, segmento ms pequeo
que los usados en la propagacin convencional,
en medios nutritivos ar tificiales y en condiciones
controladas de ambiente. De este modo, en lugar
de esquejes, estacas, estolones, bulbos, tubrculos
o rizomas se utilizan pequeos segmentos de algn tejido de la planta, asociadas a tcnicas que
son propias de los laboratorios en lugar de las
agronmicas tradicionales.

Clon: Palabra griega

que significa retoo,
rama o brote.
En el lenguaje cientfico
significa estirpe celular
o serie de individuos
pluricelulares nacidos de
sta, absolutamente homogneos desde el punto
de vista de su estructura
gentica. (Diccionario de
la Real Academia Espaola,
XXI Ed., 1992).

60

Finalmente se obtiene el mismo resultado: regenerar una planta completa a partir de sus partes.

Explante Porcin de tejido

u rgano que se separa
de la planta para iniciar el
cultivo.

Micropropagacion
Mtodo especial de
propagacin en un medio
asptico para obtener
plantas con caractersticas
genticas iguales a la de
sus progenitores.

Esquema de Macro y micropropagacion

61

Es frecuente observar que los vecinos se intercambian ramas de las plantas de sus jardines que cuando colocadas en recipientes con agua, al poco tiempo emiten
races, hojas nuevas y estn listas para ser plantadas.
Los que trabajan con plantas ornamentales y frutales en general saben que, dependiendo de la especie,
existen partes de la misma a partir de la cual se pueden obtener nuevas plantas o mudas.

Adems de las yemas, tambin pueden utilizarse

en la micropropagacin segmentos de hojas, entrenudos, nudos, embriones, cotiledones, anteras y granos
de polen, entre otros. En estos casos deben pasar por
una etapa de callo, que consiste en una masa de tejido
indiferenciada semejante al meristema, a partir de la
cual se puede regenerar la planta completa.

Esta propiedad de las clulas vegetales se

llama totipotencia, o capacidad de originar una
planta completa. Las yemas son las estructuras
vegetales que conservan esta capacidad inclusive en plantas adultas y es por ese motivo que,
cuando se multiplica una planta en forma vegetativa, siempre se considera un segmento de tallo o rama que las contenga.

Las yemas pueden encontrarse en las axilas de

las hojas y en la parte terminal de las ramas, las primeras se denominan yemas axilares y las segundas
yemas apicales. Tejido similar al de las yemas, llamado
meristema, tambin se encuentra en las puntas de las
races lo que les permite seguir creciendo en busca
de agua y nutrientes.
La propagacin usando tejidos merstemticos no
presenta en general dificultades, debido a que an no
se han diferenciado o especializado en tejidos con
funciones determinadas como las correspondientes
al tallo, hojas o flores. Sin embargo, cuando se usan
tejidos ya diferenciados, es necesario recuperar la totipotencia de las clulas mediante tcnicas y estmulos
adecuados.

Fuente: Agrobiotecnologa, UBA

La micropropagacin es un sistema de multiplicacin en un medio artificial y asptico y a partir de muy
pequeas porciones de plantas, tales como: semillas,
embriones, tallos, brotes de tallos y de races, clulas
y polen.
Cualquiera de las partes antes mencionadas deben producir una planta entera
Tamao del explante Posibilidad de contaminacin
Paralelamente se trabaj con diferentes tamaos de
explantes, encontrndose que la contaminaci6n aumentaba a medida que el tamao del explante era
mayor, resultando ms apropiados los explantes de ta-

62

mao entre 0,5 y 1,0 milmetros (caa de azucar)Capacidad de regeneracinExiste un tamao mnimo de
explante que depende de la especie, y del material
vegetalNecesidad de medios complejos o acondicionados si son muy pequeos
La micropropagacin no puede ser utilizada en
todos los cultivos. En las plantas que habitualmente se multiplican en forma vegetativa, las tcnicas de
micropropagacin son ms fcilmente aplicadas. Es
el caso de la caa de azcar, la mandioca, la papa,
banano, ornamentales como orqudeas, petunias,
claveles, crisantemos, helechos, frutales y algunas especies forestales. En cambio, en los cereales como
el trigo, especies anuales como la soja y en general
las que se reproducen estrictamente por semillas es
ms difcil de aplicar tcnicas de micropropagacin.
Adems de la especie, la facilidad de regeneracin
tambin est condicionada a la edad de la planta de
la cual se extrae el explante y a la poca del ao en la
cual se realiza la extraccin. Plantas jvenes proporcionan mejores explantes y las colectas realizadas en
primavera o verano tiene mejores resultados que las
realizadas en el invierno.

Descripcin de la tcnica
En general la micropropagacin se describe en
cuatro etapas principales: establecimiento del cultivo,
desarrollo y multiplicacin de los propgulos, el enraizamiento y por ltimo, la aclimatacin de las nuevas plntulas. Previa a stas etapas, existe una muy
importante que se relaciona con la planta madre de
donde sern extrados los explantos y adecuacin
del explanto extrado.

Planta madre
La planta o plantas madres deben sanas, vigorosas y en fase activa de crecimiento. En el caso de
especies leosas que han pasado de su fase juvenil
a adulto, las podas son un mecanismo para obtener
brotacin y tejidos jvenes nuevamen
Preparacin de la planta madre Recomendable que crezca en invernadero o cmara de
crecimiento En maceta con sustrato estril Usar
material homogneo Elegir plantas vigorosas
Promover nuevas brotaciones: podas Programa
sanitario Controles y manipulacin de intensidad
de luz, fotoperodo y temperatura Aplicacin de
fitoreguladoresPrevenir insectos de cualquier tipoPrevenir hongos y bacterias Regar slo en la
maceta (evitar riegos por encima)Mantener baja
la humedad

Seleccin y colecta de explantos

En la seleccin de los explantos deben ser considerados el tipo de tejido colectado, la edad de la
planta, la estacin del ao y la sanidad de la planta
madre. Cualquier tejido podra ser usado como explanto, pero en la prctica los que contengan mayor
proporcin de tejidos jvenes son los ms adecuados.
Las partes jvenes, rejuvenecidas o en crecimiento de
la planta son las que proporcionan mejores explantos. En algunos cultivos las yemas apicales son mejores que las axilares, como en las rosas, mientras que,

Eleccin de la planta madre. Especie Edad Estado

fisiolgico Lugar en que
crece Habito (herbaceo,
leoso)

63

para las especies arbreas frecuentemente son mejores las axilares. Se recomienda colectarlos en la primavera o verano cuando
las plantas estn en activo crecimiento. Cualquiera sea el explanto
seleccionado, cuando se colectan de plantas sanas tendrn menos
problemas de contaminacin durante el establecimiento del cultivo
de tejidos. Una vez colectados los explantos deben ser colocados
en recipientes o bolsas de plstico para evitar la desecacin.
Recoleccin del los explantesUna vez escogida la planta madre, se extraern los fragmentos a partir de los cuales se obtendrn los explantos.Antes de extraer los explantes se har una
desinfeccin de los fragmentos de planta madre para eliminar los
contaminantes externos. Soluciones desinfectantes
1.- Alcohol etanol: 70% para material vegetal y al 96% para instrumentos 2.- Hipoclorito de sodio (NaClO) al 1 2 % y con
tiempos variables (10-20 min.) dependiendo del material
3.- Hipoclorito de calcio Ca (ClO2) 35-100g/l en tiempos variables (5-30 min) segn material
4.- Bicloruro de Mercurio (HgCl2) 0.01-0.05% ya no se utiliza por
su toxicidad.

Las plantas que crecen en el medio natural estn contaminadas

por microorganismos (bacterias y hongos).
Los explantes antes de ser introducidos en el medio de cultivo
han de ser esterilizados.
Posteriormente se introducirn en el medio a su vez estril y se
mantendrn all en condiciones aspticas.
Los explantos se pueden lavar con agua corriente, luego se
los coloca en una solucin con etanol al 70% durante 1 minuto, seguido de soluciones con concentraciones de 0,5 a 2,5
% de hipoclorito de sodio, frecuentemente encontrado en las
formulaciones de agua sanitaria a la cual se agregan unas gotas
de detergente lquido. Despus de la desinfeccin deben ser enjuagados con agua destilada y esterilizada, tantas veces como sea
necesario, a fin de remover los restos de del material usado para
la desinfeccin.
El proceso de esterilizacin de los explantes puede resumirse
en los siguientes pasos:
1. Lavado del material con agua corriente, para retirar restos de
tierra u otras partculas (opcional).
2. Eliminacin de las partes muertas e infectadas de la planta.

Establecimiento del cultivo

3. Introduccin de la porcin de planta en alcohol diluido al 70%

durante unos segundos.

Los explantos colectados deben pasar por procesos de desinfeccin superficial para evitar la contaminacin durante la fase de
cultivo. El rea de trabajo de debe estar desinfectada con alcohol
y los instrumento utilizados, como pinzas y frascos esterilizados.

4. Sumergir la planta en una solucin de hipoclorito de sodio (por

ejemplo al 1%) con un agente humectante (por ejemplo Tween
20 o Tween 80), durante 10-30 minutos.

El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extrados de

la planta madre.
Estos pequeos rganos o trozos de tejido se llaman explantes.

1. La fuente ms utilizada de hipoclorito de sodio es la lavandina comercial. sta contiene un 5% de hipoclorito de sodio
como agente activo, con lo que la solucin estar formada por

64

un 10-20% (v/v) de lavandina.

2. Para una mayor eficacia se recomienda agitar la
solucin mientras dura el proceso.
5. Enjuague del material con agua estril para eliminar la solucin de hipoclorito de sodio. El enjuague
debe tener lugar bajo condiciones de asepsia, y suele
realizarse en tres veces sucesivas de unos 2 minutos
cada una.

Otros ejemplos
Esterilizacin de yemas laterales
Hipoclorito de calcio. Se utiliz a las concentraciones de 60, 90 y 120 g/L, durante tiempos de aplicacin entre 30 y 1200 min. El material vegetal (yemas
midiendo 15 x 3,5 mm) fue colocado en un recipiente conteniendo la solucin de hipoclorito de calcio a
la concentracin conveniente durante un tiempo definido, aadiendo dos gotas del surfactante Tween 80.
La desinfeccin fue seguida por tres enjuagues con
agua destilada estril y en condiciones de asepsia.
Agua oxigenada. Las yemas se colocaron en un
recipiente conteniendo una solucin de agua oxigenada (10 volmenes) durante 60, 120 y 360 min.
Mezcla antibitico-antinfngico. Esta mezcla fue
preparada con la siguiente composicin: Penicilina
600 mg/L + Estreptomicina 100 mg/L + FungizonesAnfotericina-B (43%) + Oxiclorato de Sodio (35,3%)
+ Fosfato de Sodio (21,7%) con NaCl excipiente 850

mg/L a pH 6. El medio de cultivo utilizado se dej

enfriar a una temperatura de ca 37C. De inmediato,
la mezcla antibitico-antifungico fue aadida en forma asptica al medio con ayuda de una inyectadora
estril
Para la preparacin de los tallos se debe trabajar
bajo condiciones estriles, lavar bien las manos, y limpiar el lugar de trabajo con etanol al 70%.
Los tallos se desinfectan bien sumindolos durante un par de horas en el fungicida comn preparado
posteriormente se lavan bien con agua corriente.
Luego se sumergen los tallos en etanol al 10%
(10 ml alcohol + 90 ml agua) durante cinco minutos
agitando constantemente.
Se enjuaga con agua destilada 3 veces por 3 minutos cada lavado. Inmediatamente se sumergen los
tallos en cloro comercial al 15% (preparar) y se agita
cuidadosamente por 10 minutos.

Los tiempos y las concentraciones dependern del

material a desinfectar.

Se enjuaga con agua destilada estril durante cinco minutos tres veces.
Ejemplos
Hojas de Anthurium andreanum: 30 min. 1% de NaClO
Escamas de Hyacinthus: 15 min. 1% NaClO
Tallos de Rhododendron: 20 min. 1% NaClO
Hojas de Strelitzia: 45 min. 1% NaClO
Consideraciones para establecer

Fuentes de contaminantes
1. Microorganismos
presentes en el interior o
exterior de los explantes
Bacterias y hongos.
2. Fallas en los procedimientos de cultivo en el
laboratorio

65

un cultivo libre de contaminantes visibles

Conocer el material vegetal y sus posibles
contaminantes especficosAcondicionar la
planta dadora de explantes
Desinfectar el explante
Emplear medios e instrumentos de cultivo
esterilizados
Cultivar los explantes en una cmara de
transferencia con aire estril
Mantener los ambientes limpios
Incubar los cultivos en cuartos cerrados, libres de corrientes
Atender las manipulaciones del operador

se lleva a cabo con presiones de 1.0 a 1.2 Kg/cm2 a

temperatura de 120 C y durante 20 a 40 minutos.
Algunos medios pueden incluir sustancias inestables
a altas temperaturas (antibiticos, giberelinas, algunas
vitaminas, zeatina, etc.), que por tal razn no deben
ser sometidas al proceso de autoclavado.
En este caso se aconseja la esterilizacin del medio
en autoclave y los productos termolbiles deben ser
esterilizados por medio de filtracin.

Algunas soluciones

Esterilizacin: procedimiento para la eliminacin

de microorganismos.
Autoclave: aparato en el
que el medio, material d
vidrio, instrumental, etc.,
es esterilizado por vapor
bajo presin (121oC, 15
psi, 10-20 min.).

Lavado del material

Secado en estufa
Uso de UV
Etanol y desinfectantes
Evitar las corrientes de aire y la circulacin de personas
Los instrumentos de trabajo deben ser esterilizados
Uso de mechero
Desinfeccin de superficie del explanto
Cabina de flujo laminar: rea de trabajo, mantenida
estril por el flujo continuo, no turbulento de aire
estril.
La esterilizacin de medios, de herramientas (bistur, pinzas, agujas de diseccin, etc.) como de vidriera y
agua, se realiza en autoclave y en trminos generales

Una vez terminada la desinfeccin se los coloca

en recipientes que contienen los medios de cultivo.
Los recipientes pueden ser, placas de petri, tubos de
ensayos o simplemente frascos del tamao adecuado. Cualquiera sea el recipiente, debe estar esterilizado para evitar contaminacin. Los medios de cultivos utilizados contienen sales minerales, vitaminas,
azcares y hormonas reguladoras del crecimiento de

66

las plantas. El medio ms frecuentemente usado es el MS con diferentes diluciones y modificaciones adaptadas a gran cantidad de
especies. Ver capitulo de Medios de Cultivo

para la mayora de las especies. Algunas especies requieren de un

periodo inicial en oscuridad, pero en gran parte de ellas se utiliza
luz que puede ser blanca fra del tipo proporcionado por lmparas
fluorescentes. En esta etapa se inicia la multiplicacin acelerada y
los nuevos brotes pueden consumir por completo los nutrientes y
el agua del medio de cultivo. Si ello ocurre, es necesario cambiarlos
a nuevos medios de cultivo antes de iniciar la fase de enraizamiento.
Es aqu cuando los cuidados en la manipulacin son importantes
para evitar contaminacin de los nuevos brotes.

Cuarto de crecimiento
Multiplicacin
El objetivo de esta etapa es aumentar la cantidad de brotes
para los sucesivos ciclos de multiplicacin, de manera a producir el
mayor nmero de plantas posibles en el menor espacio y tiempo.
El medio de cultivo, las hormonas y reguladores de crecimiento, las
condiciones del ambiente y los cuidados en la manipulacin son
importantes para el logro de la multiplicacin de los clones a gran
escala. En general temperaturas entre 20 y 27C son adecuadas

Deben ser mantenidos en las

mayores condiciones aspticas
posibles.
Uso de pinturas resistentes al
lavado
Las mesas y estanteras de los
cuartos de cultivo deben ser lisas, lo cual permite una mayor
asepsia de las reas.
Peridicamente deben reali-

67

zarse inspecciones en los cuartos de crecimiento y retirar los distintos materiales contaminados.
La limpieza de los cuartos debe ser frecuente y preferiblemente deben utilizarse en estas limpiezas soluciones de hipoclorito, alcoholes u otros desinfectantes
superficiales.
Enraizamiento y aclimatacin
En esta etapa se forman las races adventicias, similares a la que se producen cuando se coloca una rama
en un frasco con agua. Los brotes que se multiplicaron
en la etapa anterior emiten races que van a permitir el
transplante de las nuevas plantas en condiciones fuera del
laboratorio, en macetas para finalmente ser trasladarlas
a su lugar definitivo. El enraizamiento puede realizarse
utilizando medios de cultivo o soluciones con concentraciones de hormonas que favorecen el enraizamiento.
Una vez conseguida la formacin de las races, las
nuevas plantas estn podrn sobrevivir en condiciones
normales de cultivo. Sin embargo, el proceso debe ser
gradual debido a la gran perdida de agua que sufren en
las etapas iniciales del transplante reduciendo de manera considerable la tasa de supervivencia. Es por ese
motivo que no pueden ser expuestas directamente a las
condiciones de ambiente natural, sino que deben pasar
por etapas intermedias, como invernaderos o reas con
cobertura de media sombra hasta que las plantas estn
suficientemente fortalecidas para tolerar las condiciones ambientales. Por el mismo motivo, los sustratos utilizados para las macetas que pueden contener mezclas
de arena y abonos, deben estar esterilizados.
Esquema de las etapas de una micropropagacin

Mtodos alternativos
de enraizamiento
Fuente; Rudoy V.
Micropropagacion
comercial,
Agrobiotecnologia,
UBA

Fuente: http://
www.etsea2.
udl.es

68

Posibles respuestas

Fuente. Agrobiotecnologa, UBATipos de micropropagacin

Propagacin vegetativa
a partir de yemas preexistentes
Proliferacin de yemas apicales o axilares
- Consiste en la multiplicacin de plantas a partir de las yemas
axilares preexistentes.
- Representa la aceleracin in vitro del crecimiento natural de
dichas yemas.
- La tasa de multiplicacin (t.m.) se calcula con base en el nmero de brotes o vstagos obtenidos a partir de un explante
inicial, entre una resiembra y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en
cuestin, entre otras variables.
- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podran
obtenerse10.000.000 plantas en un solo ao, a partir de una
nica yema inicial.
- El cultivo de meristemos es un caso especial del uso de esta
tcnica. (ver capitulo 5)

69

70

Usos y ventajas de la micropropagacin

La micro-propagacin
requiere una
infraestructura
mnima especializada y
condiciones controladas
de cultivo (ver capitulo 3)

Durante los procesos de propagacin

de plantas resulta frecuente la contaminacin de las nuevas plantas con enfermedades que normalmente se transmiten por las
partes de la planta utilizadas para la multiplicacin o bien por los instrumentos, como
tijeras de podar, cuchillos, machetes usados
en las tareas. Uno de los beneficios de la
micropropagacin est relacionado con la
obtencin de mudas sanas, libres de patgenos que garantizan la implantacin de un
cultivo. Se han conseguido con xito plantas
libres de virus en cultivos de frutilla y papa
entre otros, utilizando el cultivo de yemas
apicales.La limpieza de clones utilizando
micro injertos es frecuente en cultivos de
manzano, durazno, ctricos y uvas.
El impacto ms importante de la micropropagacin est en la produccin comercial de plantas que ha posibilitado a los
viverista la multiplicacin a gran escala de
mudas de calidad. Actualmente pueden ser
usadas tcnicas de micropropagacin en
gran cantidad de especies ornamentales,
frutales y plantas leosas. Son significativos
los avances con especies forestales que
incluyen a ms de 80 especies entre los
cuales se encuentran eucaliptos, araucaria,
pinos, lamo y acacias.
Las mudas producidas por micropropagacin normalmente son ms caras que

71

las obtenidas por mtodos tradicionales porque tienen un valor

adicional relacionado con la seleccin cuidadosa de las plantas madres o clones de los que provienen que se traducen en materiales
homogneos y de buena sanidad.

Estudio de caso
MICROPORPAGACIN DE ORQUDEAS
Introduccin

A partir de hojas

Laboratorio
Area de preparacin de medios
Area de lavado y esterilizacin
Cuarto de cultivo
Area de rusticacin
Material Vegetal
Plantas madres seleccionadas
(preacondicionamiento)
Explantos (eleccin, diseccin, esterilizacin, etc)
Condiciones de cultivo
Aspsia
Recipientes
Temeperatura
Luz y fotoperodo

Las orqudeas son plantas ornamentales de gran valor comercial, sean stas como plantas completas o bien como flores de
corte. Existen varios mtodos de propagacin que incluyen el uso
brotes o semillas. El uso de brotes es tradicional y se obtienen
plantas idnticas a la planta madre o clones. Como las orqudeas
producen semillas es posible hacer hibridaciones combinando caractersticas, de manera que se pueden obtener nuevos colores o
tamaos de flores. Una vez conseguido el hbrido se vuelve a multiplicar utilizando los vstagos. La micropropagacin permite obtener
gran cantidad de clones, agregando a ello una mayor sanidad de las
mudas producidas, que representa una gran ventaja para disminuir
la contaminacin con virus, frecuentemente observada en los viveros, que se traducen finalmente en disminucin de la productividad
y calidad de las orqudeas.
Instalaciones
Se debe acondicionar un espacio o habitacin para que cuente
con rea de preparacin de medios, rea para lavado y esterilizacin, una zona estril, un rea para el cultivo y otra para el proceso
de rusticacin. Para la esterilizacin del medio de cultivo y los materiales, en lugar de la autoclave, puede utilizarse una olla a presin
y en lugar de tubos de ensayo pueden usarse frascos de vidrio
reciclados de la casa y tapas de papel de aluminio que se encuentra
en los supermercados. Si no se cuenta con cmara de flujo laminar,
se puede destinar un espacio de alrededor 1 metro cuadrado, en
una superficie azulejada y aislarlo. Si la superficie azulejada es bien
desinfectada con alcohol puro y se utiliza un mechero de alcohol
para flamear todos los instrumentos, es posible disminuir la inciden-

72

cia de contaminantes. El rea de cultivo debe contar con estantes,

donde se colocarn los frascos, adems la temperatura, humedad
y luz deben ser controladas. La luz puede estar proporcionada por
tubos fluorescentes de 40 watts y se deben colocar tres en cada
uno de los estantes. Para controlar la cantidad de horas de luz requerida por la variedad se puede colocar un dispositivo automtico
para el encendido y apagado de las luces.
Materiales
Brotes de la planta de orqudea
Agua destilada esterilizada
Etanol al 70 %
Hipoclorito de sodio de 0,5 a 2,5 % que puede ser reemplazado
por blanqueador o Lavandina.
Una gotas de detergente par ayudar a la accin del Etanol y el
Hipoclorito
Frascos de vidrios lavados y esterilizados
Pinzas, bistur o cualquier otro instrumento que ayude a la remocin y manipulacin de las yemas
Algodn hidrfilo
Papel aluminio
Papel indicador de pH 0 a 14
Mechero o una fuente de gas para flamear los instrumentos
Medio de Cultivo
- Medio comercial Murashige y Skoog (MS)
- Azcar granulada (sacarosa) 30 gr por litro
- Pur de bananas 200 gr. Como fuente adicional de carbono
- Agar 8 gr

Procedimiento
Para preparar el medio de cultivo disuelva en agua destilada el
azcar, la sal del medio M & S. Antes de llevar a volumen final verificar el pH con una tirita del indicador a fin de que se encuentre
en 5,5.
Agregar el agar, hervir para disolver totalmente y distribuir en los
frascos. Tapar frascos con papel de aluminio. Coloque los frascos
cerrados en una olla a presin por 20 min desde el inicio del hervor. Cuando estn fros pueden guardarse en un refrigerador hasta
que sean utilizado.
Todos los materiales que sern utilizados deben ser esterilizados
por el mismo procedimiento durante 50 minutos para el agua y la
vidriera.
La desinfeccin del material vegetal se har primero con el alcohol al 70% por 30 segundos y un enjuague con agua estril y luego
por 5 minutos en el hipoclorito o lavandina.
Enjuague las yemas en agua destilada y esterilizada colocada en
tres recipientes, en forma sucesiva, para eliminar los restos de la
lavandina. Los explantes pueden dejarse en el recipiente final de
agua estril cubiertos con una tapa tambin estril hasta que se
necesiten.
Extraiga el tejido de una yema de la planta con ayuda de un bistur previamente flameado, sin calentar al rojo vivo y enfriado.
Tome uno de los frascos con el medio de cultivo, retire la tapa y
flamee ligeramente la boca del mismo.
Coloque rpidamente el segmento de tejido en el frasco con la
ayuda de una pinza, tambin flameada y enfriada.

73

Vuelva a colocar las pinzas en el recipiente con alcohol. Flamee

nuevamente la boca del recipiente y tpelo.
El procedimiento se repite con cada uno de los frascos, hasta
completar la cantidad prevista.
Los frascos se depositan en los estantes del rea destinada al
cultivo, con temperatura de 27 C y 16 horas de luz.
Cuando las plantas han desarrollado tres pares de hojas se pasa
a la fase de rusticacin, que debe ser un lugar acondicionado para
que las plantas comiencen a adaptarse al ambiente de manera gradual. Pequeos invernaderos, reas protegidas de las casas como
corredores o reas cubiertas con media sombra. Las macetas o
bandejas donde sern trasladadas la mudas pueden contener, sustratos como xaxim, musgo, tergopol y carbn vegetal
Normas de seguridad
Utilizar guardapolvo y guantes plsticos de los que se usan
para cirugas
Mantener el alcohol lejos de las llamas
Proteger los ojos, si fuera posible con anteojos de seguridad

Captulo 6

CULTIVO DE MERISTEMAS

Teresa Avila Alba

77

Introduccin
La principal causa de prdidas en la agricultura es la incidencia
de enfermedades ocasionadas por diferentes microorganismos patgenos entre los que se encuentran hongos, bacterias y virus.
Las enfermedades causadas por virus ocasionan una reduccin
de la produccin, adems que pueden ser transmitidas hacia plantas
sanas. Para la recuperacin del potencial productivo de estas plantas
y evitar la diseminacin de enfermedades a otras zonas libres de
stas, es primordial la utilizacin de tcnicas de cultivo in vitro como
el cultivo de meristemas, que permite la obtencin de plantas sanas
que pueden ser micropropagadas (multiplicadas in vitro) y as llegar al
agricultor con material promisorio a nivel sanidad y a nivel gentico.
Los mtodos de propagacin a travs de la biotecnologa vegetal, se caracterizan por obtener en corto tiempo grandes volmenes de plantas de alta calidad gentica y fitosanitaria, por tanto
resulta indispensable iniciar la propagacin con plantas libres de
microorganismos patgenos. Contar con un material de partida
ptimo es el resultado de la integracin de diferentes aspectos
como la seleccin adecuada en campo de las plantas donadoras, la
utilizacin de tcnicas de diagnostico confiables y mtodos eficientes de saneamiento que garanticen la eliminacin del patgeno.

Los progresos alcanzados en la aplicacin del cultivo de meristemas, han hecho posible propagar material libre de virus de un
gran nmero de especies de importancia econmica, con beneficios para el pequeo agricultor.

Cultivo de meristemas
El cultivo de meristemas es una tcnica que permite el saneamiento de plantas, especialmente de virus. Los meristemas son
aislados y sembrados en un medio de cultivo que posibilita el desarrollo de una planta completa, como puede observarse en el
esquema siguiente:

Tomado de Porqu Biotecnologa, Cuaderno N35

78

El meristema es un tipo de tejido vegetal en el que sus clulas

conservan la capacidad de dividirse, es un tejido formativo, lo encontramos en zonas de crecimiento tales como el pice de races y
tallos y est conformado por clulas que se dividen continuamente
para originar otros tejidos. En el siguiente grafico se observa la
estructura de un meristema.

su ubicacin y manipulacin adecuada, con el objetivo de facilitar

su extraccin. Existen meristemas muy fciles de localizar, como
son los expuestos, tal es el caso de la papa, en otros cultivos
pueden estar ms internamente protegidos y se necesita separar
mayor cantidad de pequeas hojas para encontrar la zona meristemtica, ese es el caso de los bulbos como el ajo y la cebolla
(Garca, 1999).
Sacar el meristema es un proceso delicado, requiere de muchas horas de prctica y debe realizarse con el apoyo de un microscopio estereoscopio, en una cmara de flujo laminar a fin de
asegurar un rea de manipulacin estril.
La tcnica de cultivo de meristemas tiene mejores resultados
cuando est asociada a termoterapia (tratamientos con altas
temperaturas), la cual consiste en exponer plantas a una temperatura de 37C durante 3-4 semanas antes de la escisin de las
puntas meristemticas. La termoterapia tiene el objetivo de reducir o inhibir la multiplicacin viral en los tejidos tratados y que los
brotes nuevos que se desarrollen durante la misma, tengan una
menor concentracin de virus que los tejidos iniciales. Es a partir
de estos brotes nuevos, que se realiza el cultivo de meristemas.

Estructura de un pice mostrando los primordios

foliares y el meristema
Se considera que los meristemas suelen tener pocos o ningn
virus, fundamentado en que la distribucin de los virus en los tejidos de una planta no es uniforme y que su concentracin tiende a
disminuir progresivamente hacia el meristema; por este motivo, el
cultivarlos aislados en un medio artificial permite que el tejido y las
plantas que se regeneren a partir del mismo, estn libres de virus.
El reconocimiento de la zona meristemtica vara entre especies, por lo tanto se requiere de estudios preliminares que revelen

Las plantas obtenidas mediante cultivo de meristemas deben

ser evaluadas para asegurar que no tienen virus, mediante tcnicas
que identifican la presencia del virus en la planta. Solamente las
plantas que pasan este diagnostico de manera favorable, pueden
considerarse limpias de virus y ser propagadas in vitro o en invernadero. Este diagnstico de enfermedades se realiza a travs de
pruebas serolgicas como Enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA), que detecta la presencia de un antgeno producido por
un organismo infectado por virus o tambin mediante la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR), que es una tcnica molecular
que detecta ADN viral.

79

La tcnica de ELISA detecta la reaccin del organismo infectado

con virus o el virus mismo y lo hace visible por medio de una enzima
que puede dar coloracin o fluorescencia en una placa plstica. El
procedimiento puede observarse en el siguiente grafico:

Preparacin
de muestras de plantas

Las muestras estn siendo

sembradas en una placa
de ELISA

La PCR es una tcnica que utiliza un equipo de laboratorio que se

llama termociclador, en el que cuando se analiza una planta que tiene virus, se multiplica un pedazo del virus, de tal manera que pueda hacerse
visible en una gelatina utilizada para este fin. En caso de que la planta no
tenga virus, nada se amplifica y nada se hace visible en el gel.

Las muestras estn siendo

colocadas en un termociclador para realizar la PCR
Esquema que muestra el procedimiento
que sigue un test de Elisa

Gel de agarosa mostrando

resultados de una PCR
para detectar virus

La banda que se encuentra a la altura del peso molecular (PM)

390 es la que significa que la muestra es positiva, por lo tanto las
muestras 1-8 son positivas y la 9 negativa.

80

Aplicacin del cultivo de meristemas

El cultivo de meristemas es una tcnica delicada, costosa y que
requiere de mano de obra calificada, sin embargo las plantas que
se obtienen a travs de l, constituyen un material que puede ser
propagado muchas veces, lo que significa que se constituye en un
material de partida.
Esto permite al agricultor beneficiarse de material libre de virus,
es decir el cultivo de meristemas puede realizarse en un laboratorio y
el agricultor adquirir las plantas saneadas para multiplicarlas y producir
flores, frutos, entre otros. Se tienen varios ejemplos de esto, como
el caso de los agricultores que cultivan rboles frutales, los cuales
adquieren plantines libres de virus y los utilizan para tener una mayor
produccin, ms uniforme y libre de enfermedades virales, esta tcnica es muy utilizada en la produccin de porta injertos de ctricos por
ejemplo. De igual manera, en el caso del cultivo de flores y forestales,
el cultivo de meristemas permite obtener plantines sanos que son
adquiridos por agricultores para su posterior produccin.
El cultivo de meristemas es un paso fundamental no solamente
en la produccin de plantines de alta calidad gentica y sanitaria, sino
tambin en la produccin de semilla de alta calidad gentica y sanitaria. Se utiliza fundamentalmente en plantas de reproduccin asexual
o vegetativa, como la papa, el camote o batata, la yuca y el banano,
entre otros. Las plantas de reproduccin asexual son aquellas que no
se transmiten por semilla, sino por una porcin de la misma planta
como un tubrculo o una raz. Tambin se utiliza cultivo de meristemas para limpiar plantas que transmiten virus de una generacin a la
otra mediante semilla, como es el caso de las habas.
La produccin de semilla de papa es imprescindible que se realice a partir de plantas libres de virus, propagadas in vitro en un laboratorio de cultivo de tejidos y que luego se trasplantan y se cultivan,
para su multiplicacin, dentro de una casa de malla que no permite
el ingreso de insectos vectores de los virus. Los tubrculos que se

cosechan en la casa de malla son sembrados en campo para la produccin de semilla comercial. Los agricultores pueden adquirir las
plantas in vitro o los tuberculos libres de virus, el hecho de partir de
un material saneado, permite mejorar considerablemente los rendimientos en campo del agricultor, ya que la papa tiende a acumular
enfermedades y despus de varias generaciones se tiene una semilla
cansada como le dicen los agricultores de los andes, que va a dar
lugar a bajos rendimientos y a veces a prdidas considerables.
Seleccin del material a sanear mediante cultivo de meristemas
Las tcnicas de limpieza viral, por su elevado costo (aproximadamente de 500 dlares por variedad) y por el tiempo que demandan (aproximadamente un ao), no se pueden utilizar en cualquier
material vegetal, por lo que la metodologa requiere priorizar el
material a ser saneado en base a los siguientes criterios:
a) Por la importancia econmica de la especie a sanear, la misma que debe responder a una demanda del sector productivo agrcola o forestal.
b) Por la importancia social y cultural, como en el caso de variedades nativas, que significan uno de los pocos sustentos para familias
campesinas y que han garantizado desde siempre su seguridad alimentaria, adems de significar un invalorable recurso gentico.
c) Por la cobertura geogrfica, que significa un beneficio y/o
participacin de varias comunidades.
En el caso de los bancos de germoplasma, donde se conservan
y salvaguardan un nmero importante de muestras que constituyen
la riqueza gentica de un pas, la necesidad de contar con material
libre de virus radica en: 1) la posibilidad de que las muestras sean
devueltas y reintroducidas a su zona de origen, 2) el material sea
utilizado en programas de mejoramiento gentico y 3) que ste
sirva de material madre dentro de un programa de produccin de
semilla (Aguirre y Coca, 2010).

81

Estudio de Caso:
Cultivo de Meristemas de Haba

Protocolo para la preparacin

del medio de cultivo de establecimiento

Se utiliza cultivo de meristemas en haba debido a que existen

virus que se transmiten por medio de semilla como los Potyvirus.
Las plantas libres de virus, sirven como plantas madres para la produccin de semilla de alta calidad gentica y sanitaria.
La extraccin de los meristemas puede realizarse en plantas
provenientes del invernadero o en plantas in vitro, en habas se obtiene una mejor respuesta cuando son extrados a partir de plantas
establecidas in vitro y multiplicadas en el laboratorio.
El siguiente protocolo para el establecimiento, multiplicacin,
enraizamiento, cultivo de meristemas y aclimatacin de plantas in
vitro de habas, ha sido desarrollado en el Centro de Investigaciones
Fitoecogenticas de Pairumani, Cochabamba, Bolivia.

1. Establecimiento del cultivo in vitro de habas

El primer paso para el establecimiento del cultivo de tejidos en
habas es desinfectar las semillas que sern introducidas al laboratorio. Estas semillas desinfectadas deben ser tratadas con un antioxidante y colocadas en un medio de cultivo para su germinacin.
Condiciones de incubacin de las semillas: temperatura 25C y
fotoperiodo de 16 horas de luz.

Tabla 1. Composicin del medio de cultivo de establecimiento

Metodologa para preparar el medio de cultivo
1. Sobre un agitador magntico con calentador, en un vaso de precipitado mezclar las sales minerales MS y la sacarosa (azcar) con
agua destilada
2. Ajustar el pH a 5.6 y adicionar el agar
3. Calentar el medio de cultivo para diluir el agar y posteriormente
dispensarlo en envases
4. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121C y 15
libras de presin
Protocolo de desinfeccin y tratamiento antioxidante
de semillas de haba
1. Colocar las semillas en el fungicida Benomyl por 2 horas (1gr/l)
2. Enjuagarlas 3 veces con agua destilada
3. Remojar las semillas en el acaricida Vertimex (1ml/l) durante 10
minutos
4. Enjuagarlas con agua destilada
5. A partir de este paso se realizan las manipulaciones en la cmara
de flujo laminar
6. Sumergir las semillas en alcohol al 70% por 5 minutos
7. Remojar las semillas en hipoclorito de sodio al 1% con Tween 20
(3 gotas) durante 15 minutos

82

8. Enjuagarlas 5 veces en agua destilada estril

9. Remojar las semillas en agua destilada estril por 24 horas para
facilitar el pelado
10. Una vez peladas las semillas, remojarlas durante una hora en
una solucin de polivinil pirrolidona (PVP) a una concentracin de
1g/litro, solucin esterilizada en autoclave
11. Colocar las semillas en papel filtro en medio de cultivo para
su germinacin

Semilla de haba germinada

en un papel filtro

Semilla de haba germinada

en medio de cultivo

2. Multiplicacin in vitro

Protocolo de preparacin del medio de cultivo

para la multiplicacin y el cultivo de meristema

Tabla 2. Composicin del medio de cultivo para la multiplicacin y el cultivo de meristemas de habas

y cultivo de meristemas de plntulas de haba

Metodologa para preparar el medio de cultivo

Las plantas obtenidas a partir de las semillas germinadas, se

colocan en un medio de cultivo que asegure la multiplicacin de
las mismas.

1. Sobre un agitador magntico con calentador, en un vaso de

precipitado mezclar todos los componentes del medio con excepcin del agar y ajustar el pH a 5.6
2. Adicionar el agar a la mezcla anterior
3. Calentar el medio de cultivo para diluir el agar y posteriormente dispensarlo en envases
4. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121C y 15
libras de presin

El cultivo de meristemas se realiza a partir de las plantas establecidas y multiplicadas in vitro, utilizando el mismo medio de cultivo
que se usa para la multiplicacin.

83

2.1. Multiplicacin in vitro o micropropagacin

La multiplicacin o micropropagacin de las plantas se realiza
mediante esquejes, los cuales sern colocados en un medio fresco.
Este procedimiento debe realizarse en la cmara de flujo laminar
con ayuda de pinzas y bisturs estriles.

mente antes de ingresarlo a la cmara de flujo laminar utilizando

hipoclorito de sodio. Los instrumentos que se utilizan en el proceso
son: pinzas , bisturs y una aguja de punta fina como la de la jeringa
para insulina. Esta ltima se usa para realizar los ltimos cortes que
tienen que ser ms precisos.

Las plantas micropropagadas deben incubarse a 25C con un

fotoperiodo de 16 horas de luz, durante dos meses.
Este proceso puede repetirse varias veces hasta obtener el nmero de plantas deseado. Una vez haya ocurrido esto, las plantas
pueden ser utilizadas para el cultivo de meristemas y en el caso
que se trate de plantas libres de virus, es decir que provienen de
cultivo de meristemas, debern ser trasladadas al medio de enraizamiento.

Manipulaciones para extraer el meristema dentro de una cmara

de flujo laminar con ayuda de un esteroscopio

Plntulas de haba micropropagadas

2.2. Cultivo de meristemas
En la cmara de flujo laminar y utilizando instrumentos estriles,
se extraen los meristemas de las plantas in vitro, bajo un microscopio estereoscopio. El estereoscopio debe ser limpiado cuidadosa-

En una placa petri se coloca la yema apical de la planta in vitro.

Con la ayuda de una pinza fina y una hoja de bistur tamao 11,
se corta una a una las hojas hasta llegar a los primordios foliares.
Al descubrir el domo meristemtico, se debe realizar un corte del
domo con mucho cuidado para no destrozarlo, colocarlo en el
medio de cultivo y incubarlo a 25C con un fotoperiodo de16
horas de luz. Se debe realizar cada semana un cambio de medio de
cultivo a medio fresco, durante dos meses. Luego de este tiempo
el meristema va a brotar y se va a convertir en una pequea planta
que deber ser trasladada a un medio de cultivo fresco para su
multiplicacin.

84

Protocolo de preparacin del medio de cultivo

Para el enraizamiento

Vista en el estereoscopio de un meristema de haba rodeado

de los primordios foliares

3. Enraizamiento in vitro de plntulas de haba

Las plantas micropropagadas o multiplicadas se trasladan al medio de enraizamiento hasta alcanzar la formacin de races suficiente para soportar la aclimatacin. Este periodo es de aproximadamente 2 meses, pero en algunos casos puede alargarse.
El traslado de las plantas micropropagadas al medio de enraizamiento debe realizarse en la cmara de flujo laminar con ayuda de
pinzas y bisturs estriles.
Las plantas en formacin de races deben incubarse a 25C con
un fotoperiodo de 16 horas de luz.

Tabla 3. Composicin del medio de cultivo para el enraizamiento

Metodologa para preparar el medio de cultivo
1. Sobre un agitador magntico con calentador, en un vaso de precipitado mezclar todos los componentes del medio con excepcin
del agar y ajustar el pH a 5.6
2. Adicionar el agar a la mezcla anterior
3. Calentar el medio de cultivo para diluir el agar y posteriormente
dispensalo en envases
4. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121C y 15
libras de presin

85

4. Aclimatacin de plntulas de habas en el

laboratorio

Lavado de las races

con agua destilada estril

Las plntulas con races se aclimatan de acuerdo al siguiente

protocolo:
1. Esterilizar en autoclave, tierra vegetal mezclada con un poco de arena
2. Bajo la cmara de flujo laminar con luz ultravioleta y por una
hora, colocar un recipiente de vidrio (tipo pecera), juntamente con
los envases en los que se aclimatarn las plantas
3. Dispensar la tierra estril en los envases humedeciendo con agua
destilada estril
4. Con mucho cuidado sacar las plntulas sin daarlas ni quebrarlas
5. Enjuagar las races con agua destilada estril
6. Colocar las plntulas en medio del envase y aadir ms tierra si
es necesario
7. Colocar los envases en el recipiente de vidrio y tapar con un
pedazo de plstico el recipiente
8. Durante los primeros das, destapar el plstico durante unos
cuantos minutos y as progresivamente hasta que la planta ya no
necesite del plstico
9. Las plantas aclimatadas se llevan a la casa de malla para la produccin de semilla de alta calidad gentica y fitosanitaria, posteriormente a que hayan pasado el diagnostico para detectar presencia
de virus

Plntula en tierra estril

Plantas de habas libres de virus

Plntula con races lista

para la aclimatacin
en aclimatacin en el laboratorio

Captulo 7

BIORREACTORES PARA MICROPROPAGACIN

Elaboracin de sistemas de inmersin temporal de bajo costo
para micropropagacin

Iselen Trujillo

89

Ficha tcnica
Innovacin tecnolgica:
Biorreactores de bajo costo para micro propagacin
Especies donde se puede aplicar:
Frutales, ornamentales, hortcolas
Usuarios del sistema:
Pequeos y medianos productores,
asociaciones de productores, laboratorios de bajo presupuesto
Generador de la Tecnologa:
Universidad del Zulia (Venezuela),
INIA-CENIAP (Venezuela), Universidad Nacional Experimental Simn
Rodrguez (Venezuela), Centro
de Investigacin en Biotecnologa del Instituto Tecnolgico
de Costa Rica, Universidad
Militar Nueva Granada (Colombia).
Trujillo y col.(2007)

Experiencia en el uso de la tecnologa:

Tecnologa adoptada por productores organizados y diversas
instituciones

Introduccin
Este captulo es una recopilacin de experiencias provenientes
de diversas unidades de investigacin con la intencin de que puedan ser implementados por pequeos o medianos productores o
por asociaciones de dichos productores para la produccin in vitro
de plantas con una eficiencia mayor que por tcnicas de propagacin in vitro convencionales
El incremento de las reas de siembra y la expectativa de un
sistema de mayor eficiencia para la propagacion de plantas in vitro
los sistemas convencionales no satisfacan las expectativas, ni en
cantidad ni en calidad, de aquellos materiales de inters comercial
ha planteado la necesidad de implementar sistemas que puedan
incrementar esa eficiencia (Buitrago 1999).

90

El desarrollo de tecnologas de gran eficiencia desde el punto

de vista biolgico,cuantitativo y econmico , que faciliten un mayor
grado de automatizacin en los procesos de almacenamiento y
multiplicacin de germoplasma valioso, permitirn a su vez disminuir los costos en la produccin de plantas in vitro. La propagacin
in vitro permite la obtencin de altas tasas de multiplicacin y de
una gran estabilidad gentica al compararse con los sistemas de
reproduccin agmica y clonal, donde se ha facilitado la reduccin
en costos de manipulacin, sin disminuir la eficiencia biolgica y
productiva, especficamente a nivel de plantas agrcolas y de uso
industrial (Prez Ponce,1998) . El cultivo in vitro de un rgano o de
un fragmento de un rgano, con el objeto de lograr su reproduccin vegetativa, se desarrolla siguiendo una estrategia constituida
por pasos esenciales: la iniciacin del cultivo en condiciones in vitro,
la multiplicacin activa de las estructuras capaces de desarrollarse como individuos idnticos a la planta donante y el paso de la
heterotrofia a la autotrofia, con la consiguiente adaptacin de las
plntulas obtenidas a las condiciones de cultivo in vivo.

aireacin (bomba), a una presin de salida que permita impulsar el

medio del compartimento inferior al superior durante un periodo
corto (periodo de inmersin). Este bao temporal que reciben
los explantes, se controla por un reloj programable que permite
la abertura automatizada de una electro-vlvula que controla el
sistema Fig 1(Escobar y col, 2000).

Figura 1. Esquema de
funcionamiento del sistema
de inmersion temporal RITA

Es en la etapa de multiplicacin de la propagacion in vitro, donde

es necesario implementar alternativas que favorezcan la eficiencia
del proceso.
El desarrollo de los sistemas de inmersin temporal o periodos cortos y determinados, pueden proveer un medio rpido y
eficiente para la propagacin de plantas en condiciones in vitro,
por medio de la induccin de rganos (brotes o races) en forma
directa en medio lquido; sin embargo, el alto costo de los sistemas
comerciales desarrollados para tal fin, como lo es caso de sistema RITA ha limitado su uso. El sistema consiste en un recipiente
plstico (RITA) dividido en dos compartimentos. En el superior
se coloca el tejido o segmento de la planta a multiplicar (por ejemplo brotes) y en la parte inferior el medio de cultivo. Este sistema
cuenta con dos filtros reutilizables: uno central (entrada de aire) y
uno lateral (salida de aire). El filtro central se conecta al sistema de

Por este motivo, se plantearon como objetivos en este trabajo presentar alternativas de bajo costo para la micropropagacin
de especies de inters, ofertando un prototipo econmico para la
propagacin in vitro a travs del sistema de biorreactores
La tecnologa de los sistemas de inmersin temporal puede
presentarse como una alternativa viable que permitir mejorar los
coeficientes de multiplicacin, el desarrollo de brotes y plntulas
y la calidad fisiolgica de las plntulas obtenidas por este procedimiento. La construccin de un sistema prototipo de biorreactor de
inmersin temporal de bajo costo, en el que se pueda garantizar
adems de un ptimo funcionamiento y proveer condiciones estriles para el cultivo, resulta ser altamente viable desde el punto de

91

vista econmico y prctico, ya que al comparar este prototipo con

el sistema comercial RITA, su costo es al menos 3 veces menor
que el sistema comercial, con una vida til mas prolongada, permitiendo muchos ciclos de esterilizacin, mientras que los filtros para
el sistema RITA son muy limitados (aproximadamente 10 ciclos)
(Gimnez y Colmenares, 2004)
Problema que resuelve
El uso de Biorreactores de Inmersin Temporal (BIT) disminuye
los costos y aumenta los volmenes de produccin en limitados
espacios fsicos, la combinacin de estos factores constituyen una
garanta en la obtencin de plantas de alta calidad a bajo costo. Este
tipo de tecnologa ha sido empleada como complemento importante y denominado tecnologa superior en la propagacin masiva
de varias familias botnicas de plantas ornamentales, frutales, ornamentales y de inters agrcola en general . (Prez-Ponce, 1998)
Descripcin de la tecnologa
La propagacin masiva in vitro de plantas se puede realizar en
biorreactores de inmersin temporal, conocidos comercialmente
como Recipientes de Inmersin Temporal automatizados.
Los recipientes poseen doble compartimiento y se conectan
a un sistema de inyeccin de aire, con frecuencia y duracin controlada por un reloj programable. El aire suministrado al recipiente,
impulsa el medio de cultivo lquido del compartimiento inferior al
superior, sumergiendo el tejido vegetal; cuando el suministro de
aire finaliza, el medio de cultivo regresa por gravedad al compartimiento inferior del recipiente. De esta manera, el tejido vegetal
absorbe los nutrientes necesarios para su crecimiento durante le

tiempo de contacto con el medio de cultivo.

Diseo de un sistema de inmersin temporal
El sistema de inmersin temporal puede ser construido con
frascos de vidrio para almacenar alimentos, con capacidad diversa
(una buena recomendacin es 500 gr), cubiertos por tapas de plstico (envases). Las tapas son horadadas para abrir dos orificios a
travs de las cuales se colocaran conexiones plsticas de polipropileno de pulgada con tuercas y empacaduras de goma (Nalgene
6149-0002).
Una de las conexiones se usar para recircular el medio de cultivo entre los frascos. La otra conexin del envase corresponder
a la entrada de aire que es esterilizado por filtracin a travs de un
filtro de goma espuma de varias capas. Los filtros pueden ser diseados con tubos cilndricos de vidrio de 7 cm de largo y 5 mm de
dimetro, rellenos con un cilindro de 70 mg de goma espuma del
mismo tamao del tubo de vidrio. La circulacin del medio se logra
al conectar los frascos por intermedio de estas conexiones con una
manguera de silicona tratada con nquel (Nagelne 50, 8060-0060)
que recorre desde el fondo de un frasco al fondo del otro.
En este sistema un frasco contiene los explantes, o sea, los segmentos de la planta que se quieren propagar, y el otro el medio de
cultivo lquido (Figura 2).
El flujo de aire que entra por el filtro aumenta la presin en
el recipiente e impulsa el lquido a travs de la tubera de silicona
hacia el envase que contiene los explantes , en donde el aire es
desplazado por el medio de cultivo y sale por el filtro de aire de
goma espuma, durante este proceso las vlvulas se abren, por una
entra el aire y por la otra sale (Figura 2).
El sistema completamente armado debe ser esterilizado en
autoclave a 120C, 1,5 kg/cm2 durante 15 min, o en una olla de

92

presin para cocinar alimentos, por un periodo de 20 min luego

que la valvula de la olla comienza a sonar.

como objetivo desarrollar un vaso fermentador de bajo costo para

la micropropagacin masiva de jengibre.

Para el control de la inmersin en este sistema de doble envase se emplean cuatro electro-vlvulas plsticas, un temporizador
programable digital de 6 ciclos de encendido/ apagado con tiempo
mnimo de 1 min, un compresor de aire y mangueras plsticas de
polietileno rgido de 5/8 pulgadas, unidas con conexiones T para la
distribucin del aire a los sistemas.

El vaso fermentador propuesto en este trabajo manejo una

capacidad de 50 a 75 brotes como material de partida en 350 ml
de medio de cultivo lquido. Se disearon cuatro modelos de vasos
fermentadores con base en un recipiente de vidrio de cuatro litros
de capacidad y todos ellos con dos fi ltros millipore de 0,2 m en
la parte superior, uno para la entrada de aire y otro para la salida de
gases. Para la provisin de aire y la oxigenacin del medio de cultivo
se utiliz un motor elctrico funcionando permanentemente.

Estas mangueras y conexiones las distribuyen los comercios dedicados a sistemas de riego (Gimnez y Colmenares, 2004).

F i g u ra 2. Prototipos
constr uidos
en el Laboratorio
de
Biotecnologa
Vegetal
(BioVeLUZ)Universidad del
Zulia para procesos de inmersin temporal (Gimnez y Colmenares, 2004)
Otra alternativa fue desarrollada por el Centro de Investigacin
en Biotecnologa del Instituto Tecnolgico de Costa Rica, y tuvo

La variacin entre los modelos utilizados consisti en el tipo

de aglomerante empleado: sin soporte (modelo simple), rejilla
de polipropileno (modelo rejilla), espuma de algodn (modelo
espuma) y piedras de material inerte de 1 cm de largo y 3 mm
de ancho (modelo piedras inertes). El modelo de piedras inertes
para la micropropagacin de jengibre permiti que los explantes
no estn en constante contacto con el medio de cultivo en estado lquido por lo que se disminuyen los problemas asociados con
la hiperhidricidad. En comparacin con los explantes propagados
en medio semislido, el modelo de piedras inertes present ciertas ventajas: se puede cultivar un mayor nmero de explantes con
una menor cantidad de medio lquido (de 50 a 75 explantes por
350 ml de medio), se disminuy el costo debido a la ausencia de
gelificante y a la reduccin de mano de obra. Adems, los explantes tuvieron la posibilidad de alcanzar una mayor altura debido
al mayor tamao e intercambio gaseoso del recipiente del vaso
fermentador en comparacin con los envases convencionales de
menor tamao (Hernndez-Soto y col, 2008).
En el laboratorio de Biotecnologa Vegetal de la Facultad de
Ciencias en la Universidad Militar Nueva Granada se dise y construy un sistema prototipo de inmersin temporal con insumos
nacionales, demostrndose con esto que es posible tener un sis-

93

tema de bajo costo en el cual se lograron mantener condiciones

totales de asepsia, adems de demostrar ser un sistema fcil de
manipular y que puede escalarse con facilidad (Fig. 3) (Monroy y
Filgueira , 2010).

Estudios de caso
A continuacin se describe la metodologa de propagacin in
vitro a travs de biorreactores de inmersin temporal para tres
rubros de gran importancia para la seguridad alimentaria, sin embargo, igualmente se describe un paso previo relativo a la desinfeccin de los biorreactores que es importante para todas las
especies a ser propagadas por este sistema:
Desinfeccin de los biorreactores
Para obtener resultados ptimos se esterilizan los biorreactores de acuerdo al siguiente procedimiento:
Se emplea agua jabonosa y cloro comercial en una primera
etapa de desinfeccin.
Posteriormente tubos y conectores de plstico se lavan con
un cepillo especial cilndrico y los filtros se autoclavan juntos con
los envases empleados como base para la multiplicacin previamente armados (120 C a 15 atm de presin por 30 minutos).

Figura 3. Prototipo construido en el Laboratorio de Biotecnologa Vegetal de Universidad Militar Nueva Granada (Monroy y Filgueira , 2010)

Luego se someten a la exposicin de luz ultravioleta (16 h) y

luego se agregan los medios lquidos. A cada envase se le agregan
200 ml de medio y se autoclavan nuevamente por 15 minutos.
Los medios empleados pueden elaborarse a partir de jugos de
frutas y no de reactivos comerciales, que proporcionaran macro
y micronutrientes para el crecimiento y multiplicacin del material vegetal, aadiendo agua de coco como fuente de vitaminas y
hormonas, como una opcin para disminuir costos del proceso .

94

Propagacin de bananos a partir del cultivo

de pices caulinares en sistemas de biorreactores
de inmersin temporal

Material vegetal
Hijuelos de Banano, Clon Pineo Gigante
Metodologa
-Aislamiento de pices caulinares a partir de cormos obtenidos
en campo.
Los cormos o hijuelos (tallo engrosado subterrneo, de base
hinchada y crecimiento vertical que contiene nudos y abultamientos
de los que salen yemas, y que constituye excelente material para
iniciar un proceso de multiplicacin) se trasladan a un lugar limpio y
adecuado para este procedimiento, donde se les realiza la limpieza
total de hojas del pseudotallo, dejndolos de un tamao aproximado
de 7 cm. Seguidamente se procede a la desinfeccin, la cual puede
ser realizada con jabn liquido comercial durante 1 min., seguido
de un lavado con agua corriente, alcohol 90% durante 1 min., y se
procede a su aislamiento en un rea estril (campana de flujo laminar o zona aislada con presencia de mecheros) agregndole cloro
comercial al 50 % durante 30 min. Despus se realizan tres lavados
con suficiente agua destilada estril, y se procede a quitar los restos
de pseudotallo con la ayuda de un bistur en condiciones aspticas,
hasta obtener pices de aproximadamente 3 - 5 mm.
-Cultivo de pices caulinares en medio de cultivo semislido
Los pices se cultivan en un medio MS con citocininas y vitaminas, se incuban en un cuarto climtico o de crecimiento en
oscuridad durante 1 mes a 27 1C de temperatura, y luego son
cambiados a 12 horas de luz diaria y doce de oscuridad durante 1
o 2 meses con subcultivos mensuales de los explantes en el mismo
medio de cultivo mencionado. Posteriormente los brotes desarro-

llados se cultivaron en un medio MS sin sustancias de crecimiento

para lograr el enraizamiento de estos.
-Cultivo de pices caulinares en biorreactores
de inmersin temporal
Se cultivan los pices caulinares con proliferacin de yemas
(obtenidos previamente en medio semislido) en cada uno de los
biorreactores de inmersin temporal. Se utilizan tiempos de inmersin diaria de 5 min cada 4 horas y 10 min cada 4 horas.
-Aclimatacin de vitroplantas
Las vitroplantas obtenidas a partir de biorreactores de inmersin temporal se aclimatan abriendo la tapa de los recipientes para
adaptarlas a las condiciones ambientales, y luego se transfieren a
cuartos de aclimatacin durante 2 semanas para ser luego llevadas
al umbrculo en bolsas de vivero con una mezcla de tierra, arena y
fibra de coco en proporcin 1:1:1 durante un mes. En esta etapa de
crecimiento las plantas estn listas para ser llevadas a campo o para
ser utilizadas nuevamente como fuente de explante para la extraccin de pices caulinares en un segundo ciclo de propagacin in
vitro. (Fig.4)(Gonzlez y col, 2006; Silva y col, 2007)

Fig. 4 Plantas de Banano Clon Pineo Gigante obtenidas por biorreactor de inmersin temporal creciendo en cuarto climtico.

95

Propagacin de pia a partir de yemas

en sistemas de biorreactores de inmersin temporal

Material Vegetal
Plantas de pia de las variedades Valera Amarilla y Valera Roja
fueron empleadas como plantas madres para la iniciacin de este
proceso.
-Multiplicacin en biorreactores de inmersin temporal
Las vitroplantas se sometieron a un proceso de multiplicacin
utilizando un medio liquido a base de sales de Murashige y Skoog,
suplementados con tiamina 5 mg/l, mioinositol 100 mg/l, sacarosa
30 gr/l y BA 2 mg/l. Los explantes se cultivaron a 26 C bajo luz
blanca fluorescente con un perodo de 16 horas luz y 8 horas de
oscuridad.
En una segunda etapa de multiplicacin, se estandariz el nmero de yemas por biorreactor, cultivando 6 por envase en el mismo medio de cultivo descrito anteriormente pero disminuyendo la
concentracin de BA a 1 mg/l. (Fig. 5) (Trujillo y col, 2007).

Fig.5 Multiplicacin de
Pia en biorreactores de inmersin temporal

-Enraizamiento y aclimatacin
Las plantas obtenidas in vitro se transplantan a vasos plsticos
que contienen una mezcla de arena y tierra abonada en proporcin 2:1 con la adicin de humus en un porcentaje de 50 %. Estos
envases se colocan en cajones de aclimatacin con aserrn donde
se registraba una humedad relativa de 85 % y una temperatura de
27 C. Durante esta etapa, las plantas propagadas in vitro son sometidas a perodos de luz cortos (30 min) tres veces al da durante
la primera semana. En la segunda semana, los perodos de luz se
incrementan a dos horas tres veces al da, y en la tercera semana
las plantas son sometidas a un perodo de luz de 8 h por da. Posteriormente, las plantas son trasladadas a condiciones de vivero.
(Trujillo y col, 2007)

Propagacin in vitro de de Pltano Hartn

Iniciacin del cultivo
Los explantes, se desinfectan en una solucin de cloro comercial al 50 % en un rea limpia y estril (cmara de flujo laminar o
zona acondicionada) y posteriormente se sumergen en agua estril.
En estas condiciones se procede aspticamente a reducir el tamao a 1 cm. de longitud. Adicionalmente, os explantes se someten a
un tratamiento antioxidante, sumergindolos en una solucin estril de cistena 60 mg/l, en donde permanecen por un perodo de 10
minutos, para luego ser transferidos al medio de cultivo.
Los explantes se cultivan en un medio bsico de Murashige y
Skoog (1962), suplementado con vitaminas, azcar (30 gr/l )como
fuente de carbohidratos y agar (9 gr/l) como agente gelificante. A
este medio se adicion benciladenina (BA) 0,5 mg/l como fuente
de citocininas.
Luego de la siembra, los explantes permanecen en oscuridad
por 48 horas para disminuir daos por oxidacin e inmediatamen-

96

te se pasan a cmaras de crecimiento y se mantienen a una temperatura promedio de 26 C y a una intensidad lumnica continua
por un periodo de 30 das.
Proliferacin de brotes en medio slido
En esta fase se obtiene la proliferacin de brotes que originan
nuevas plntulas. Esto puede ser obtenido a travs de la formacin
de brotes axilares y por la induccin de brotes adventicios.
Despus de cumplida la etapa de iniciacin, los explantes se
transfirieron a un medio de cultivo con las mismas concentraciones
de sales, vitaminas, sacarosa y agar que se utilizaron en el medio de
iniciacin, pero aumentando las concentraciones de citocininas a 5
mg/l, ya que se ha sealado que un incremento en la produccin de
brotes se logra aumentando las dosis de citocininas en cada subcultivo, posterior al perodo de iniciacin. Los explantes fueron sembrados en frascos de vidrio que contenan 50 ml de medio de cultivo, a
razn de 4 explantes por envase. Las condiciones de cultivo fueron
las mismas que las descritas durante la fase de iniciacin.
Multiplicacin de brotes en biorreactor de inmersin temporal
Los brotes empleados para la multiplicacin en biorreactores
se aislan a partir de plantas cultivadas in vitro en medio slido. Los
explantes fueron cultivados en un medio liquido base de Murashige
y Skoog (1962), al que se le aade vitaminas, azcar (30 g/l) como
fuente de carbohidratos y se ajusta el pH a 5.8. Se emplea una concentracin de BA de 5 mg/l y perodos de tiempo con frecuencias
de inmersin preestablecidas (2 min cada 2 horas; 5 min cada 4
horas y 6 min cada 6 horas). Las plantas crecieron a 26 C bajo luz
blanca fluorescente con 16 horas luz y 8 de oscuridad.
Las plantas propagadas en biorreactores de inmersin temporal se aclimatan abriendo la tapa de los recipientes para adaptarlas

a las condiciones ambientales y luego se transfieren a un cuarto de

aclimatacin durante 2 semanas. (Fig. 6). Posteriormente se trasladan al umbrculo en bolsas de vivero con una mezcla de tierra y
arena en una proporcin 1:1 durante quince das. Posterior a esta
etapa de de endurecimiento, las plantas estn listas para ser llevadas
a campo. (Silva y col, 2006; Trujillo y col, 2007)

Fig. 6. Plantas propagadas de Pltano Hartn en

biorreactores de inmersin
temporal a iniciar el proceso
de aclimatacin
Contexto de uso o adaptacin
Los frutales son de gran importancia al momento de evaluar
perspectivas para el desarrollo de la seguridad alimentaria en nuestro pas. En el caso de las musceas son consideradas como un
rubro alimenticio de gran importancia a nivel mundial, siendo su
produccin superada solamente por los ctricos. Constituyen un
componente importante de la dieta de los pobladores de aquellos
lugares donde se cultiva, debido a su gran contenido de vitaminas
y potasio, constituyendo a su vez una fuente de empleo y de divisas por su alto nivel de comercializacin. Sin embargo, el ataque
de insectos, plagas y enfermedades ha ocasionado prdidas en las
cosechas. Debido a diversos problemas que presenta el mejoramiento por mtodos tradicionales, las tcnicas utilizadas en Biotecnologa Vegetal plantean nuevas alternativas y ofrecen un inmenso
potencial, ya que han permitido acortar el tiempo requerido para
generar plantas en especies agrcolas de inters como Musa, pia,

97

papa, caf, entre otras. El desarrollo de sistemas de inmersin temporal para la optimizacin de la multiplicacin de especies bajo
condiciones ptimas es una buena alternativa de propagacin a
escala comercial.
Costo estimado de aplicacin de la tecnologa
El equipo necesario para la instalacin de un sistema de inmersin temporal de las caractersticas sealadas en esta ficha tiene
un valor aproximado entre 30-40 U$ en todas las experiencias
referidas. Los sistemas de inmersin temporal comerciales tienen
un costo aproximado por unidad entre 100 y 140 $USD, ms el
costo del compresor de aire y la instalacin elctrica, por lo que se
puede sealar que los prototipos cuestan un tercio del costo del
recipiente RITA .
Resultados esperados, ventajas o Impactos potenciales
Con el uso de biorreactores de inmersin temporal, se obtiene un mayor nmero de plantas por recipiente, el reemplazo
del medio de cultivo es sencillo y demanda poca mano de obra.
Dependiendo de la especie, el periodo de tiempo empleado para
la regeneracin de plantas utilizando biorreactores pueden ser relativamente cortos y genera gran cantidad de plantas, lo cual influye
drsticamente en la disminucin de los costos de produccin. El
material vegetal propagado por inmersin temporal presenta un
mejor crecimiento durante la fase de aclimatacin comparado con
el material obtenido en medio semislido o lquido (Berthouly y
Etienne, 2002).
La eliminacin del agar en el medio de cultivo, y el uso de luz
natural en cuartos de crecimiento pueden disminuir hasta un 90 %
de los costos empleados para establecer el sistema (Kodym and
Zapata, 2001).

Adicionalmente, los filtros de goma espuma utilizados en algunos de los prototipos permiten esterilizar el aire que entra tanto
a los recipientes RITA como a los prototipos, con un costo ms
econmicos, son mas duraderos, y es un material de fcil acceso.
La utilizacin de biorreactores en el proceso de obtencin de
plantas de frutales in vitro puede mejorar sustancialmente el rendimiento y el ingreso de las personas dedicadas al comercio de esos
rubros, lo que indirectamente ha contribuido a seguir impulsando
la investigacin en el rea, lo cual genera un interesante crculo de
desarrollo productivocientfico.
Incrementar considerablemente el coeficiente de multiplicacin de brotes en comparacin con las formas convencionales
Reduccin de costos por vitroplantas
Reduccin del nmero de frascos y estantes en las cmaras
de cultivo
Mayor produccin por metros cuadrados
Mejor nutricin mineral
Un contacto estrecho entre la superficie de los explantes y el
medio durante la fase de inmersin

Captulo 8

MARCADORES MOLECULARES

Mara de Lourdes Torres

Lorena Meja

101

Introduccin
Desde el inicio de la civilizacin, el ser humano
ha ido seleccionando caractersticas de inters principalmente de plantas y animales, eligiendo as rasgos
fsicos, como forma, color, tamao, entre otros, para
su beneficio (Picca et al, n.f.).

gramas de mejoramiento gentico, pues permite,

Estas caractersticas deseadas son conocidas tambin como marcadores morfolgicos, porque por
ejemplo, una determinada variedad de planta puede
ser reconocida por este rasgo.

cin mejorada.

adems de la organizacin del material la seleccin adecuada de obtener plantas superiores o

elite y la complementacin con datos fenotpicos
y agronmicos para el desarrollo de una pobla-

Esta forma de seleccin

basada en los denominados marcadores morfolgicos, ha sido muy utiliza-

Para entender mejor este concepto, analicemos

el siguiente caso: una variedad de maz es ms alta
que otras, y se distingue adems por ser una variedad con un grano ms grueso. Entonces el marcador morfolgico: mayor tamao est asociado a una
mejor calidad de grano, por lo tanto, los agricultores
usarn este marcador para seleccionar su material
vegetal, ya que si seleccionan plantas altas, tambin
estarn seleccionando mejores granos.
Conocer la similitud entre los individuos y
las poblaciones es de gran utilidad en los pro-

da, porque ha contribuido

al mejoramiento de animales y plantas, y de esta
manera ha colaborado
para que los agricultores y
ganaderos manejen variedades con caractersticas

Fuente: Descriptores de quinua, Consejo internacional de recursos fitogeneticos International board

for plant genetic resources (cirf/ibpgr), 1984

superiores.

102

A lo largo de la historia del mejoramiento gentico, se han desarrollado otros tipos de marcadores,
ms all de los morfolgicos, que han sido utilizados
principalmente en la agricultura siempre con el fin de
obtener variedades con nuevas caractersticas.

Los marcadores bioqumicos

a) Protenas de reserva en semilla. el uso de protenas de almacenamiento se basa en el hecho que

las protenas de diferentes individuos, poblaciones y
especies son homlogas, y que al separarse en un
gel producirn bandas similares o diferentes.Ellas son
detectadas en el gel por medio de tcnicas generales
de teido.

Estos marcadores permiten conocer la informacin gentica que los organismos poseen y evidenciar las diferencias entre un grupo de organismos dentro y entre especies (Picca et al, n.f.). La
importancia de estos marcadores es que no son
afectados por el ambiente ni por las condiciones del
cultivo y pueden ser utilizados en fases tempranas
de desarrollo de las plantas (Martnez, n.f.).
Para comprender mejor cmo funcionan los
marcadores moleculares, empecemos conociendo
la estructura del ADN que es el material gentico
de todos los seres vivos.
ADN =Acido desoxirribonucleico.

b) Isoenzimas.Con el avance tecnolgico ocurrido

en los aos 70, el uso de geles de almidn y la tincin
histoqumica de las protenas, se demostr dentro de
un organismo la existencia de las isoenzimas, formas
moleculares mltiples dentro de un organismo que
catalizan una misma reaccin. El efecto de una modificacin allica puede ser detectado con certeza, debido a un cambio de movilidad electrofortica. Esta
sensibilidad electrofortica hizo que la tcnica haya
revolucionado los estudios de diversidad gentica en
diversas especies.

Se los conoce con el nombre de marcadores moleculares y funcionan como

sealadores de diferentes
regiones del genoma

En la actualidad, debido al conocimiento de la estructura del cido desoxirribonucleico (ADN) y a la

disponibilidad de varias tcnicas moleculares, se han
desarrollado los denominados marcadores moleculares que han demostrado ser ms exactos y eficientes
para llevar a cabo procesos de mejoramiento animal
y vegetal.

En 1953, despus de muchos aos de investigacin, James Watson y Francis Crick de la Universidad de Cambridge, determinaron la estructura del
ADN analizando la informacin previa que haban
obtenido muchos cientficos.
La unidad de construccin de esta macromolcula es el nucletido, el mismo que est constituido por
un azcar de 5 carbonos, la desoxirribosa, a la cual se
une un grupo fosfato y una base nitrogenada (Figura
1). Hay cuatro bases nitrogenadas que intervienen
en la estructura del ADN: Adenina (A), Timina (T),
Citosina (C) y Guanina (G), por lo tanto, hay cuatro
tipos diferentes de nucletidos (Figura 2).

103

Fig. 1. Nucletido. Unidad que conforma el ADN. Constituido

por un grupo fosfato, un azcar de 5 carbonos y una base nitrogenada (National Institutes of Health, n.f.).

Fig. 2. Tipos de Bases Nitrogenadas. Adenina, Timina, Guanina y

Citosina (National Institutes of Health, n.f.).

El ADN est formado por una doble hlice, es decir, por dos
cadenas de nucletidos que se enrollan alrededor de un eje central.
En cada cadena los nucletidos se van uniendo a travs de enlaces
que se producen entre los tomos del azcar de los nucletidos
adyacentes, lo que permite que se produzcan largas cadenas lineales,
las mismas que tienen una polaridad ya que un extremo de la cadena
lineal tiene un grupo 5-0H libre (carbono 5 del azcar) y el otro extremo tiene el grupo 3-OH libre (carbono 3 del azcar). Cuando se
unen las dos cadenas para formar la doble hlice el sentido de stas
es antiparalelo, es decir, la una cadena va en direccin 5 3 y la otra
en direccin 3 5, adems las cadenas se unen a travs de las bases
nitrogenadas (puentes de hidrgeno) y lo hacen especficamente, la
adenina solo se puede unir con la timina y la citosina solo con la guanina. Por lo tanto, si analizamos la Figura 3 vemos que el esqueleto de
la molcula de ADN est formado por los azcares y grupos fosfatos
hacia el exterior y las bases nitrogenadas hacia el interior. Dentro de
esta estructura se puede decir que los grupos de azcar y fosfato
tienen una funcin estructural, mientras que la secuencia de las bases
nitrogenadas, que es propia
para cada individuo, es la
portadora de la informacin
gentica (Torres, 2008).

Fig. 3. Estructura del

ADN. Molcula formada
por un esqueleto de grupos
fosfato y azcar en la parte
externa, y en su interior se
encuentran las bases nitrogenadas unidas por puentes
de hidrgeno (National Institutes of Health, n.f.).

104

Seguramente hemos escuchado hablar de genes y cromosomas,

entonces ahora podemos complementar esta informacin sabiendo que una molcula de ADN es un cromosoma y que si una
especie tiene por ejemplo 20 cromosomas tendr 20 molculas
de ADN. Cada cromosoma contiene diferente nmero de genes,
entendindose por gen un segmento de ADN que sirve como una
unidad de informacin hereditaria. La definicin de gen es muy
compleja y de acuerdo a los avances cientficos sta se sigue ampliando, pero para fines de esta publicacin se define al gen como
una secuencia de ADN (un segmento) de la cual se obtiene una
protena o una molcula de ARN con una funcin especfica.
Conociendo la estructura del ADN se puede entonces inferir
dnde se encuentra y guarda la informacin gentica de un individuo. La secuencia (el orden) de las bases nitrogenadas es el lenguaje de los seres vivos y lo que difiere entre un individuo y otro.
Otro trmino que debemos conocer antes de hablar sobre
marcadores moleculares es genoma que se lo puede definir como
toda la informacin gentica que posee un organismo, es decir
todo el ADN que tiene un individuo.

secuencia RAPD y se trata de ver si sta se encuentra dentro de

un determinado genoma, se debe realizar una reaccin de amplificacin del ADN que en trminos sencillos implica que se expone
a un genoma determinado a la secuencia de 10 nucletidos y se
analiza en qu partes del genoma se pega esta secuencia. Dependiendo del RAPD y del genoma, cada secuencia de este tipo puede
encontrarse una o varias veces dentro de un genoma determinado
(Picca et al, n.f.). En la Figura 4 se puede observar el genoma del
organismo de color naranja, y las lneas irregulares de color blanco
que corresponden a la amplificacin de la secuencia de 10 nucletidos. En la parte derecha de las dos figuras se encuentra una matriz con lneas que varan entre color amarillo y naranja que indican
los tamaos de los segmentos amplificados en los organismos estudiados. En la segunda figura podemos observar que el individuo
2 carece de la segunda lnea lo que demuestra diferencias en sus
genomas. Conociendo entonces los patrones generados por este
tipo de marcador molecular, claramente se observa que se pueden
distinguir dos individuos, dos variedades, dos especies diferentes.

Marcadores Moleculares de fcil aplicacin

A continuacin se describen los tipos de marcadores moleculares que se utilizan ms comnmente para caracterizar individuos,
variedades, especies y lograr a travs de este anlisis molecular, por
ejemplo, mejorar plantas y animales.
RAPDs (Siglas en ingls que en espaol se llaman
ADN Polimrfico Amplificado al Azar)
Son secuencias nicas de ADN de aproximadamente 10 nucletidos que hibridan al azar con el ADN del organismo estudiado
generando segmentos de distintos tamaos. As, si se utiliza una

Fig. 4. Representacin de la localizacin de secuencias RAPDs
en genoma de dos individuos y patrn de bandas generado utilizando estos marcadores (Dcima-Oneto y Bossio, n.f.)

105

Una de las ventajas ms importantes de este

marcador molecular es que no se requiere conocimiento previo del genoma de los organismos que sern analizados y es un ensayo cuyos
resultados pueden obtenerse de manera rpida
y econmica; mientras que una desventaja es
que es una tcnica muy sensible a cambios en el
protocolo, es decir no es fcil replicar los resultados obtenidos entre un laboratorio y otro.
AFLPs (Siglas en ingls que en espaol se
llaman polimorfismos en la longitud de
fragmentos amplificados)
El procedimiento para utilizar este tipo
de marcador molecular consiste primero en
cortar al genoma de un individuo en una serie de fragmentos utilizando unas enzimas que se llaman enzimas
de restriccin. Luego a los extremos de los fragmentos
de ADN cortado se adhieren un pedacitos cortos de
ADN de cadena doble llamados adaptadores. Posteriormente, se realizan dos etapas de amplificacin del
ADN utilizando unas secuencias de ADN que se llaman iniciadores y que son las responsables de unirse
al ADN que se est analizando de forma especfica
para obtener patrones de bandas que nos permitan
diferenciar individuos, variedades, especies entre s (Ver
Figura 5 y Figura 6).

Los AFLPs son una herramienta poderosa para
analizar genomas, dado que poseen un alto poder
de deteccin de la variabilidad gentica. Sin embargo
presenta tambin algunas desventajas. Es una tcnica
compleja que requiere mayores recursos de infraestructura y econmicos (Picca et al, n.f.).

Fig. 5. Esquema del proceso de amplificacin de AFLPs que inicia con la digestin del genoma con enzimas de restriccin, ligacin de los adaptadores y los
dos procesos de amplificacin. (DcimaOneto y Bossio, n.f.)
Microsatlites
Son repeticiones de secuencias cortas de ADN, una junto a la otra, (de 1a
10 nucletidos) que forman fragmentos
de menos de 150 pares de bases en diferentes sitios del genoma de una especie.
A travs del uso de este marcador molecular se
puede ver la variacin que existe entre un individuo
y otro ya que el nmero de repeticiones de un microsatlite determinado vara entre individuos. Entonces si se conocen las secuencias microsatlites

Fig. 6. Patrn de bandas

obtenidas por la amplificacin de AFLPs. (DcimaOneto y Bossio, n.f.)

106

de una especie, se pueden buscar stas en diferentes individuos

y ver la variabilidad gentica que existe entre ellos y entre variedades de una misma especie. Nuevamente se utiliza la reaccin
de amplificacin del ADN, para obtener patrones de bandas que
variarn de tamao dependiendo de las diferencias que existan
en la cantidad de repeticiones de estas secuencias cortas en cada
individuo analizado. (Ver Figuras 7 y 8).

Fig. 8. Esquema del patrn de bandas obtenidas utilizando marcadores microsatlites (Dcima-Oneto y Bossio, n.f.).
Como ya se mencion anteriormente, la aplicacin ms importante de los marcadores genticos en la agricultura es que se
los utiliza como apoyo para lograr mejoramiento gentico, es decir
obtencin de variedades mejoradas de forma ms eficiente y en
menos tiempo.
Fig. 7. Representacin de marcadores microsatlites en el genoma (Dcima-Oneto y Bossio, n.f.)
Estos marcadores de ADN, permiten determinar un alto grado de variabilidad, y son muy buenos para determinar diferencias
entre individuos y variedades, pero se requiere previamente conocer las secuencias microsatlites que son especficas para cada
especie, lo que implica mayor conocimiento cientfico y tecnolgico, lo que a su vez demanda mayor infraestructura y cantidad
de recursos econmicos.

Mejoramiento Asistido por Marcadores

Esta metodologa se basa en la seleccin de organismos que
presentan una caracterstica de inters agronmico ligada a un
marcador molecular.
Para mencionar un ejemplo, el Instituto Nacional de Tecnologa
Agropecuaria de Argentina ha trabajado en el mejoramiento de
trigo para lograr una variedad mejorada que contenga mayor contenido proteico. Se identificaron marcadores moleculares ligados
al gen que confiere esta caracterstica mayor contenido proteico,
y as podrn utilizar esta informacin para obtener variedades de
trigo con un 13% ms de protena y con un rendimiento adecua-

107

do (Nisi et al, n.f.). Este ejemplo demuestra claramente la utilidad

de esta herramienta molecular para obtener variedades vegetales
nuevas que satisfagan las necesidades de los agricultores y consumidores.
Otro ejemplo interesante es el mejoramiento de frjol utilizando marcadores moleculares en Colombia. El cultivo de frjol en
Colombia es muy importante no solo por el volumen de produccin y valor alimenticio sino tambin por el fuerte consumo de este
producto en las comunidades populares. Una de las enfermedades
ms limitantes de este cultivo es la llamada antracnosis causada
principalmente por el hongo Colletotrichum lindemuhtianum y se
han identificado 61 razas diferentes de este patgeno. Por otro
lado, se han descubierto varios marcadores moleculares ligados a
genes de resistencia a esta enfermedad con los que se trabaja para
obtener nuevas variedades de frjol con ndices altos de resistencia
a la antracnosis (Nayibe, Blair y Ligarreto, 2007).
Al momento se trabaja con 6 variedades comerciales de frijol
colombiano (Agrario, Comerical, Cabrera, Cargamento, D. Moreno,
Pesca y Simijaca) con el fin de lograr que estas, a travs de cruces
convencionales, adquieran la mencionada resistencia y sean variedades con un buen rendimiento (Nayibe, Blair y Ligarreto, 2007).
Es evidente que el aporte de los marcadores moleculares hoy
en da es fundamental para obtener procesos de mejoramiento gentico de forma ms eficiente. Sin embargo, es importante recalcar
que el uso de marcadores moleculares no sera posible sin el apoyo
de las tcnicas de mejoramiento convencional, que los agricultores
las han practicado desde hace mucho tiempo.
El uso de esta tecnologa implica que los agricultores interacten con grupos de investigacin de universidades o centros de
investigacin locales que manejen estas herramientas. Se debe promover este tipo de asocianciones, sobretodo en un mundo de de-

sarrollo tecnolgico como en el que vivimos actualmente. Este tipo

de colaboracin seguramente es el mejor camino para lograr dos
objetivos importantes: que los agricultores dispongan de variedades vegetales que respondan a sus requerimientos de produccin
y calidad, y que la investigacin local est ligada a las necesidades
de las comunidades.

Captulo 9

BIOFERTILIZANTES
Microorganismos benficos en agricultura

Elizabeth Hodson de Jaramillo

Lucia Ana Daz-Ariza

111

Introduccin, conceptos bsicos

La produccin agrcola debe realizarse en un
concepto de sostenibilidad de manera tal que sea
ecolgicamente amigable y que proporcione rentabilidad adecuada a los productores y por consiguiente
su beneficio.
La aplicacin de bioinsumos naturales en la agricultura, ecolgicamente amigables y de costo reducido es uno de los elementos fundamentales para
garantizar la sostenibilidad de la produccin agrcola
y una aplicacin sencilla de las agrobiotecnologas. Su
uso adecuado facilita incrementar los rendimientos y
reducir la contaminacin ambiental que conlleva el
uso de fertilizantes qumicos.
Los microorganismos son un grupo muy amplio y
diverso de organismos microscpicos que existen como
clulas aisladas o asociadas. En general, a diferencia de
los macro-organismos (plantas y animales), los microorganismos son capaces de realizar la totalidad de sus
procesos vitales de crecimiento, generacin de energa
y reproduccin, independientemente de otras clulas.

Los microorganismos pueden ser procariticos

(como las bacterias) o eucariticos (como los hongos).
Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, en mares, ros, aire, suelos y dentro de otros
organismos incluidas las plantas (Daz, 2011). La diversidad microbiana en el suelo es mucho mayor que la
de plantas y animales juntos. Un solo gramo de suelo
puede albergar hasta diez mil millones de microorganismos (10), los cuales pertenecen a diferentes
especies. En el suelo se pueden encontrar bacterias,
hongos, algas, protozoos y virus. Debido a su amplia
diversidad y altas poblaciones, se hace importante
el estudio de la interaccin de los microorganismos
con las plantas y el suelo (Madigan et al, 2004).
El suelo es el lugar donde se encuentra la mayor
diversidad de microorganismos particularmente en
la zona de alrededor de las races (la rizosfera), los
cuales contribuyen en conjunto en un amplio rango
de servicios esenciales para el funcionamiento y la
sostenibilidad de los ecosistemas.

Una de las alternativas que

se ha venido intensificando
en las ltimas dcadas es
el uso de productos biolgicos como los biofertilizantes que se refiere a
la utilizacin de microorganismos que favorecen el
crecimiento y estimulan la
produccin de las plantas.

112

que son capaces de tomar el nitrgeno atmosfrico y lo

convierten en amonaco y nitratos disponibles para las
plantas. Otras pueden producir metano como producto
de desecho (metanognicas).

La utilizacin de hongos que se asocian

con las races de las plantas se ha convertido desde no hace muchos aos en una
tcnica para estimular el crecimiento y la
floracin de las plantas y rboles de una
forma puramente biolgica, natural y ecolgica mediante la formacin de micorrizas.

La presencia de materia tanto orgnica como inorgnica permite la actividad de una extraordinaria
poblacin de microorganismos. Los desechos y residuos humanos, animales y vegetales son procesados
y descompuestos por los microorganismos quienes
liberan sustancias tiles para las plantas y contribuyen
a la formacin y el mantenimiento de la estructura
del suelo.
Su papel en la descomposicin de materiales es
fundamental porque con su actividad (metabolismo)
permiten los ciclos biolgicos de los elementos nutrientes requeridos por las plantas. Por ejemplo se
encuentran grupos de bacterias fijadoras de nitrgeno

Los microorganismos del suelo pueden consumir una amplia gama de materiales orgnicos como
celulosa y lignina de tejidos leosos, quitina de los
hongos y los insectos, protenas de cualquier tipo de
tejidos, carbohidratos, queratina de cabello y uas, hidrocarburos del petrleo o sus derivados, plaguicidas,
detergentes, en fin compuestos orgnicos de diversa
naturaleza (Madigan et al, 2004).

El papel de las comunidades de microorganismos

en el suelo es crtico para
el crecimiento y desarrollo adecuado de los
cultivos y los procesos
mediados por ellas son
indispensables para el funcionamiento del ecosistema del suelo (edfico) y

El papel de los microorganismos del suelo en la

nutricin y desarrollo de las plantas es muy diverso.

su productividad.

El funcionamiento de los ecosistemas est gobernado ampliamente por la dinmica de los microorganismos del suelo, debido a la enorme variedad de
procesos de los cuales son responsables. Las funciones microbianas importantes en los ecosistemas del
suelo se encuentran distribuidas entre diferentes grupos trficos e incluyen: formacin de humus mediante descomposicin de exudados y restos vegetales y
sntesis de nuevos compuestos, produccin de hormonas vegetales, facilitar la disponibilidad de algunos
nutrientes (por su capacidad de solubilizar minerales)
a partir de formas inorgnicas insolubles, transformacin del nitrgeno (N2) atmosfrico a N disponible
para las plantas, mejoramiento de la agregacin, aireacin, e infiltracin de agua en el suelo.

Los microorganismos

Tambin se encuentran en el suelo microorganismos capaces de ocasionar enfermedades (pat-

benficos del suelo

desempean un papel
muy importante para
las plantas porque al
asociarse con ellas en una
relacin mutualista (los
dos se benefician de esta
relacin), les ayudan a su
desarrollo adecuado al facilitarles la disponibilidad
de nutrientes a travs de
la descomposicin y mineralizacin de la materia
orgnica en putrefaccin.

113

genos), pero igualmente se encuentran algunos otros

que pueden presentar accin antagnica denominada control biolgico- con los nocivos mediante la
produccin de sustancias que protegen a las plantas
contra insectos, patgenos de plantas o contra malezas (Daz, 2008).
Esta actividad de los microorganismos descomponedores saprofitos- es fundamental para permitir
el reciclaje de materia orgnica fijada en las plantas
superiores, (ciclos del nitrgeno, carbono, fsforo y
azufre) funcin que realizan tanto en presencia de
aire (microorganismos aerobios), como en ausencia
de aire (microorganismos anaerobios o microaeroflicos).
Adicionalmente contribuyen a la fijacin de CO2
en ausencia de aire con produccin de metano (metanognesis), proceso de gran importancia ecolgica
por su papel en el ciclo del carbono.
Es importante recordar que algunos de estos
microorganismos pueden combinarse, resultando
en efectos sinrgicos cuando se aplican de manera
conjunta. Alrededor de un 40% de los productos de
la fotosntesis y otros compuestos vegetales pueden
ser secretados a la zona cercana a la raz (rizosfera)
lo cual sirve de alimento a los microorganismos del
suelo (Nelson, 2004).

Biofertilizantes:
Microorganismos promotores

del crecimiento vegetal

La fertilizacin es una prctica indispensable para

la produccin de cultivos, siendo la fertilizacin nitrogenada la ms importante, debido a los altos requerimientos de nitrgeno que tienen las plantas y a sus
evidentes efectos sobre el rendimiento.
El nitrgeno es un elemento que se pierde muy
rpidamente del suelo. La forma ms corrientemente
utilizada para cubrir las necesidades de nitrgeno es la
utilizacin de fertilizantes qumicos, la cual representa
una manera rpida de reponer el nitrgeno perdido
del suelo, sin embargo, bajo un manejo inadecuado
representa un riesgo ambiental por contaminacin
del suelo y del agua.
Adicionalmente tambin se debe considerar que
los fertilizantes qumicos representan altos costos
econmicos para los productores.
Bajo la consideracin de promover una agricultura sostenible as como amigable y respetuosa con el ambiente, el uso de biofertilizantes se
ha intensificado en los ltimos aos como op-

El uso de bioinsumos o

cin viable para reducir los costos econmicos

bioinoculantes se refiere

y ecolgicos que implica la utilizacin de abonos

a la utilizacin y aplicacin

qumicos. Adicionalmente los biofertilizantes han

de bacterias promotoras

mostrado su importante papel en la recupera-

del crecimiento vegetal

cin de suelos degradados o marginales.

en cultivos agrcolas y
forestales.

114

Estas bacterias se denominan genricamente

como bacterias promotoras del crecimiento
vegetal BPCV (PGPR
en ingls por sus siglas
plant growth promoting
rizobacteria). Algunos
estudios han mostrado
que la utilizacin de estas
bacterias pueden incrementar los rendimientos
de algunos cultivos (papa,
rbano, tomate, trigo y
soja entre otros) hasta
en un 30% (Bach & Daz,
2008).

Un ejemplo de sistemas
de control biolgico
natural ha sido el uso
comercial por ms de
50 aos de la bacteria
Bacillus thuringiensis para
el control de plagas tipo
insectos (principalmente
lepidpteros).

Estas bacterias aportan significativamente al crecimiento y desarrollo de las plantas por mecanismos
de accin directos o indirectos. Entre los directos se
encuentran la fijacin de nitrgeno, la sntesis de hormonas como auxinas, su capacidad de aumentar la
disponibilidad de nutrientes a travs de la solubilizacin y movilizacin de fosfato y de hierro.
Entre los mecanismos indirectos se encuentra la
proteccin frente a patgenos por interacciones de
antagonismo con otras bacterias y hongos del suelo,
la produccin de antibiticos, la liberacin de enzimas como quitinasas, pectinasas y glucanasas, adems
de la induccin de resistencia sistmica en la planta,
por lo cual se conocen como agentes de bioproteccin (Castro et al, 2007).
Desde 1978 el investigador Kloepper describi
este grupo de bacterias de vida libre como promotoras del crecimiento vegetal por su capacidad de
aumentar el crecimiento de las plantas y favorecer su
respuesta contra organismos del suelo causantes de
enfermedades.
Algunos ejemplos de BPCV son algunas bacterias del gnero Pseudomona, las cuales, al solubilizar
algunos nutrientes poco mviles del suelo, como el
fsforo, mejoran el ingreso de este elemento hacia la
planta, lo que se traduce en una mayor cantidad de
biomasa.
Otras especies, las fijadoras de nitrgeno como
Rhizobium sp. y Bradyrhizobium sp., aumentan el aporte de nitrgeno, influyendo directamente en el crecimiento, desarrollo y rendimiento.

Se ha encontrado tambin que algunos microorganismos producen compuestos capaces de funcionar como antagnicos de microorganismos perjudiciales, lo que permite mejor crecimiento y desarrollo
vegetal al estar las plantas libres de patgenos.
Para considerar a una bacteria de la rizosfera
como BPCV bacterias promotoras del crecimiento
vegetal- deben cumplirse varias caractersticas:
1- que tengan capacidad de colonizacin efectiva
y eficiente en la superficie de la raz y por consiguiente de permanecer en la rizosfera y realizar
su funcin benfica en las plantas
2- que sea capaz de presentar una alta poblacin
en la rizosfera despus de su inoculacin
3- que tenga potencial para controlar microorganismos fitopatgenos del suelo (causantes de
enfermedades)
4- que sean innocuas tanto para las plantas como
para el ser humano y los animales domsticos
Entre los gneros ms conocidos de rizobacterias
promotoras del crecimiento vegetal BPCV- por sus
efectos beneficiosos para las plantas se encuentran
Burkholderia, Pseudomonas, Azospirillum, Herbaspirillum, Acetobacter, Rhizobium, Bradyrhizobium, Azotobacter, Bacillus, Klebsiella, Enterobacter, Pantoea y Serratia, y
las cianobacterias Anabena y Nostoc.
Tambin se han descrito un gran nmero de especies bacterianas adicionales a las mencionadas que
son capaces de producir precursores de auxinas bajo
condiciones in vitro.

115

Algunas especies de los gneros Pseudomonas, Azospirillum,

Azotobacter y Bacillus favorecen el crecimiento de la planta, mediante la produccin de AIA, giberelina y citoquininas (hormonas
vegetales) en la rizosfera de las plantas cuando stas estn en estado de plntulas. Como ejemplo,Torres et al., (2000) encontraron

Las bacterias fijadoras de nitrgeno se inoculan en la semilla para

que la planta entre en contacto con ellas desde su germinacin. Su uso
adecuado ha mostrado que puede reducir notablemente los requerimientos de fertilizante nitrogenado comercial e inclusive se utilizan
para fitorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos.

que bacterias pertenecientes a las especies: Azotobacter chrooccum,

A. vinelandii, P. putida, Serratia spp. y K. pneumoniae, aisladas de la
rizosfera de arroz en Colombia fueron capaces de producir AIA
en concentraciones que van de 3,5 mg/L a 32 mg/L.

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV) se

destacan por sus efectos beneficiosos tanto para las plantas como
para los ecosistemas.
La funcin que las rizobacterias benficas cumplen se debe a
diversos mecanismos entre los cuales se encuentran:
Produccin de compuestos tipo reguladores de crecimiento vegetal: Se conocen varias bacterias asociativas con capacidad
de producir fitohormonas como auxinas, giberelinas y citoquininas.
Estas sustancias son capaces de estimular la germinacin, el crecimiento, la produccin de races laterales, as como la cantidad
y longitud de los pelos radiculares lo cual facilita e incrementa la
absorcin de agua y de nutrientes para las plantas y les permite
crecer ms vigorosas y fuertes.
La fijacin biolgica de nitrgeno la cual puede realizarse
mediante asociaciones simbiticas como es el caso de las leguminosas (frijol, soya, man, habas y otros) con bacterias del gnero
Rhizobium y Bradyrhizobium, o bacterias de vida libre que se asocian
con las races de varias plantas como es el caso de las bacterias de
los gneros Azospirillum, Azotobacter, Gluconacetobacter, Beijerinkia,
Burkholderia, Frankia entre otras.

En trminos generales es muy importante conocer las condiciones especficas del cultivo, el suelo, el clima y el manejo
para obtener el mximo beneficio en trminos de ahorro en
la aplicacin del fertilizante nitrogenado, rendimiento rentable
y conservacin de la capacidad productiva del suelo.
Produccin de sustancias que facilitan la disponibilidad de
nutrientes tales como cidos orgnicos, enzimas, aminocidos que
pueden movilizar o solubilizar compuestos insolubles como el fsforo, el hierro, el aluminio entre otros.
Un ejemplo son las bacterias solubilizadoras de fsforo que facilitan
que este elemento se encuentre disponible para las plantas. Se utilizan
cuando las semillas se siembran en suelos cidos o alcalinos de pH 5
a pH 8, lo cual ocasiona que los fosfatos no se encuentren disponibles
para las plantas, las cuales pueden presentar carencia o insuficiencia
de este elemento. Si el suelo carece de suficiente fosfato disponible o
mvil, se recomienda la inoculacin de los microorganismos solubilizadores de fsforo a la siembra de la semilla.
Representantes de bacterias de que cumplen esta funcin son
las de los gneros Bacillus spp, Arthrobacter spp, Azotobacter spp entre otros. Debe destacarse que el grupo ms conocido para resolver el problema de movilidad de fosfatos en el suelo son los
hongos que forman micorrizas en las races de las plantas, tipo ecto
como endotrofico.

116

Produccin de siderforos que son sustancias que

presentan alta afinidad por el hierro. Son compuestos
quelantes del hierro que por diversas acciones pueden
suministrar hierro en forma disponible para las plantas,
as como promover el crecimiento vegetal y restringir el
crecimiento de organismos del suelo patgenos para las
plantas, principalmente por inmovilizar el hierro requerido por los patgenos.
- Por ejemplo en el caso de Pseudomona fluorescens cepa ZUM80 se encontr que su presencia poda inhibir el crecimiento de algunas
cepas de Colletotrichum y Phytophtora
Produccin de sustancias antibiticas. Muchos
microorganismos del suelo son capaces de elaborar
compuestos que son antibiticos para organismos
nocivos (patgenos).
Estmulo de proteccin de las plantas contra
agentes perjudiciales. Muchas plantas activan sus mecanismos de defensa interna contra enfermedades
estimuladas por las sustancias secretadas por los microorganismos del suelo.

Utilizacin de biofertilizantes

como bioinsumo en la agricultura

sostenible

Las plantas, de la misma manera que los animales,

necesitan asociarse con bacterias benficas que les
facilitan la asimilacin de alimentos a travs de enzimas, vitaminas o minerales.

Estas asociaciones microbianas posibilitan mejoras en el crecimiento y produccin de las plantas, as

como mayor tolerancia a condiciones adversas como
plagas y enfermedades o situaciones climticas tales
como sequa o salinidad.
La inoculacin con bacterias beneficiosas se realiza desde finales del siglo XIX en los Estados Unidos,
donde iniciaron la mezcla de suelo inoculado en forma natural con semillas de leguminosas. Fue entonces
cuando se patentaron y se desarrollaron comercialmente inoculantes para leguminosas con cepas de
bacterias del gnero Rhizobium, las cuales se asocian
con leguminosas como frijol, soya, habas, porotos entre otras. Posteriormente se comercializaron productos con cepas de Bacillus, Azotobacter y Pseudomonas,
bacterias encontradas comnmente en el suelo.
El uso comercial de las bacterias promotoras del
crecimiento vegetal (PGPR) se encuentra en desarrollo
y en Amrica Latina se encuentran varias compaas
que tienen en el mercado bioinsumos de este tipo.
En relacin con los inoculantes que estimulan el
crecimiento, se han formulado diversos productos, la
mayora a base de bacterias y hongos, los ms conocidos son las bacterias fijadoras de nitrgeno que
hacen disponible el nitrgeno atmosfrico, tambin
aquellas que facilitan la asimilacin del fsforo por
parte de las plantas.
Segn Bach & Daz (2008) en la Argentina se encuentra una amplia variedad de inoculantes de uso
agrcola entre los que se encuentran: DIMARGON
(Azotobacter sp.); BIOFERT (Rhizobium phaseoli);

Actualmente se encuentran dos tipos de

inoculantes: los que tienen
como objetivo fundamental la promocin y estmulo del crecimiento de
las plantas y los utilizados
como sistemas de control
biolgico (bioplaguicidas,
que se utilizan para el
control de enfermedades).

117

AZOSPIRILLUM (Azospirillum brasilense) AZOFER (Bradyrizobium

sp.), AZOFER (Rhizobium sp.) y AZOFER (Azospirillum sp.); FOSFORINA (Pseudomonas sp.). Muchos de estos productos se comercializan en el exterior y aunque los buenos resultados aun
son iniciales, han demostrado su efectividad en otras regiones y
condiciones de suelo y clima (edafoclimticas).
Bach y Daz (2008) mencionan a modo de ejemplo el desarrollo de biofertilizantes en un esfuerzo conjunto entre el Instituto de Suelos y la empresa RIZOBACTER ARGENTINA S.A. Los
productos se obtienen a partir de cultivos de la bacteria Pseudomonas fluorescens, que ha mostrado su capacidad de estimular el
crecimiento vegetal y solubilizar el fsforo hacindolo ms disponible para las plantas. Estos biofertilizantes se comercializan con
el nombre de Rizofos Liq. Trigo y Rizofos Liq. Maz, con destino al
mercado argentino y pases del MERCOSUR.

A pesar del enorme impacto benfico que puede presentar el uso de biofertilizantes, an es muy insuficiente el nivel
de conocimientos sobre las poblaciones microbianas asociadas
a las races de los cultivos, y no se conoce suficientemente sobe
los factores que inciden en la interaccin plantabacteria, razn que explica los resultados variables que se han obtenido
con la aplicacin de bioinsumos. Es necesario profundizar los
estudios sobre los requerimientos nutricionales y las condiciones
fisicoqumicas de los microorganismos del suelo, as como de sus
complejas interacciones, puesto que al presente solamente se
puede cultivar en el laboratorio un porcentaje muy bajo de esta
variadsima microflora.
Aunque en condiciones de laboratorio y de invernadero se ha
demostrado claramente el efecto en promocin del crecimiento
vegetal y en control de patgenos de las BPCV, los resultados en

campo han sido menos consistentes, lo cual representa un reto

en el estudio evaluacin, formulacin y aplicacin del potencial de
estas rizobacterias como inoculantes comerciales. Los mayores
avances y buenos resultados en campo han sido con los inoculantes de leguminosas tipo Rhizobium, los cuales llevan en el mercado
comercial ms de siete dcadas (Nelson 2004).
Para obtener los mejores resultados del potencial de los microorganismos promotores de crecimiento vegetal, es necesario
realizar estudios de caracterizacin de los microorganismos nativos en el sitio, sobre las condiciones especficas del entorno y
sobre el efecto en los cultivos de inters en cada localidad en
donde se vaya a utilizar la aplicacin de biofertilizantes.

Es fundamental conocer la diversidad de microorganismos y

realizar una evaluacin de su potencial para promover el crecimiento y desarrollo del cultivo en cuestin. La aplicacin de mtodos
moleculares ha facilitado en gran medida esta caracterizacin en
muchos casos porque ya se han identificado algunos genes especficos que facilitan la colonizacin de las races de las plantas (ver
capitulo de Marcadores moleculares).
La investigadora Gina Holgun-Zehfuss (2008) describe muy
grficamente la interaccin microorganismo-planta:
...Es claro que las bacterias y plantas, antes de prometerse
amor eterno, se cortejan; slo si la relacin es mutuamente
benfica trasciende, forjndose de mecanismos de reconocimiento y colaboracin mutua. Algn da conoceremos tan
bien el lenguaje bacteria-planta que sabremos cmo convencerlas de asociarse y ayudarse...

118

En resumen, entre las mltiples ventajas de utilizar

biofertilizantes en la produccin vegetal las ms destacadas son: su beneficio ecolgico por ser respetuosas
con el ambiente al tratarse de productos naturales que
no son contaminantes; sus efectos positivos como estimulantes del crecimiento y produccin vegetal; su menor costo comparado con el de los insumos qumicos; el
mantenimiento del suelo productivo; su inocuidad para
la salud humana y animal. Es decir promueven el desarrollo sostenible y el bienestar para los agricultores con
rendimientos rentables.
Uno de los mayores retos en el desarrollo comercial de BPCV es asegurar que se cuenta con metodologas efectivas de evaluacin y de seleccin y tamizaje que permitan identificar los microorganismos
ms promisorios con actividad biolgica demostrada.
En la industria agroqumica se evalan anualmente
miles de compuestos para seleccionar solamente uno
o dos al final de los estudios. Igualmente se requiere
de este tipo de estudios para los microorganismos
considerados como biofertilizantes potenciales.
Investigadores de la Universidad de la Habana y
del Instituto Nacional de Ciencias Agrcolas INCA
(Cuba) han venido desarrollado metodologas que
de acuerdo con los resultados que informan, permiten aislamiento, identificacin y evaluacin rpida
de PGPB de los gneros Burkholderia, Pseudomonas,
Azospirillum, Herbaspirillum, Acetobacter, Rhizobium,
Bradyrhizobium y Azotobacter, a travs del uso de
tcnicas inmunoqumicas y de biologa molecular

Desarrollo de bioinoculantes
(biofertilizantes)
El procedimiento general a seguir para la seleccin y definicin de cepas microbianas a ser utilizadas
como biofertilizante implica:
1. Caracterizacin inicial de los microorganismos
(microflora) de la rizosfera y del interior endfita- de la planta en cuestin en la zona de
estudio.
2. Aislamiento y caracterizacin de los organismos promotores del crecimiento vegetal
3. Ensayos de inoculacin de las cepas en las plantas de inters (estudio de la interaccin plantamicroorganismo) y evaluacin de su potencial
para favorecer el crecimiento vegetal.

Para recordar.
Los biofertilizantes, o

4. Seleccin de las cepas ms promisorias y multiplicacin en medios de cultivo adecuados y de

bajo costo para obtencin del bioinsumo

abonos biolgicos, estn

5. Evaluacin de inoculacin en plantas de inters

y estudio de la respuesta

benefician la nutricin y el

Desarrollo a mayor escala del bioinoculante (formulacin de acuerdo con estabilidad, soportes inertes requeridos, viabilidad, definicin del mejor sistema de inculo, efectividad entre otros).

basados en microorganismos que promueven y

crecimiento de las plantas.
Se trata de microorganismos del suelo, generalmente hongos y bacterias,
que se asocian de manera
natural a las races de las
plantas de una forma ms
o menos ntima.

119

Ejemplo de caso
Aplicacin en vivero de bioinoculantes
basados en microorganismos nativos

Los bioinoculantes son productos cuyo principio activo son

microorganismos vivos (bacterias y/o hongos), no patgenos de
humanos, animales o plantas, que favorecen la nutricin y/o el desarrollo de las plantas, permitiendo as un mejor aprovechamiento de los recursos naturales del suelo y del ambiente (BIOFAG,
2008). Los microorganismos que hacen parte del principio activo
de algunos inoculantes fijan nitrgeno, solubilizan fsforo, producen siderforos solubilizando hierro, entre otras actividades. Estos,
deben ser llevados a las plantas con ayuda de un portador que
mejore su establecimiento en el suelo o en la rizosfera y asegure
su accin benfica.
Los microorganismos benficos del suelo se asocian de manera natural con diferentes especies forestales y constituyen una
alternativa ecolgicamente amigable al uso de insumos qumicos
durante su propagacin. Se han desarrollado tcnicas para la determinacin, aislamiento, identificacin, multiplicacin e inoculacin de
microorganismos asociados con algunas de especies forestales. La
Unidad de Biotecnologa Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia en su Laboratorio de Asociaciones PlantaSuelo-Microorganismo ha trabajado en la valoracin de la participacin de microorganismos del sistema suelo-raz en el reciclaje de
nutrientes y la determinacin del potencial biotecnolgico de esos
microorganismos como bioinsumos en la propagacin de plantas
de inters agroecolgico para regiones especficas. Las bacterias
promotoras del crecimiento vegetal pueden presentarse en sistemas radicales micorrizados, lo cual es la asociacin ideal. Dentro
de los principales beneficios de la micorriza estn la reduccin del
tiempo de manejo en vivero y el establecimiento exitoso en campo
de las especies forestales, atribuidos a mayores valores en altura

y biomasa de las plantas micorrizadas. En trminos generales, los

trabajos tienen como objetivo determinar la presencia y caracterizar los microorganismos benficos asociados naturalmente con las
especies de inters y establecer sistemas iniciales de propagacin,
inoculacin y manejo de estos microorganismos en la produccin
en vivero de plantas de las especies en estudio (Daz, 2008).

Estudios con micorrizas

en el Laboratorio de
Asociaciones Planta-SueloMicroorganismo, Unidad
de Biotecnologa Vegetal,
Pontificia Universidad Javeriana (Daz et al, 2010)

Se ha trabajado en estudios con fines biotecnolgicos, de la asociacin natural de hongos de micorriza arbuscular y bacterias promotoras de crecimiento vegetal con Tectona grandis, Decussocarpus
rospigliosii, Cedrela montana, Myrica pubescens y M. parvifolia, Cordia
alliodora,Tabebuia rosea y Guadua angustifolia. Complementariamente,
se han desarrollado diferentes trabajos de reintroduccin de estos
microorganismos en el sistema suelo-raz de la especie hospedera
con resultados promisorios para Cedrela montana, Cordia alliodora,
Tabebuia rosea, Gmelina arborea, Maclura tinctoria y Tectona grandis.
Las alternativas biotecnolgicas desarrolladas en los estudios realizados incluyen el uso de hongos de micorriza arbuscular (HMA) y
de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (BPCV) asociados
naturalmente con las especies en estudio (Castro et al, 2007; Daz et
al, 2011; Zambrano & Daz, 2008).

120

El uso de las cepas nativas que los estudios muestren como

ms eficientes ha mostrado ser importante en la respuesta de las
plantas y en la adaptabilidad de los microorganismos al suelo. Es
importante desarrollar sistemas de cultivo de bajo costo para la
multiplicacin de los microorganismos a ser utilizados como bioinsumo. De otra manera se corre el riesgo de no obtener los beneficios potenciales por desconocimiento de las
condiciones adecuadas para cada caso.
Halos de solubilizacin de Fsforo inorgnico de una bacteria fosfato solubilizadora, en dos
diferentes medios que contienen fosfato
triclcico como fuente de P. Fuente:
Laboratorio Asociaciones PlantaSuelo-Microorganismo, Unidad de
Biotecnologa Vegetal, Pontificia Universidad Javeriana (Daz et al, 2010)

Muestreos

y aislamientos de los microorganismos de inters segn la actividad biolgica

(Daz et al., 2011)

Lo primero que se debe definir es qu tipo de microorganismo

se desea estudiar teniendo como criterios su actividad biolgica y
la asociacin con una planta determinada. Se recomienda que los
aislamientos de las bacterias se realicen de la misma zona del cultivo a inocular o de la rizosfera de esta planta. Actualmente tambin
se estudian microorganismos que crecen en el interior de diferentes tejidos vegetales, denominados endfitos. El objetivo de la
utilizacin de bacterias nativas es la bio-aumentacin (aumento de
poblaciones naturales) de las mismas y su reintroduccin al sistema
suelo-raz de las plantas. Los muestreos se realizan a nivel de rizosfera, races, tallos y hojas, y para la seleccin de los microorganismos
se tiene en cuenta su manejo con tcnicas cultivo-dependientes,

pruebas de antagonismo entre ellas y con otros microorganismos

benficos asociados a la planta, patogenicidad para la planta y actividad biolgica especifica.
Evaluacin de actividad biolgica de microorganismos benficos: Determinacin del potencial promotor de crecimiento de los
aislamientos segn cada grupo funcional (Daz et al, 2011)
Bacterias solubilizadoras de fsforo inorgnico: La solubilizacin de fsforo se evala
inicialmente en medio definido para este fin
(SMRS) y la cepas que cambien el color del
medio de morado a amarillo se evalan en
el medio slido Pikovskaya, midiendo el halo
de solubilizacin que se presenta alrededor
de las colonias.

Bacterias fijadoras de nitrgeno: Para establecer si una bacteria es fijadora de nitrgeno se evala la presencia de una pelcula
blanca en el medio NFB, posteriormente se
realiza en un cromatgrafo de gases un anlisis de reduccin de acetileno para determinar el potencial de fijacin de nitrgeno
por parte de la bacteria.
Bacterias productoras de siderforos:
En el medio de cultivo KB se evala la produccin de fluorescencia por parte de las
bacterias, posteriormente estas bacterias se
evalan en otros medios para determinar la
produccin y el tipo de siderforos que producen.

121

Controladores biolgicos: Para evaluar
el potencial como controladores biolgicos
de las bacterias, estas se enfrentan ante un
hongo fitopatgeno (en este caso Fusarium
oxysporum) en medios de cultivo a nivel de
laboratorio, y se determina el porcentaje de
inhibicin de crecimiento del hongo

REQUISITOS TCNICOS PARA EL REGISTRO

DE BIOINOCULANTES (BIOFAG, 2008)
Debern estar formulados con cepas autorizadas y suministradas por la Institucin de Referencia IR.
Es recomendable que estn libres de contaminantes.
La concentracin de microorganismos en los inoculantes
prontos para su comercializacin, deber cumplir con las
exigencias definidas por la IR.
El producto debe especificar los cultivos vegetales a los
cuales est destinado.
Se sugiere proporcionar informacin sobre condiciones
de uso y manejo del inoculante y sobre la susceptibilidad/
resistencia del microorganismo utilizado a agroqumicos
usados comnmente en la proteccin de la semilla.
En un trabajo con Gmelina arborea, (Zambrano & Daz, 2008) se
plante la inoculacin de bacterias rizosfricas promotoras de crecimiento vegetal (BPCV) y de hongos de micorriza arbuscular (HMA).

Pasos iniciales en el laboratorio para el desarrollo de un bioinoculante (Daz et al, 2010)

Se trabaj con Glomus sp para la asociacin micorrizal y con la

bacteria Azospirillum brasilense por su capacidad de incrementar la
emergencia de las semillas. Ambos microorganismos son de amplia
distribucin en diferentes suelos y se han encontrado asociados
con gran variedad de especies vegetales. Se realiz la inoculacin
de Azospirillum brasilense inmovilizado en microperlas de alginato
y de los hongos Glomus manihotis y Glomus occultum en semillas
de Gmelina arborea en tres grados diferentes de madurez. Las semillas inoculadas se sembraron en suelo y en turba compactada.
Cuarenta y un das despus de la siembra se determin el efecto
de los sistemas de siembra y de los microorganismos sobre la germinacin. Cuarenta y siete das despus del transplante a bolsa se
determinaron las variables de micorrizacin y altura de las plantas.
Los resultados mostraron que el sustrato de siembra y la inocu-

122

lacin de A. brasilense influyeron en la germinacin

de las semillas de G. arborea. Se present correlacin
positiva entre micorrizacin y la altura de las plantas
durante el establecimiento en vivero. Adems se present un efecto favorable sinrgico- de los microorganismos sobre la micorrizacin.
Para estudios con teca, un rbol maderable tropical, (Daz et al, 2010) se caracteriz el suelo de la
plantacin y se utilizaron tcnicas cultivo descritas
para aislar BPCV. Para el anlisis de micorrizacin se
evalu colonizacin en races y se cuantific el micelio externo, la glomalina y las esporas en suelo. Los
mejores aislamientos de BPCV y los HMA propagados en suelos de la plantacin, se inocularon sobre
miniestacas de teca para evaluar su efecto sobre el
crecimiento de la planta y sobre la micorrizacin.
Las bacterias aisladas presentaron actividades de
promocin del crecimiento vegetal como fijadoras
de nitrgeno, productoras de auxinas, solubilizadoras
de fsforo y de hierro. Se obtuvieron 528 aislamientos bacterianos de morfotipos diferentes, el grupo
funcional con mayor nmero de aislamientos fue el
de fijadores de nitrgeno, con 239 aislamientos y la
mejor fuente, el suelo (293 en total). En vivero el
mejor comportamiento lo presentaron bacterias solubilizadoras de fsforo y las productoras de auxinas.

Ensayo de enraizamiento empleado

microorganismos benficos de suelo
Evaluacin de inoculacin
- Laboratorio de Asociaciones Planta-SueloMicroorganismo, Unidad
de Biotecnologa Vegetal,
Pontificia Universidad
Javeriana (Daz et al, 2010)
Inoculacin de
microorganismos

Siembra en turba bajo

cmara hmeda
Enraizamiento
luego de 13 das

123

BIOINOCULANTES PARA CULTIVOS

Productos elaborados con base en una o ms cepas de microorganismos benficos que, al aplicarse al suelo, races o semillas, promueven
el crecimiento vegetal y favorecen la disponibilidad y movilidad de
nutrientes hacia la planta en asociacin con micorrizas.
(RED BIOFAG-CYTED, 2008).

Esquema de microorganismos benficos para las plantas

(biofertilizantes)

Captulo 10

CONSERVACIN In vitro
DE LOS RECURSOS GENTICOS VEGETALES

Ana Abdelnour Esquivel

127

Introduccin
La prdida de la diversidad gentica, especialmente los acervos
genticos de las especies cultivadas, puede considerarse uno de
los principales problemas ambientales que enfrenta la humanidad.
Tomando en cuenta que los altos rendimientos en la agricultura
dependern de la disponibilidad de una fuente adecuada de mate-

Mtodos de conservacin

Para facilitar su estudio y comprensin, los mtodos de conservacin se dividen en dos grandes categoras:
In situ
Ex situ
Conservacin in situ
Es la conservacin de la diversidad vegetal en su hbitat natural,
bosques, selvas, praderas, costas, etc. Se considera el mtodo ideal
de conservacin, ya que el recurso se mantiene coexistiendo con
otros organismos en su ambiente natural. Sin embargo, la presin
por la tierra, tanto para agricultura como para urbanizar, los cambios en las polticas gubernamentales y los desastres naturales aten-

riales genticos para el mejoramiento, el acceso continuo y seguro

a los recursos fitogenticos deber garantizarse. Por lo anterior,
el desarrollo de mtodos cada vez ms seguros y eficientes de
conservacin es una prioridad y la biotecnologa tiene mucho que
ofrecer en este campo.

tan contra la seguridad de estos materiales. Como resultado de las

diferentes experiencias se seala que, para garantizar la existencia
del recurso, se requiere de otros mtodos de conservacin.
Conservacin ex situ
Es la conservacin de los recursos fuera de su hbitat natural, por
ejemplo, los materiales se mantienen como colecciones en huertos,
fincas de agricultores, fincas experimentales, bancos de semillas, etc.
Dentro de esta categora, el mtodo de conservacin a utilizar
depender del tipo de semilla que presenta la especie de inters.
Por lo anterior, las especies se clasifican dependiendo del su comportamiento de sus semillas durante el almacenamiento.

128

Clasificacin de las especies con relacin al comportamiento de

sus semillas durante el almacenamiento (Roberts, 1973)
Especies con semillas ortodoxas: sus semillas resisten la desecacin hasta contenidos bajos de humedad (5% de contenido
de agua o menos) y su viabilidad se prolonga por dcadas y an
siglos, si se almacenan a baja temperatura (5C a 20C) y baja
humedad relativa. Especies como el maz (Zea mais), chile, arroz
(Oriza sativa), trigo (Triticum aestivum) y muchas otras se incluyen
en esta categora.
Especies con semillas recalcitrantes: se caracterizan porque
presentan alto contenido de humedad a la hora de la cosecha. No
resisten alto grado de desecacin, ni el almacenamiento a bajas
temperaturas. Cuando se almacenan bajo condiciones de alta humedad y temperaturas clidas, permanecen viables solamente por
pocas semanas o meses. Muchas especies tropicales como el cacao
(Theobroma cacao), aguacate (Persea americana), palmas, chayote
(Sechium edule), mango (Mangifera indica) y coco (Cocus nucifera)
entre otras, son clasificadas como recalcitrantes.

Dentro de esta categora se incluyen tambin todas aquellas

especies propagadas vegetativamente y aquellas producidas en el
laboratorio utilizando las tcnicas del cultivo de tejidos o cultivo In
vitro. Una caracterstica de los cultivos propagados vegetativamente
es que, tanto el agricultor como el ambiente, a travs de los siglos,
han venido seleccionando genes y combinaciones allicas especficas que han mantenido su viabilidad gracias a la reproduccin
vegetativa. Estas especies son estriles o no tienen una reproduccin sexual estable, por lo que la semilla no es importante para la
conservacin de la especie. Ejemplos de este tipo de especies son
papa (Solanum tuberosum), bananos y pltanos (Musa spp), yuca
(Manihot esculenta), ame (Dioscoria spp), tiquizque (Xanthosoma
sagittifolium), etc. (Villalobos y Engelmann, 1995).
Especies con semillas intermedias: Resisten alto grado de
desecacin, pero no resisten el almacenamiento a bajas temperaturas. Se sealan especies como el caf y la papaya dentro de esta
categora (Ellis y colaboradores, 1990). Sin embargo, las semillas
de muchas especies tropicales tambin presentan este comportamiento.

Mtodos de conservacin ex situ

Como ya se mencion, se cuenta con varios mtodos para la
conservacin ex situ de los recursos fitogenticos, que son:
los bancos de semillas
las colecciones de campo
conservacin In vitro, que comprende las tcnicas ms recientemente desarrolladas y se basan en el cultivo de tejidos.

deshidratadas hasta bajos contenidos de humedad se almacenan a

bajas temperaturas (5C a 20C) y baja humedad relativa. Este
material puede permanecer almacenado por largos periodos sin
que sufra grandes prdidas de viabilidad (Villalobos y Engelmann,
1995).
Para que una especie se considere ortodoxa debe cumplir ciertas reglas generales durante el almacenamiento:

Bancos de semillas
Es el mtodo ms recomendado para el almacenamiento de
especies que presentan semillas ortodoxas. Por lo tanto, las semillas

1. Por cada 1% de disminucin en el contenido de humedad de

las semillas, la viabilidad durante el almacenamiento se duplica.

129

2. Por cada 10oF (5.6 oC) de disminucin en la temperatura de

almacenamiento, se duplica la vida de las semillas.
3. La suma aritmtica de T (oF) y el % de HR no puede ser
mayor a 100, y la temperatura no puede ser mayor que la mitad
del resultado de ese suma.
Clculo del contenido de humedad de las semillas (%H)
% H = Peso fresco semillas Peso seco x 100

Peso fresco
Condiciones ideales para el almacenamiento en bancos de semillas:
Cuartos con temperatura y humedad controladas (12C a
-20 C)
Ejemplo: Laboratorio Nacional de Semillas, Fort Collins Colorado, EEUU: Cuartos 4oC a 12oC, humedad relativa no mayor a
35%.
Envases de almacenamiento
Frascos de vidrio (1/4 de litro) hermticamente cerrados, bolsas de papel aluminio selladas).
Es importante controlar el contenido de humedad durante el
almacenamiento, ya que si el contenido es alto (> 30%) las semillas
podran germinar. Si el contenido de humedad es intermedio (18 30%) ocurre un rpido deterioro por microorganismos e insectos
que trae la semilla del campo, como Altenaria, Helminthosporuim
y Fusaruim, o microorganismos que infectan durante el almacenamiento como Aspergillus y Penicillium. Por otra parte, si el contenido
de humedad es bajo, las semillas se vuelven inmunes a hongos e
insectos (si se almacenan a baja H.R).

Colecciones de campo
Hasta hace pocos aos, se consideraba como el nico mtodo
disponible para la conservacin de especies con semillas recalcitrantes, intermedias y propagadas vegetativamente. Es una opcin vlida
para el mantenimiento de colecciones valiosas y permite adems de
la conservacin, el estudio de los materiales, por lo que se convierte
en una muestra importante para trabajos de mejoramiento y evaluaciones. Sin embargo, resultan bastante costosas de mantener por
los requerimientos de terreno (en especies arbreas se recomienda
de 3 a 5 especmenes/accesin) y pueden presentar prdida de heterocigocidad (por el bajo nmero de especmenes), el alto costo
en insumos que demandan y por lo general, el bajo retorno por la
comercializacin de la cosecha y el personal involucrado. La mayor
desventaja de estas colecciones es que no aseguran el mantenimiento de los materiales a largo plazo, ya que estn expuestas a plagas, enfermedades y desastres naturales, como sequas, inundaciones, fuego,
etc. y debido a que estn fuera de su habitad natural, algunas veces
las condiciones no son favorables para su crecimiento (Engelmann
2000). Por ltimo, estas colecciones estn sujetas a cambios en polticas institucionales y gubernamentales que pueden atentar contra su
permanencia (Abdelnour, 1999).

Conservacin In vitro
El desarrollo de las tcnicas del cultivo In vitro, tambin conocidas como cultivo de tejidos, abri nuevas posibilidades para la
conservacin de los recursos genticos vegetales, especialmente
para la conservacin de especies consideradas problemticas para
el almacenamiento, es decir, las especies clasificadas como recalcitrantes y las propagadas vegetativamente.
Esta modalidad de conservacin ofrece muchas ventajas; el almacenamiento de un gran nmero de especies y accesiones se

130

realiza en un espacio relativamente pequeo, se elimina el riesgo de

ataques de plagas y enfermedades, para especies con un ciclo corto
es posible extender el periodo entre transferencias y se reducen
los costos de labor y mantenimiento.
Las tcnicas del cultivo In vitro ofrecen dos modalidades de conservacin y almacenamiento:
La conservacin a corto o mediano plazo, que utiliza procedimientos tendientes a reducir o retardar el crecimiento.
La conservacin a largo plazo o crioconservacin, que utiliza
el congelamiento a ultra bajas temperaturas para detener el crecimiento.
Conservacin In vitro a corto y mediano plazo
Los materiales que crecen bajo condiciones normales de cultivo
de tejidos, es decir, bajo condiciones aspticas en presencia de su
dieta ptima de nutrientes, vitaminas y reguladores de crecimiento
y bajo condiciones de alta iluminacin y temperatura adecuada, se
caracterizan por su alta tasa de crecimiento. Por lo tanto, el objetivo de las tcnicas de conservacin In vitro es extender el periodo
de subcultivo de la especie, lo que reduce considerablemente los
insumos, el tiempo que debe dedicar el personar del laboratorio a
estas labores y el espacio requerido, si se compara con el mtodo
de conservacin en colecciones de campo. Tambin presenta otras
ventajas muy valiosas como son que los materiales se mantienen
bajo condiciones estriles, en un ambiente controlado (libre de
plagas y cambios climticos) y las plantas pueden ser rpidamente
propagadas cuando se requiera. La desventaja de esta modalidad
de conservacin es su costo, ya que demanda infraestructura y
equipo especializado y la estabilidad gentica de cultivos debe ser
analizada peridicamente (Engelmann, 1997). Sin embargo, muchos
institutos y centros de investigacin, escuelas tcnicas y universida-

des cuentan con este tipo de laboratorio, por lo que contar con la
infraestructura adecuada no sera un problema para implementar
las tcnicas.
Otro punto a considerar cuando se utiliza esta modalidad de
conservacin es que a pesar de que los riesgos de prdida se reducen al permanecer bajo condiciones aspticas, siempre existe
incertidumbre durante el proceso de subcultivo y la estabilidad
gentica del material as conservado, deber monitorearse regularmente (Engelmann 1991).
Las tcnicas que se utilizan para reducir el crecimiento del material vegetal incluyen:
Modificacin de las condiciones fsicas en las que crece el
cultivo, por ejemplo, reduccin de la temperatura, reduccin de la
luminosidad y cambios en el ambiente gaseoso.
La reduccin de la temperatura ha sido uno de los recursos
ms utilizados para disminuir el crecimiento de los cultivos. La mayora de los cultivos In vitro son mantenidos a temperaturas entre 20C y 30C; a temperaturas ms bajas la tasa de crecimiento
disminuye. Sin embargo, la temperatura utilizada para lograr este
objetivo depender de la sensibilidad de la especie de inters a las
bajas temperaturas.
Modificacin en las condiciones qumicas en las que crece el
cultivo, por ejemplo, en la composicin del medio de cultivo. Adicin de inhibidores osmticos o de crecimiento, la deshidratacin
de tejidos, la modificacin y combinaciones de stos en la composicin del medio de cultivo, por ejemplo, cambios en la relacin
carbohidratos y componentes minerales del medio pueden tener
efectos sobre las tasas de crecimiento y la morfognesis en los
cultivos In vitro. Cambios en la concentracin de sacarosa tambin
es una estrategia utilizada. Cuando la reduccin del crecimiento

131

es causada por la concentracin osmtica del medio, es decir, por

la adicin de altas concentraciones de sacarosa (azcar altamente
metabolizable por las plantas), u otros agentes osmticos difciles
de metabolizar como el manitol y el sorbitol, es posible que la limitacin del crecimiento se deba a la reduccin de la absorcin de
agua y nutrientes del medio (Roca y Mroginski, 1991).
En chayote (Sechium edule, Cucurbitaceae), la modalidad de
conservacin In vitro a mediano plazo fue examinada. Para ello se
determin la supervivencia de los brotes despus de la adicin de
altas concentraciones de sacarosa (0, 30, 50, 60, 70 y 80 g/l) y cido
acetil saliclico (10-9, 10-6 y 10-3 M) al medio de cultivo, de disminuciones en la temperatura de crecimiento (16, 18, 20, 22 y 25C)
y combinaciones de estos factores. Se encontr que los brotes
mantuvieron altos porcentajes de viabilidad despus de ser conservados durante seis meses en los tratamientos evaluados. Debido a
la menor longitud, la apariencia ms vigorosa y a la coloracin ms
verde que presentaron las plntulas, se consider que el mejor
tratamiento fue la adicin de 60 g/l de sacarosa al medio de cultivo
combinado con la incubacin a 16C (Alvarenga et al., 2007).
Varios investigadores han utilizado cambios en la concentracin
de los reguladores de crecimiento en el medio de cultivo, principalmente reduccin en la de las citocininas Tambin se han incorporado al medio de cultivo del crecimiento como el cido abscsico
(ABA), el cloruro de fosfonio o clorfosfonio (Pospon-D), la hidracida malica o daminazida (B995), el cicocel o 2-cloroetil-cloruro de
trimetil (CCC), el cido acetil saliclico (ASA) entre otros.
Como resultado de aos de experiencia en este campo, recientemente se ha recomendado evitar la adicin de reguladores de
crecimiento (si el cultivo lo permite), retardadores de crecimiento y
retardadores osmticos como el manitol y el sorbitol para reducir o
evitar la aparicin de variantes somaclonales (Ashmore, 1997). En ua
de gato (Uncaria tomentosa), la adicin de manitol result txica para

los brotes bajo conservacin y despus de dos meses en cultivo el

material fue desechado por oxidacin y muerte (Cruz et al., 2011).
Actualmente existen colecciones de varias especies tropicales
de inters agronmico almacenadas bajo esta modalidad.
La coleccin de caf es mantenida por brotes a 27C con la
concentracin de citocininas reducida.
Gengibre por brotes a una temperatura entre 24C y 27C con
manitol y bajo una capa de parafina.
Pia a 25 con la concentracin de sales reducida a la cuarta
parte.
Banano a 16C en presencia de reguladores de crecimiento.
Fresa y mora a 4C tambin en presencia de reguladores de
crecimiento.
Tambin existen colecciones de brotes y microtubrculos de
papa, brotes de tiquisque, yuca, caa de azcar (Saccharum officinarum) y otras.
Es importante considerar que para utilizar esta modalidad de
conservacin se debe contar con una fuente de poder continuar y
confiable, lo que no es factible en muchos pases. Adems se debe
controlar cuidadosamente las condiciones de esterilidad del laboratorio durante los periodos de transferencia de los cultivos y durante el mantenimiento de las colecciones, ya que el germoplasma
podra perderse, como ocurri con el 90% de la coleccin de caa
de azcar por problemas de caros (Engelmann, 1997).

Figura 1: Plntulas bajo condiciones de conservacin In vitro a mediano plazo.

132

Crioconservacin
Como proceso natural todo material biolgico est sujeto al
envejecimiento; la estructura y la funcin de los organismos cambian y se pierde con el tiempo, hasta alcanzar la muerte. Lo mismo
sucede en los laboratorios con los materiales que los cientficos
estudian y manipulan. Por estas razones, desde tiempos remotos se
han realizado esfuerzos para detener el reloj biolgico de los organismos y en la mayora de los casos, se ha experimentado con la
temperatura y el contenido de agua para lograr este propsito. Las
tcnicas de refrigeracin permiten retardar el proceso de deterioro, pero la utilizacin de temperaturas mucho ms bajas permite el
almacenamiento de organismos vivos en un estado de suspensin
animada por periodos extensos. Este proceso de congelamiento a
ultra bajas temperaturas ha probado ser un mtodo eficiente y se
le conoce como crioconservacin o sistema criognico de almacenamiento (McLellen y Day 1995).
La crioconservacin se define como un grupo de tcnicas que
permiten el almacenamiento de organismos vivos en un estado
de suspensin animada por periodos extensos. El almacenamiento
se realiza a ultra bajas temperaturas, por lo general en nitrgeno
lquido (-196C) (Engelmann, 2004 ).
Por lo tanto, el mtodo de crioconservacin consiste en llevar
material biolgico desde su temperatura fisiolgicamente normal,
hasta ultra bajas temperaturas (generalmente en nitrgeno lquido,
-196C). A esta temperatura la divisin celular y los procesos metablicos cesan, por lo que el material puede permanecer almacenado
por tiempo indefinido sin que sufra modificaciones o alteraciones.
Sin embargo, el xito del proceso depender del acondicionamiento
que se d al material para que resista tanto el congelamiento como
la descongelacin. El acondicionamiento consiste en provocar una
deshidratacin protectora en las clulas y tejidos de manera que
se evite o diminuya la formacin de cristales de hielo que provoca

grandes daos en las membranas de la gran mayora de las clulas

(Villalobos y Engelmann 1995, Abdelnour, 1999).
Inicios de la crioconservacin
El desarrollo de estrategias de crioconservacin sigui los pasos que fueron establecindose para mamferos, pero dcadas ms
tarde.
Descubrimiento de qumicos con propiedades crioprotectoras
(mamferos) paso importante para el desarrollo y afinamiento
de las tcnicas de crioconservacin.
Glicerol protector de clulas de esperma de aves contra
el dao por fro biologa y medicina.
50s , DMSO o Me2SO (sulfxido de dimetilo) y glicerol para
glbulos rojos de humanos y animales, esperma de toros.
Actualmente grandes avances en este campo, pero crioconservacin de rganos a ultra baja temperatura con poco xito
contrario a los trabajos con plantas.
Crioconservacin
Sakai, 1956 brotes de mora deshidratados sobrevivieron el
congelamiento en NL comprender el mecanismo de resistencia
de las plantas a ese tipo de estrs.
Sun, 1958 xito parcial al desecar y congelar plntulas de
arveja.
Se continu estudiando el comportamiento del tejido de varias
plantas bajo condiciones de congelamiento.
Quatrano, 1968 clulas de linaza con DMSO fueron capaces
de sobrevivir al congelamiento a 50C.
Latta, 1971 cultivo de clulas de Ipomoea sp. -40C,
Daucus carota NL.
Nag y Street, 1973 regeneracin de embriones somticos a
partir de clulas de zanahoria congeladas a 196C.
Crioconservacin de otros tipos de materiales.

133

Aplicaciones de la crioconservacin
Desde hace ms de cincuenta aos, cuando se demostr por
primera vez la posibilidad de crioconservar eficientemente esperma animal, la tcnica se ha experimentado en campos diversos
para almacenar clulas vivas por largos periodos y an indefinidamente. La crioconservacin se emplea para el almacenamiento de
esperma y embriones de animales y humanos, que se utilizan para
inseminaciones artificiales y fertilizaciones In vitro. Tambin se utiliza
para el almacenamiento de eritrocitos y ha sido aceptado como el
mtodo ptimo para la conservacin de la diversidad microbiana.
En plantas, la posibilidad de crioconservar desde clulas hasta rganos ha sido demostrada ampliamente, al igual que su utilidad para
la conservacin de germoplasma y de material generado en condiciones de laboratorio (McLellen y Day 1995, Engelmann, 2000).

La crioconservacin de plantas
La mayora de los sistemas experimentales utilizados para la
crioconservacin (suspensiones celulares, callos, pices, meristemas,
embriones y semillas) son materiales con altos contenido de humedad, por lo tanto son extremadamente sensibles al dao por
congelamiento, ya que la gran mayora no son inherentemente
tolerantes al congelamiento y en consecuencia deben ser deshidratados artificialmente, para protegerlos del dao que causa la
cristalizacin del agua intracelular al pasar al estado slido (hielo)
(Engelmann 2000)

selectivo que mantiene una concentracin desigual de iones en ambos lados de sta y permite la entrada de nutrientes y otros solutos
y la salida de productos secundarios del metabolismo.
Todas las membranas biolgicas poseen en comn la misma
estructura: lpidos y protenas unidas por enlaces no covalentes. El
modelo del Mosaico Fluido se utiliza para ilustrar la estructura de
la membrana celular. Como se observa en la Figura 2, la membrana est compuesta por una doble capa de fosfolpidos que tiene la
consistencia de un aceite liviano y grandes protenas inmersas en la
doble capa de fosfolpidos. Adems de esteroles que ayudan a mantener la integridad de la membrana. La consistencia de los lpidos es
lo que permite el movimiento lateral de las molculas de protena y
origin el nombre del modelo (Taiz and Zeiger 2008).
Debido a que la membrana celular es selectivamente permeable,
regula el paso de molculas hacia adentro y hacia fuera de la clula.
En general, las molculas pequeas cruzan esta membrana ms fcilmente que las grandes. Como los fosfolpidos y las protenas tienen
regiones hidroflicas e hidrofbicas, la membrana interacta con sustancias tanto polares como no polares, cambiando, sus propiedades.
La temperatura es un factor que tiene gran influencia en el estado fsico de la membrana. Conforme la temperatura disminuye la
fluidez de la membrana tambin disminuye y pasa a un estado cristalino cuando se alcanzan las temperaturas para la crioconservacin.

La clula
En general, las clulas estn compuestas de fluidos biolgicos,
protenas y metabolitos encerrados en la membrana celular y en clulas vegetales existe adems, la pared celular. Al contrario de la pared
celular, la membrana no es una barrera pasiva, es un filtro altamente

Figura 2. Modelo de mosaico

fluido para la estructura de la membrana.

134

El agua constituye el mayor componente del contenido celular

y en ella se encuentran disueltos sales y varios tipos de solutos.
Como la molcula de agua es pequea y relativamente neutra se
difunde rpidamente a travs de la membrana. Cuando la membrana separa dos soluciones de diferente composicin, los cambios en el sistema conforme se acercan al punto de equilibrio, dependern de la permeabilidad de la membrana a los diferentes
solutos. Cuando la membrana es impermeable a los solutos, los
cambios dependern de la smosis. Debido a que el agua se mueve
libremente a travs de esta membrana, se mover de regiones de
mayor concentracin a regiones donde se encuentre en menor
concentracin (de regiones donde el potencial hdrico sea mayor
(menos negativo) a regiones donde el potencial hdrico sea menor
(ms negativo). Ahora bien, cuando la concentracin de solutos en
el exterior de la clula es muy alta, la clula puede sufrir plasmlisis
y muerte (Azcn-Bieto y Taln, 2008; Taiz y Zeiger, 2002).
Las ventajas de la crioconservacin
La crioconservacin se reconoce como la nica opcin disponible para el almacenamiento, a largo plazo, del germoplasma
de especies propagadas vegetativamente y especies con semillas
clasificadas como recalcitrantes e intermedias en cuanto al almacenamiento (Engelmann, 2000).
En la crioconservacin, el almacenamiento a ultra bajas temperaturas permite la suspensin del metabolismo, no ocurriendo
divisin celular y por lo tanto, el material permanece sin modificaciones o alteraciones por tiempo indefinido.
La utilizacin de nitrgeno lquido asegura las ultra bajas temperaturas (entre -196C y -150C dependiendo de que el material
permanezca en la fase lquida o gaseosa del nitrgeno respectivamente) y la no dependencia de la electricidad. Adems, el nitrgeno
lquido puede adquirirse fcilmente y no es inflamable ().

Al ser comparado con el mtodo de conservacin In vitro a

mediano plazo, el mtodo de crioconservacin presenta ventajas
considerables. Como el material se almacena en tanques, el espacio
para mantener la coleccin en el laboratorio es considerablemente
menor (0,5 m2 para un tanque de almacenamiento con capacidad
para 100 l de nitrgeno lquido y miles de muestras), el costo por
labor y mantenimiento es mnimo, siendo la nica labor rutinaria el
llenado del tanque cada semana o semana de por medio, para que
el nitrgeno lquido permanezca a un nivel mnimo de seguridad, lo
que no toma ms de 15 minutos del tiempo del asistente o tcnico
del laboratorio (Abdelnour, 1999).
Adems, una vez almacenados los materiales, no se manipulan,
se encuentran protegidos de posibles agentes contaminantes y en
caso de necesitarse una muestra especfica, sta puede ser descongelada y las plantas recuperadas y multiplicadas en corto tiempo
(Abdelnour, 1999; Engelmann, 2000).
El proceso de crioconservacin
Como el proceso de crioconservacin consiste en llevar material biolgico desde su temperatura fisiolgicamente normal hasta
ultra bajas temperaturas y de nuevo al punto nidal sin causar dao,
es indispensable acondicionar los materiales para que resistan el
proceso y es por esto que una de las etapas ms importantes es
inducir cierto grado de deshidratacin en los materiales para evitar
los daos causados por la formacin de grandes cristales de hielo
durante el congelamiento y descongelamiento de los materiales
(Benson, 1990).
Las tcnicas clsicas de crioconservacin comprenden varias
etapas que se citan a continuacin, sin embargo, no todas las tcnicas desarrolladas ms recientes requieren de la secuencia completa
de estas etapas, lo que las hace ms atractivas y prcticas:

135

Seleccin y aislamiento del explante

Pretratamiento y crioproteccin
Congelamiento y almacenamiento
Descongelamiento
Recuperacin
La seleccin del material a crioconservar
Para la seleccin del material a crioconservar se debern tomar
en cuenta factores como la estructura gentica de la poblacin
y el germoplasma disponible. Se pueden almacenar pices, meristemos, semillas, embriones cigticos y somticos, polen, clulas y
protoplastos. Sin embargo, para conservacin de germoplasma, la
estabilidad gentica intrnseca del sistema es importante de considerar. Como regla general se recomienda que el material sea tan
joven y meristemtico como sea posible, ya que as resisten mejor
el congelamiento, los especmenes son ms pequeos, las clulas
contienen vacuolas pequeas con poca agua y citoplasma denso.
Pueden utilizarse muestras in vivo o In vitro, pero el material In
vitro es preferible, debido a que ya estn miniaturizados y libres de
contaminantes. En el caso de crioconservacin de suspensiones
celulares, el estado fisiolgico es tambin muy importante, siendo
el estadio de crecimiento exponencial mas adecuado para lograr
la sobrevivencia al congelamiento. Para los embriones somticos
el estadio globular es el ms recomendado (Engelmann, 1991).

El pretratamiento y la crioproteccin
El pretratamiento consiste en cultivar el material biolgico durante unas horas o das en presencia de sustancias llamadas crioprotectores, de manera que el material se prepara para soportar
el proceso de crioconservacin. Si estas sustancias no penetran
la membrana (crioprotectores extracelulares), ejercen una accin
osmtica ayudando a la clula a perder agua e incrementan la
viscosidad extracelular lo que resulta en un congelamiento ms
uniforme de los especmenes. Entre los crioprotectores extracelulares se encuentran algunos azcares, azcares alcoholados, PVP,
sacarosa, etc. Los crioprotectores capaces de penetrar al interior
de la clula (crioprotectores intracelulares), como el glicerol y el
sulfxido de dimetilo (DMSO), aumentan la concentracin interna
de solutos y promueven la formacin de cristales de hielo pequeos. Adems, son capaces de formar puentes de hidrgeno con los
fosfolpidos de las membranas ayudando a mantener su estabilidad
y protegiendo los sitios de enlace de las enzimas. Debido a que los
crioprotectores incrementan significativamente la osmolaridad del
medio es recomendable adicionarlos en forma gradual, de manera
que las clulas tengan suficiente tiempo para equilibrarse. Tambin
se recomienda agregarlos a temperaturas menores a la ambiental
para evitar intoxicaciones. En muchos casos, el uso de mezclas de
crioprotectores, como el Polietilenglicol (PEG) (10%), glucosa (8%)
y DMSO (10%) han resultado en mayor porcentaje de sobrevivencia (Reed y Lagerstedt, 1987).

Sin embargo el factor decisivo en la seleccin del material a

conservar es la disponibilldad de la tcnica de cultivo In vitro para
la especie de inters, con el fin de regenerar fcilmente plantas a
partir del material almacenado. Por lo tanto, para lograr el xito
en un programa de crioconservacin es indispensable establecer
a priori un protocolo eficiente para la micropropagacin de la
especies. (Ashmore, 1997).
Cuadro 1: Viabilidad de meristemas de Rubus spp despus del
congelamiento en nitrgeno lquido (Reed y Lagerstedt, 1987).

136

* DMSO: Sulfxido de dimetilo, PGD: 10% PEG, 10% Glucosa y

10% DMSO. PTD: 10% Trehalosa y 10% DMSO.
Estudios de aclimatacin al fro llevados a cabo con cultivos
creciendo bajo condiciones In vitro han mostrado efectos tanto
positivos, como negativos sobre su sobrevivencia al congelamiento
en NL. Algunas especies han mostrado incrementos considerables
en la sobrevivencia, por ejemplo, la aclimatacin de callos de varios
cultivares de Chrysanthemum y Populus a temperaturas de -16C
increment la tasa de sobrevivencia de los mismos. De igual manera, meristemas de Dianthus, Rubus y de manzana por lo menos
duplicaron el porcentaje de sobrevivencia al congelamiento despus de un periodo de 4 a 10 semanas de aclimatacin a 4C. Sin
embargo, antes de aplicar este pretratamiento es recomendable
tomar en cuenta el hbitat de la especie de inters.

Cuadro 2: Efecto de la aclimatacin al fro sobre la sobrevivencia al congelamiento en nitrgeno lquido (NL) de meristemas de
Rubus spp. (Reed, 1988).
El congelamiento
Para esta etapa del proceso de crioconservacin se utilizan tubos de polipropileno de varios volmenes, siendo los de 1 ml y 2
ml los ms utilizados. Los procedimientos de congelacin se describen a continuacin.

El congelamiento rpido que es el mtodo ms simple y por

lo tanto el ms utilizado en los protocolos desarrollados ms recientemente. Consiste en sumergir el material a conservar directamente en nitrgeno lquido. Un requisito a cumplir por los explantes es que deben estar en el estado de deshidratacin ptimo
antes del congelamiento para evitar la formacin de cristales de
hielo dainos.
El congelamiento escalonado, bajo este esquema el material se somete a sucesivas temperaturas por debajo de 0C y se
mantiene en cada una de ellas durante cierto tiempo, para luego
almacenarse en nitrgeno lquido.
El congelamiento lento es el procedimiento utilizado en las
tcnicas clsicas de crioconservacin. Se utilizan congeladores programables de manera que la velocidad de enfriamiento de la muestra pueda ser controlada y los resultados precisos y reproducibles.
Las velocidades de enfriamiento, por lo general, estn comprendidas entre 0,1C/min y 3C/min. El congelamiento lento permite
que conforme se va reduciendo la temperatura, el agua intracelular
se movilice al exterior donde el agua se congela ms rpidamente,
es decir, los cristales de hielo se forman extracelularmente. Una
vez que la muestra alcanza una temperatura determinada (generalmente - 40C), se almacena en NL.
El almacenamiento
El almacenamiento de los materiales se realiza en nitrgeno
lquido. Puede ser en la fase lquida (- 196C) o en la fase gaseosa
(- 150C) y siempre que el material se mantenga bajo estas condiciones podr ser almacenado por tiempo indefinido. El mercado
ofrece una gran variedad de tanques de almacenamiento que se
caracterizan por ser livianos y permitir maximizar el tiempo de
conservacin por una cantidad determinada de nitrgeno lquido.

137

Figura 3. Estructura de un tanque para

el almacenamiento de muestras en nitrgeno Lquido (NL).
El descongelamiento
En la mayora de los casos se realiza
por inmersin de los criotubos que contienen las muestras en baos de agua a
40C por 1 2 minutos. Sin embargo, en
algunos casos un descongelamiento ms
rpido o lento ha sido favorable.
La recuperacin
Es cualquier tratamiento al que se someta el material despus del congelamiento. Puede ser el lavado o dilucin de los
crioprotectores para evitar efectos txicos debidos al contacto del material por
largo tiempo con esas sustancias (Engelmann, 1991), o el cultivo del explante bajo condiciones diferentes
a las normales como oscuridad para evitar la fotooxidacin de los
tejidos (Benson y colaboradores, 1989).
Pruebas de viabilidad
Varios mtodos pueden ser empleados para estimar la viabilidad del material que fue congelado. Sin embargo, el mtodo
ms recomendado es su recultivo bajo condiciones ptimas de
crecimiento y as evaluar su capacidad de regeneracin (Roca y
Mroginski, 1991).
Las pruebas de viabilidad pueden aplicarse poco tiempo despus del descongelamiento, pero no dan resultados tan precisos

como los obtenidos con el recultivo. Estn basadas en la incubacin de las muestras en sustratos de enzimas. La viabilidad se
determina con base en la accin de stas.
El diacetato de fluorescena (FDA), es una prueba muy utilizada con clulas o pequeos agregados de 2 3 clulas y protoplastos. Este compuesto es absorbido por clulas vivas y transformado a fluorescena por accin de las esterasas; la fluorescencia
es medida bajo un microscopio con luz ultravioleta y se hace una
relacin entre clulas observadas bajo luz de tungsteno y las observadas bajo luz ultravioleta. Todas aquellas observadas bajo luz
ultravioleta son viables.

138

El cloruro de trifenil tetrazolio (TTC), compuesto incoloro, es

reducido a formazn, un compuesto de coloracin roja, en mitocondria de clulas vivas por enzimas deshidrogenasas. Esta prueba
es utilizada con embriones y meristemos.
Preparacin de la solucin de diacetato de fluorescena
(FDA) (Wildhom, 1972; Roca y Mroginski, 1991)
Preparar una solucin madre de FDA al 0,5% en acetona. Conservarla en el congelador a 20C.
A la hora de utilizar, agregar 0,5 ml de la solucin madre a 25 ml
de medio de cultivo, de manera que la solucin final de FDA sea
de 0,01%.
Sobre un portaobjetos, mezclar una gota de esta solucin con
una gota de la suspensin celular o de protoplastos. Colocar el
cubreobjetos. Esperar de 5 a 20 minutos. Con un microscopio con
lmpara de tungsteno y UV, observar las clulas. Primero observarlas bajo la luz de la lmpara de tungsteno y contarlas. Realizar la
misma operacin bajo la luz UV.
Calcular el porcentaje de viabilidad como se muestra en la frmula:

Procedimientos utilizados
para la crioconservacin

Los mtodos clsicos

Consisten en el pretratamiento del material con sustancias
crioprotectoras como el sulfxido de dimetilo (DMSO), el glicerol,
la sacarosa y el polietilenglicol y mezclas de ellas durante unos minutos, horas o das, para lograr la deshidratacin lenta de las clulas. El pretratamiento es seguido por un congelamiento controlado
que se lleva a cabo lentamente (0,3C a 2C/mm) hasta - 40C,
luego se almacenan las muestras en nitrgeno lquido. Este procedimiento ha resultado ms eficiente con unidades pequeas de
morfologa uniforme como cultivos de protoplastos, suspensiones
de clulas y callos y menos eficiente con unidades mayores como
embriones cigticos, embriones somticos maduros y brotes. Otra
limitante de estos mtodos es la inversin que se debe realizar en
un congelador programable, para poder obtener resultados precisos y reproducibles.

%viabilidad = # de clulas que emitieron fluorescencia bajo UV x100

# de clulas observadas bajo luz de tungsteno
Preparacin del cloruro de trifenil tetrazolio
(TTC) (Stemponkus y Lamphear, 1967)
Preparar una solucin de TTC al 0,6% en una solucin buifer (8,9
g/l de Na2HPO4 + 6,8 g/l de KH2PO4).
Incubar los especimenes por 20 horas a temperatura ambiente.
Los explantes viables se colorearn de rojo.
Calcular el porcentaje de viabilidad.
Si se desea recuperar los especmenes para pruebas posteriores
de germinacin y crecimiento, la solucin de TTC debe ser esterilizada por filtracin y la prueba realizada bajo condiciones aspticas.

Figura 5: Congelador
programable

139

Los nuevos mtodos

Para los materiales de mayor tamao, como meristemas, pices
recientemente se han desarrollado procedimientos eficientes y reproducibles sin necesidad del congelador programable.

Figura 6: Extraccin de semillas y preparacin de endocarpos

de teca (tectona grandis) para la crioconservacin. A) Extraccin
de semillas, se utiliza un martillo para romper el endocarpo duro.
B) Semillas aisladas. C) Lijado de endocarpos, utilizando lija # 100.
D) Endocarpos lijados y listo para el congelamiento o para el pretratamiento con GA3.

Desecacin
Este es un procedimiento muy sencillo y eficiente, utilizado principalmente para la crioconservacin de semillas y embriones cigticos. Consiste en la deshidratacin de las semillas y por varios periodos, bajo un flujo de aire estril o utilizando envases con slica gel
hermticamente cerrados. El congelamiento es rpido, directamente
en nitrgeno lquido (Abdelnour-Esquivel, 2007; Rojas y Abdelnour,
2000; Engelmann, 2000; Abdelnour y colaboradores, 1992).

C
D

Figura 5: Esquema de la tcnica de crioconservacin utilizando la metodologa de desecacin y congelamiento rpido en

nitrgeno lquido. Esta tcnica es muy utilizada para la conservacin de embriones cigticos y semillas de caf. (IPGRI/CATIE/
IRD, 2000).

140

Figura 7. A. Porcentaje de germinacin de la semilla desnuda de

teca durante 28 das en condiciones In vitro. B. Nmero de hojas
promedio por brote. C. longitud promedio de brote. D. longitud
promedio de raz de plntulas de teca germinadas a partir de semilla desnuda de teca congelada (NL+) y no congelada (NL-), evaluadas durante 28 das en condiciones In vitro (Hine, 2011).

141

Precultivo/deshidratacin
Consiste en combinar el precultivo en sacarosa u otra sustancia
crioprotectora con la desecacin, para aumentar el xito en la crioconservacin de pices y embriones (Ashmore 1997).
Encapsulamiento/Deshidratacin
Se basa en la tecnologa desarrollada para la produccin de
semillas sintticas consiste en encapsular meristemas, pices y embriones somticos en alginato cultivarlos en medio lquido con concentraciones altas de sacarosa durante diferentes periodos. Antes
de congelarse rpidamente en nitrgeno lquido, la cpsulas son
parcialmente deshidratadas bajo el flujo laminar de aire estril d
una cmara de transferencia o utilizando slica gel. Para la recuperacin, la muestras se colocan en el medio de cultivo estndar (Fabre
y Dereuddre 1990)

timiento consta de dos partes, una Imina externa la cual fortalece

y protege la semilla y una solucin interna con los nutrientes requeridos por el explante para su desarrollo (endospermo artificial).
Por lo general, esta solucin interna tambin contiene reguladores
de crecimiento y pueden adicionarse otros componentes como
fungucidas, antibiticos y otros (Gray y Purohit, 1991; Rodrguez,
2000). Esta tecnologa tiene muchas aplicaciones: en investigacin,
propagacin directamente en invernadero o campo y en la conservacin a largo plazo del germoplasma vegetal entre otras (Gonzalez-Arnao y Engelmann, 2006).

La semilla es una unidad formada por un embrin cigtico y su

provisin de alimento almacenado, rodeados por cubiertas protectoras. En su mayora tienen un porcentaje de humedad bajo,
un metabolismo reducido y no presentan actividad aparente de
crecimiento sino hasta la germinacin. La semilla sinttica mantiene
muchas de estas caractersticas, pero presenta algunas adicionaI por
su naturaleza somtica o de propagacin vegetativa. Inicialmente
los investigadores utilizaban este concepto para definir el encapsulamiento de embriones somticos utilizados para la propagacin.
Sin embargo, d concepto de semilla sinttica se utiliza hoy da para
definir tambin, de encapsulamiento de otro tipo de tejidos u rganos vegetales.
Por lo tanto, se define como tecnologa de semillas sintticas el
revestimiento de cualquier material vegetal meristemtico como
embriones somticos, meristemas, brotes o microestacas. El reves-

Figura 6: Esquema de la tcnica de crioconservacin utilizando

la metodologa de encapsulamiento en alginato y deshidratacin.
(IPGRI/CATIE/IRD, 2000)

142

Vitrificacin
La vitrificacin es un proceso fsico en el cual una solucin
acuosa pasa de la fase lquida, por una fase de transicin, a una fase
de slido amorfo vtrio o vidrioso.
Consiste en el pretratamiento de las muestras con soluciones
concentradas de crioprotectores (sacarosa, glicerol y DMSO) por
unos minutos, seguido por el congelamiento en nitrgeno lquido para alcanzar un estado de vitrificacin de los solutos internos.
Como estas soluciones son txicas para las clulas es importante
controlar cuidadosamente el tiempo de incubacin y removerlas
gradualmente despus de descongelar las muestras (Sakai y colaboradores 1990).
Esta tcnica ha permitido la crioconservacin de muchas especies subtropicales como manzana, uva, pera, t, ajo y fresa y algunas
especies tropicales como pia, ame, amp, banano y chayote (Engelmann y Takagi, 2000; Abdelnour y Engelmann, 2002).

Cuadro 3. Composicin de algunas soluciones vitrificadoras utilizadas para la crioconservacin de material vegetal.
Las soluciones vitrificadoras se enfran fcil y rpidamente hasta temperaturas menores de -100 C y finalmente se solidifican
en un vidrio metaestable a la temperatura de transicin del vidrio
(-110C).
Ventajas

Caractersticas:
1. Evita la formacin de cristales de hielo durante congelamiento.
2. Aumenta la supervivencia de clulas, tejidos y rganos hidratados
cuando se utiliza el congelamiento rpido en nitrgeno lquido.
3. Una sustancia vitrificada es una sustancia extremadamente viscosa que presenta un potencial hdrico menor que el correspondiente slido cristalino y por lo tanto, evita una mayor deshidratacin.
4. Elimina la preocupacin por la formacin intra y extracelular de
cristales de hielo.
5. Posee un gran potencial de aplicarla, con pequeas modificaciones en diferentes tipos de clulas, etc.

1. Mayor supervivencia en el congelamiento de rganos ms complejos (brotes, embriones somticos).

2. El meristemo apical permanece vivo y la regeneracin es llevada
a cabo en forma directa y organizada.
3. Simplifica el proceso de crioconservacin.
Adquisicin de tolerancia a la deshidratacin
1. Precultivo del explante en concentraciones crecientes de sacarosa por varios periodos (horas o das).
2. Tratamiento con solucin cargadora (loading solution LDS) 2M
glicerol + 0.4M sacarosa.

143

Encapsulamiento/vitrificacin
Es otro mtodo que se ha desarrollado recientemente y combina los procedimientos utilizados en las tcnicas descritas anteriormente, las muestras encapsuladas se congelan en presencia de
las soluciones vitrificadoras y el porcentaje de recuperacin es mayor que utilizando cada procedimiento por separado; al parecer, el
encapsulamiento en alginato reduce la toxicidad de las soluciones
vitrificadoras y como la manipulacin de las muestras es menor antes del congelamiento, se disminuye la duracin del procedimiento
(Matsumoto y colaboradores 1995).
Congelamiento por microgotas
Este procedimiento ha sido utilizado exitosamente con 150
variedades de papa; ha permitido la recuperacin de meristemas
en porcentajes considerablemente altos. Consiste en pretratar los
meristemos por un periodo de 2 a 3 horas con DMSO en medio
lquido, para luego colocarlos en gotas de 2.5 l del mismo medio
sobre papel aluminio y congelarlos rpidamente en nitrgeno lquido (Schafer-Menuhr 1995).

Figura 6: Crioconservacin utilizando la metodologa de congelamiento

por microgotas. Se utilizan pequeos
trozos de papel aluminio, sobre los
que se colocan las microgotas del
crioprotector y luego los meristemas
a congelar.
Algunos de los mtodos desarrollados ms recientemente requieren una mayor manipulacin de las
muestras y el tiempo inver tido antes
de la congelacin es mayor (encapsulamiento, precultivo/encapsulamiento); sin embargo, todos presentan la gran ventaja
de no requerir el costoso congelador programable y permitir
la regeneracin de materiales de tamao considerable. Estas
caractersticas de los nuevos procedimientos de crioconservacin los hacen accesibles a pases y laboratorios con recursos
econmicos limitados.
Para la mayora de las especies vegetales los protocolos de
crioconservacin estn en estado de experimentacin; sin embargo, esta tcnica de conservacin ya se utiliza de manera rutinaria para el almacenamiento de un gran nmero de genotipos
de los gneros Rubus, Pyrus, Solanum spp. y Elaeis guineensis
(Ashhmore, 1997). Al presente, Costa Rica no mantiene colecciones vegetales en nitrgeno lquido, pero la investigacin en
este campo est tomando mayor impor tancia, conforme se va
desper tando el inters y conciencia en la impor tancia de salvaguardar nuestros recursos fitogenticos.

144

Algunas conclusiones sobre la crioconservacin

La crioconservacin, como mtodo para el establecimiento de
bancos de germoplasma de especies problemticas para el almacenamiento, presenta gran potencial, especialmente para pases
en desarrollo, en donde la diversidad de plantas es una de las
mayores riquezas.
Entre las ventajas de establecer este tipo de conservacin en
el pas se puede mencionar que, la mayor parte del equipo requerido para ejecutar los procedimientos se encuentra en los laboratorios de cultivo de tejidos, infraestructura que existe en muchas
instituciones nacionales; lo mismo que personal entrenado en las
tcnicas del cultivo In vitro, que son bsicas para desarrollar los
procedimientos de crioconservacin. La inversin en equipo especfico, un tanque de almacenamiento de muestras y un tanque
surtidor de nitrgeno lquido, es mnima, ya que actualmente se
utilizan metodologas eficientes de crioconservacin que no requieren el uso del costoso congelador programable.
Como el mtodo de crioconservacin consiste en el almacenamiento en nitrgeno lquido, frecuentes interrupciones en el
fluido elctrico no tienen consecuencias negativas sobre los materiales conservados. El bajo costo de mantenimiento de la coleccin, que comprende nicamente la compra del nitrgeno lquido
para el llenado peridico del tanque de almacenamiento y el poco
tiempo que invierte el tcnico de laboratorio en esta labor, representan otras de las grandes ventajas de la crioconservacin, sobre
todo para pases como los nuestros, donde los recursos econmicos y el personal asignado a conservacin de germoplasma son
limitados.
En Costa Rica, la crioconservacin para la conservacin de
material vegetal - est en etapa experimental, pero los resultados
obtenidos con una variedad de especies y materiales (embriones
cigticos, somticos, callos, suspensiones celulares embriognicas

y pices) indican claramente la factibilidad de implementarla en

bancos de germoplasma. La investigacin en crioconservacin se
ha caracterizado por desarrollarse a travs de proyectos coftos
con reducido apoyo financiero, lo que no ha permitido optimizar
las metodologas bsicas establecidas durante el periodo de ejecucin del proyecto (Abdelnour, 1999).

Captulo 11

AGROINFECCION
Una tcnica sencilla para el mejoramiento de plantas

Rosa Mara Rangel Cano

147

Introduccin
En los ltimos 30 aos las tcnicas de mejoramiento de plantas
por medio de mtodos alternativos al mejoramiento tradicional
han sido aplicadas en una gran cantidad de especies vegetales. Esto
debido a la incapacidad de tener plantas mejor adaptadas a las
condiciones medioambientales de forma eficiente, as como a los
tiempos requeridos para la obtencin de nuevas variedades (de 7
a 10 aos) en los mtodos tradicionales.
Dentro de las tcnicas alternativas tenemos la que involucra a
la bacteria Agrobacterium tumefaciens.

Fuente: Agrobiotecnologa, UBA

Para la incorporacin de una o varias nuevas caractersticas

(genes) en especies vegetales, la bacteria Agrobacterium posee una
gran habilidad natural de transferir e incorporar material gentico a
las plantas, dicho material gentico est contenido en un plsmido
extracromosmico (ADN circular en la bacteria).
En el plsmido llamado pTi (por inductor de tumores) se encuentra o se puede incorporar la informacin nueva que queremos
incorporar en las plantas.

Fuente http://biologiasb.blogspot.com/

148

Esta bacteria al encontrarse normalmente en todos los suelos

del mundo, es capaz de infectar a ms de 350 gneros diferentes de
plantas, principalmente dicotiledneas (plantas de hoja ancha).
Para aplicar esta tecnologa, basta con tener un cultivo de sta
bacteria (la cual se le incorpor la informacin que queremos introducir a la planta) en presencia de porciones de tejido llamados
explantes, para que la maquinaria de Agrobacterium se active, infecte y transfiera la informacin gentica a las clulas de la planta que
han sido superficialmente daadas por el corte.
Una vez infectados los explantes se transfieren en un medio de
cultivo que contenga todos los nutrientes necesarios para obtener
plantas, adems del compuesto que permita la seleccin de los
transformantes (ver capitulo de micropropagacion).

Tomado de http://www.xtec.es/~jcarrasc/transgenicas.htm

Metodologa para agro-infectar plantas

Materiales
Pinzas de metal de punta delgada
Bistur y tijeras pequeas de punta afilada
Asa bacteriolgica
Cajas de petri estriles de vidrio o plstico
Crculos de papel filtro estriles de dimetro del tamao interno
de la placa de petri.
Mechero
Frasco con etanol; absoluto para flamear las pinzas y al 70% para
limpiar el rea de trabajo.
Toallas de papel
Papel de filtro estril (de 5 a 10 cm2)
Papel de aluminio para envolver las cajas de petri.
Sales basales Murashige & Skoog (Sigma #5519)
Solucin Stock de 2 mg/L de BAP (Sigma #B9395)
Agar
Solucin Stock de 100 mg/L de kanamicina (Sigma # K4378)
Solucin Stock de 100 mg/L de de cefotaxime comercial (marca
libre de farmacia).

149

Para el crecimiento de Agrobacterium.

2 tubos de ensayo conteniendo 2mL de medio Yeb
lquido adicionado de los antibiticos necesarios segn la cepa
2 matraces o frascos de 50 mL, conteniendo 20 mL
de medio Yeb lquido adicionado de los antibiticos
necesarios segn la cepa
Cajas de Petri con medio Yeb solido conteniendo
un cultivo fresco de Agrobacterium.
Se puede utilizar cualquier
planta, pero el protocolo
aqu descripto utiliza
como modelo plantas
aspticas de tabaco en
frasco de cultivo

Para el manejo del material vegetal y la infeccin.

Cajas de petri conteniendo medio de co-cultivo
Cajas de petri con medio de seleccin e induccin
de brotes y/o callo.
Medio MS lquido
Frascos conteniendo medio de elongacin y enraizamiento
Cajas de petri conteniendo medio de comprobacin de la transformacin

Preparacion de medios de cultivo

Medio de cocultivo.
Para un litro de medio:
Azcar granulada (sacarosa) 2 g.
Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 0.5 g.
Agua destilada cbp 1000mL
Agar 8 g.
Se mezcla todo y se esteriliza 121 C por 15 min.
El medio de cultivo MS (Murashige-Skoog) estril
y caliente (a temperatura que la mano resista medio

minuto) se vaca en cajas de petri en campana de

flujo laminar, se dejan enfriar y se les colocan los crculos de papel filtro en la superficie, ayudados con las
pinzas estriles y fras.

Medio lquido MS.

Para un litro de medio:
Azcar granulada (sacarosa) 2 g.
Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 0.5 g.
Agua destilada cbp 1000mL
Se mezcla todo y se esteriliza 121 C por 15 min.

Medio de seleccin e induccin de brotes

(tejidos vegetales)

Para un litro de medio:

Azcar granulada (sacarosa) 20 g.
Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 4.7 g.
Agua destilada cbp 1000mL
Soluciones Stock de:
BAP 2mg/mL (bencil amino purina) - 1 mL/L
Agar 8 g.
Se mezcla todo y se esteriliza 121o C por 15 min.
Soluciones Stock de:
Antibitico cefotaxime comercial (marca libre), no
expirado diluido a 100 mg/ml.
Antibitico kanamicina 100 mg/mL para una cepa
que contenga el gen de resistencia NPTII.
Procedimiento:
El medio de cultivo estril y caliente (a temperatura que la mano resista medio minuto), se le adi-

150

cionan 2ml de cefotaxime, se agita y se dispensan 4 placas (control

de la transformacin) y al resto del medio se adicionan 2 ml de
kanamicina, se mezcla perfectamente y se vaca en cajas de petri
(15 a 20 mL) en campana de flujo laminar, se dejan enfriar, se sellan
y se guardan en refrigerador (15 C).

Medio de elongacin y enraizamiento

Para un litro de medio:
Azcar granulada (sacarosa) 30 g.
Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 4.7 g.
Agua destilada cbp 1000mL
Agar 8 g.
Se mezcla todo y se esteriliza 121 C por 15 min.

Procedimiento:
El medio de cultivo estril y caliente (a temperatura que la
mano resista medio minuto), se le adicionan 2ml de la solucin
stock de cefotaxime y 4 ml de de la solucin stock de kanamicina,
se mezcla perfectamente y se vaca en cajas de petri estriles (20 a
40 mL) en campana de flujo laminar, se dejan enfriar, se sellan y se
guardan en refrigerador (15 C).
NOTA: Este medio sirve para comprobar la transformacin
en forma eficiente y barata, debido a que por un lado estamos
subiendo la concentracin de la kanamicina al doble, y estamos
exponiendo material daado (al cortar), de tal manera que solo
aquel que realmente sea transgnico desarrollar un callo en la
zona de corte. Eliminando as los posibles escapes que se hayan

Procedimiento:
El medio de cultivo estril y caliente (a temperatura que la
mano resista medio minuto), se le adicionan 2ml de la solucin
stock de cefotaxime y 2 ml de de la solucin stock de kanamicina,
se mezcla perfectamente y se vaca en frascos estriles (15 a 20
mL) en campana de flujo laminar, se dejan enfriar, se sellan y se
guardan en refrigerador (15 C).

Medio de comprobacin de la transformacin

(induccin de callo)
Para un litro de medio:
Azcar granulada (sacarosa) 20 g.
Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 4.7 g.
Agua con destilada cbp 1000mL
Agar 8 g. se mezcla todo y se adicionan 5 mL de la solucin stock
de ANA (cido naftalen actico) 0.1mg/mL
Se mezcla todo y se esteriliza 121 C por 15 min.

obtenido durante la primera parte.

Detalles prcticos
Antes de iniciar cualquier trabajo, lavarse perfectamente con
jabn manos, uas y antebrazos y secarlos con toallas de papel, limpiar la zona completa con una solucin de etanol al 70% (mantenga
el etanol alejado del fuego), ayudado de una tolla de papel eliminar
el exceso de etanol y suciedad y deje que el resto del etanol se
evapore completamente. Posteriormente, coloque en una caja de
petri un poco de etanol absoluto, coloque las pinzas y tijeras en el
interior y encienda el etanol teniendo cuidado de no dejar el frasco
de etanol absoluto cerca de la placa encendida, deje que el etanol
se evapore y el material se enfre. Este proceso nos asegurar de
contar con el material estril desde el inicio del trabajo. Adems,
al hacerlo de esta manera, tambin contaremos con un recipiente
estril donde podremos cortar tejido o simplemente colocar nuevamente nuestro material que requiera condiciones de esterilidad.

151

Con ayuda de las pinzas y bistur (flameados) y en la cmara

de flujo, se corta una hoja de tabaco, de preferencia las ms jvenes cultivadas en condiciones aspticas y con ayuda de las tijeras
tambin flameadas previamente, se van cortando fragmentos de
aproximadamente 0.5 cm de lado y se coloca en la caja de petri,
sobre el medio lquido.
Cuando se tienen suficientes cuadros se adicionan 2 mL del
cultivo de Agrobacterium y 13 mL ms de MS lquido, se mezclan
con movimiento suave y se dejan en reposo 30 minutos.
Pasado el tiempo se retira el liquido y los explantes de colocan
en los medios de cocultivo, sobre el papel filtro. Se cubren con
papel aluminio y se cultivan a 25 C durante 24hr.

Desarrollo de la tcnica
Dos das antes de cortar los explantes, se coloca una colonia
de la bacteria en el tubo de medio Yeb con 2 mL (precultivo), y se
cultiva en agitacin a 28 C durante toda la noche, al da siguiente se
adiciona este cultivo al frasco que contiene los 50 mL de medio Yeb
y se vuelve a cultivar en las mismas condiciones una noche ms.
Ya con el cultivo bacteriano listo se procede a la obtencin de
los explantes.
En una caja de petri estril se adicionan 5 mL de medio MS
lquido.

Despus de ese tiempo, los explantes se transfieren a las placas

de petri conteniendo el medio de seleccin e induccin de brotes
y/o callo. Se coloca de 10 a15 explantes por placa teniendo cuidado de ponerlos con la parte del envs de la hoja (parte superior)
en contacto con el medio. Cultivarlos a 25 C durante 2 semanas a
25 C con fotoperiodo de 16 h luz / 8 h oscuridad. Despus de las
dos semanas se transfieren a medio nuevo. Se cultivan nuevamente
durante 2 a 3 semanas, plazo en el cual se iniciara la produccin de
brotes supuestamente transformados.
Los brotes se cortan y se transfieren al medio de elongacin y
enraizamiento mantenindolos en las mismas condiciones de cultivo.
Cuando las plantas estn grandes ser posible realizarles las
pruebas pertinentes para comprobar si son o no transformadas.
Una forma simple, prctica y sobre todo barata es colocar pequeos fragmentos (0.5 mm) de las hojas de las plantas elongadas en
el medio de comprobacin, tambin con el envs en contacto con
el medio. Y cultivarlas en las condiciones ya mencionadas.

152

Este medio al poseer mayor cantidad de kanamicina, permitir

la formacin de callo solo en las plantas que posean el gene de
NPTII, eliminando aquellos escapes que se hayan presentado en el
medio de induccin de brotes.
Tener cuidado de siempre marcar el explante con el mismo
nmero o letra que posee la plata, para no mezclar positivos con
negativos.
Detalles prcticos
Para el cultivo inicial de la bacteria, antes de la primera asada, el asa
se calienta al rojo vivo, y se deja enfriar, antes de tomar la bacteria.
En la obtencin de los explantes, preferentemente usar pocos
explantes por placa para evitar contaminaciones y despus de usar
una hoja en una placa, es recomendable volver a flamear los instrumentos metlicos. La forma correcta de hacerlo es, sumergir en
etanol absoluto las puntas de los instrumentos y en posicin inclinada a 45 grados ponerlos encima de la llama, hasta que el etanol
se evapora completamente, no es necesario llevarlos al rojo vivo.
NOTA: el frasco del etanol deber estar alejado siempre de la flama y con tapa, nunca adicione etanol a las manos, si cree necesario
lvelas nuevamente, si cree que pudo contaminar los utensilios,
flamelos nuevamente y djelos enfriar, nunca use guantes de ltex para este proceso.

Tomado de Agrobiotecnologia, UBA

153

Agrobacterium rhizogenes (actualmente reclasificada y renombrada como Rhizobium rhizogenes)

Agrobacterium rhizogenes es otra bacteria muy importante en
agricultura, debido a la capacidad que posee, al igual que A. tumefaciens de transferir informacin gentica dentro de las clulas
vegetales.

Tomado de Agrobiotecnologia, UBA

La diferencia entre stas bacterias es que entre la informacin

transferida a plantas por A. rhizogenes se encuentran presentes genes involucrados en el desarrollo de races adventicias, las cuales
pueden ser activas en la incorporacin de nutrientes y agua dentro
de las plantas, sobre todo en aquellas cuyas races originales son
ineficientes durante el proceso de propagacin que es el caso de
algunos tipos de rboles o bien pueden ser usadas en algunas especies vegetales tanto para la regeneracin de plantas transgnicas
como para la produccin de metabolitos secundarios.

Tumor de races producido por

Agrobacterium rhizogenes en discos
de remolacha
Al igual que con A. tumefaciens, A. rhizogenes se encuentra normalmente en suelo y al sufrir la planta un dao, sta libera sustancia
fenlicas, las que sirven de atrayente para a la bacteria, haciendo
que sta se dirija, se acopla a las clulas daadas, logrando la infeccin e introduccin del fragmento de informacin gentica.

154

Desarrollo de la tecnica
Para fines demostrativos se llevar a cabo dos tipos de prcticas, uno usando una planta completa que puede estar in vivo y una
planta in vitro.
Cultivo de races de
tabaco transformadas
por Agrobacterium rhizogenes
Esto se aprovecha en el laboratorio, de tal manera que haciendo una pequea incisin en el tejido vegetal y poniendo en contacto con un cultivo bacteriano, al cabo de pocos das despus se
iniciara la produccin de races adventicias, que sern transgnicas
y podrn ser utilizadas para los fines que se deseen.
Si el explante fue un fragmento nodal, podremos obtener una
planta lista para transferir a suelo, y si fue en otro tejido, la produccin de races puede seguir un cultivo continuo para la produccin
de sustancias de inters.

Estacas de pawpaw o banano

de montaa enraizadas con A. rizhogenes. 1

Materiales y mtodos.
Cepa de Agrobacterium rhizogenes A4 (*), en suspensin con dos
das de cultivo (de la misma forma que lo descrito para A. tumefaciens.
Plantas de chile, jitomate, y/o papa de 20 das de cultivo las dos
primeras y 30 las de papa en suelo (**).
Plantas de aj (chile o pimieto), tomate y/o papa cultivadas in vitro
(***) en medio de cultivo MS sin reguladores de crecimiento.
Jeringa de insulina
Pinzas
Bistur
Claforn comercial
(*) Cepa de tipo agropina que posee el plsmido pRiA4, que
confiere la caracterstica de races pilosas
(**) 20 o 30 das antes se colocan las semillas en suelo para
germinar tanto las semillas de chile como de jitomate o bien cualquier variedad de papa con los ojos prominentes en seal de pre
germinacin.
(***) Plntulas germinadas de semilla, de chile y/o jitomate, de
20 a 30 das de germinacin, en condiciones aspticas.
Esto se logra limpiando las semillas con una solucin de cloro al
20 % (20 mL de cloro comercial ms 80 mL de agua. Se agita durante 30 minutos y se lavan 3 veces con agua estril en condiciones
de asepsia. Las semillas se colocan en medio de cultivo MS slido.

155

Procedimiento

Los explantes (tallos) Se colocan en un medio MS sin reguladores de crecimiento.

Practica demostrativa fenotipica

La jeringa de insulina se carga con la suspensin bacteriana, y en
las diferentes zonas de la planta, puede ser tallo y/u hoja, se inocula
con un pequeo pinchazo una gota de la misma.
Nota: Se coloca un pedazo de cinta adhesiva para tener control
de localizacin.
Las plantas se mantienen en buenas condiciones de cultivo y
observacin (riego y nutrientes).
Al cabo de 2 a 3 semanas se observara en las zonas de inoculacin la aparicin de races adventicias.

NOTA: En esta parte del experimento deberemos usar una

jeringa de insulina sin bacteria y hacer pinchazos en las diferentes
zonas de la planta y sealar de la misma forma que los hechos con
la bacteria para que nos sirva de control. Cabe hacer notar que
de preferencia debern presentarse o en plantas diferentes o bien
en zonas opuestas de la misma planta.

En el laboratorio
Las plantas germinadas in vitro, se cortan en la parte del tallo, dejando dos nodos, haciendo el corte con cuidado con ayuda del bistur y de un solo tajo, sin daar los tejidos en condiciones aspticas.
La parte del corte se sumerge en la suspensin bacteriana, se
deja 15 minutos.

Se incuban a 25 C durante 24 horas, al da siguiente se transfieren a medio MS adicionado de Claforn.

Al cabo de 2 a tres semanas se observara la presencia de races en la zona de corte, y se diferencian de las races normales no
transgnicas por ser ms pilosas y desordenadas. Para poder hacer
una comparacin ms exacta se debern poner controles que no
hayan estado expuestos a la bacteria en los mismos medios, de tal
manera que se podrn hacer observaciones tanto de diferencias
como de similitudes.
Cabe mencionar que sta tcnica es ms usada para plantas
difciles de propagar y/o con races no eficientes o profundas, como
es el caso de algunas especies de rboles.

Glosario

Adaptadores: fragmentos de ADN de doble cadena que

se ligan de manera especfica a los extremos de fragmentos de ADN cortados con enzimas de restriccin
(trmino utilizado en el procedimiento de AFLPs).
ADN: cido desoxirribonucleico, material gentico de
los seres vivos.
Agrobacterium: bacteria natural del suelo que puede ser
utilizada para transferir genes a las clulas vegetales.
Asptica; libre de contaminacin
Auxinas y Citocininas: reguladores de crecimiento tambin llamadas hormonas vegetales, que estn involucradas
en la elongacin y multiplicacin celular. La combinacin
de stas promueven el desarrollo de las diferentes
respuestas en cultivo de tejidos vegetales.
Callo: Masa de clulas indiferenciadas, provenientes del
tejido vegetal y formado por influencia del medio de
cultivo.
Cromosoma: Molcula de ADN que contiene un nmero determinado de genes.
Enzimas de restriccin: enzimas que cortan al ADN en
sitios especficos.
Explante: Porcin de tejido vegetal (hojan tallo, raz, etc.)

utilizado para iniciar procesos de cultivo de tejidos o micropropagacin.

Gen: una secuencia de ADN (un segmento) de la cual se
obtiene una protena o una molcula de ARN con una
funcin especfica.
Genoma: toda la informacin gentica que posee un organismo, es decir todo el ADN que tiene un individuo.
Iniciadores: secuencias cortas de ADN que hibridan con
una cadena de ADN complementaria molde y representan el punto de inicio para la amplificacin de la misma.
Ingeniera gentica: es la tecnologa que permite la manipulacin y transferencia de ADN de un organismo a
otro, lo que permite la creacin de nuevas variedades de
plantas, animales y microorganismos, la correccin de defectos genticos y la fabricacin de numerosos compuestos. La tecnologa de ADN recombinante permite aislar y
manipular un fragmento de ADN de un organismo para
introducirlo en otro
In vitro: crecimiento o manejo de organismos en un recipiente cerrado, en condiciones controladas de esterilidad.
Kanamicina. Un antibitico de la familia de los aminoglicsidos que puede interferir con los procesos celulares
de traduccin mediante enlace con los ribosomas. Las
plantas en forma natural no son resistentes a este anti-

158

bitico por lo que la resistencia especfica a este antibitico puede usarse como marcador de seleccin usado
frecuentemente en clulas transgnicas.
Plsmido Ti (inductor de tumor): Informacin gentica
extracromosmica, natural presente en Agrobacterium
tumefaciens responsable de la formacin de tumores en
las plantas infectadas, enfermedad llamada Agalla de la
Corona. Plsmidos Ti, modificados genticamente, se
utilizan como vectores para introducir ADN forneo a
clulas vegetales.
Marcador Molecular: segmento de ADN que permite
conocer la informacin gentica que los organismos poseen y evidenciar las diferencias entre organismos dentro
y entre especies.
Nucletidos: unidad de construccin del ADN, la misma
que est constituido por un azcar de 5 carbonos, la
desoxirribosa, a la cual se une un grupo fosfato y una
base nitrogenada.
Omicas: El trmino micas hace referencia a las disciplinas como la genmica, la protemica, la transcriptmica
y la metabolmica. A estas tres ltimas tambin se las
agrupa bajo la denominacin de genmica funcional,
ya que estudian a los productos de la expresin de los
genes. Todas las micas se basan en el anlisis de un
gran volumen de datos, y por lo tanto se valen de la bioinformtica y de tcnicas rpidas y automatizadas de alto
rendimiento (high-throughput techniques). http://www.
argenbio.org/
Pares de bases: unin de 2 bases nitrogenadas. Esta unin
se realiza mediante puentes de higrgeno y es especfica
entre la timina y la adenina, y entre guanina y la citosina.

Plsmido: Un elemento gentico extracromosmico

presente en muchas cepas bacterianas. Los plsmidos
son pequeas molculas circulares de ADN utilizados
como vectores para la transferencia de genes de un organismo a otro.
Variabilidad Gentica: la variacin en el material gentico entre individuos de una poblacin o especie.

Bibliografa

161

y Msangi, S. 2008. International model for policy analysis of agricultural

commodities and trade (IMPACT):
Model description. Washington,
DC, IFPRI.

CAPITULO 1
- 1 www.rlc.fao.org/es/desarrollo/fao-bid/pdf/politicasaf.pdf
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