Una miniprep es una extraccin de ADN de naturaleza plasmdica de

un cultivo bacteriano.
El mtodo ms comn para ello es romper las clulas de dicho cultivo
mediante un choque alcalino de modo que slopermee selectivamente su
ADN plasmdico. Para ello, se toma un volumen de 2-5 mL de un cultivo
crecido en medio lquido y se centrifuga, aislando as las clulas de aqul.
Despus, se resuspende dicho sedimento y se expone dicha suspensin a
una disolucin que contiene NaOH y dodecilsulfato de sodio (SDS), la cual
solubiliza en parte lamembrana externa de las bacterias Gram negativas, lo
que produce la liberacin del contenido celular de stas: ADN genmico y
plasmdico desnaturalizados, ARN, protenas... Tras esto, se aade a la
mezcla acetato potsico, acdico, lo cual neutraliza todo los desechos
celulares y provoca la rpida renaturalizacin del ADN plasmdico, que
queda en suspensin, mientras que el genmico y el resto de componentes
celulares se reticulan y precipitan ayudados por la alta concentracin de
sales, especialmente del recin generado dodecil sulfato de potasio.
Finalmente, se centrifuga nuevamente la mezcla para aislar
el sobrenadante, rico en el ADN plasmdico y en ARN, el cual deber ser
eliminado mediante una ribonucleasa. El protocolo se puede mejorar con la
fenolizacin (fenol + cloroformo isoamlico) de las muestras de DNA.
La miniprep es la tcnica inicial de purificacin y concentracin de ADN
plasmdico para cualquiera de sus posibles fines, entre los que destaca
la clonacin (biologa).

Las tcnicas de Minipreps o mini preparaciones de plsmidos, permiten la

recuperacin de plsmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El
tratamiento de las clulas con una base de pH alto o un detergente
interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el
DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la
configuracin superenrrollada del plsmido se mantiene estable. La lisis
alcalina es el mtodo mayormente utilizado para el aislamiento de
plsmidos circulares proveniente de clulas bacterianas. Existen diversos
protocolos para realizar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes
pasos bsicos.
a. Remover las clulas del medio de cultivo en caldo mediante
centrifugacin. b. Descartar el sobrenadante para reducir contaminacin
mediante fragmentos de la pared celular del husped. c. Resuspender las

clulas en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa. d. Lisar las

clulas con NaOH y SDS e. Unin de las hebras de DNA y remocin de
contaminacin mediante el acetato de potasio. f. Precipitacin del DNA de
plsmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal (Acetato de
amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio) . g. Enjuague
del material gentico con EtOH al 70% h. Resuspender el material gentico.
Protocolo de extraccin de Plsmidos (Mini-prep)
Da # 1 Inocular la bacteria deseada (contiene plsmido) en caldo nutritivo
por 24 horas. Recordar que si el plsmido tiene algn gen de seleccin,
como por ejemplo resistencia a algn antibitico, se debe inocular la
bacteria en un medio nutritivo que contenga ese antibitico. Da # 2
Transferir 1.5 ml de la bacteria en un microtubo (1.5ml) estril y centrifugar a
13,000 rpm (revoluciones por minuto) por 2 minutos para formar un pellet
de bacterias. Descartar el sobrenadante y resuspender cada pellet en
100 l de la solucin I e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente.
Recordar que la Sol. I debe estar en hielo.
Aadir 200 l de la Solucin II (fra) y mezclar bien invirtiendo el microtubo.
Incubar en hielo por 5 minutos. Aadir 150 l de las Solucin III y mezclar
mediante vortex. Incubar en hielo por 5 minutos. Nuevamente vortex varios
segundos y centrifugar por 5 minutos a 13,000 rpm. Transferir el
sobrenadante a un microtubo estril. Aadir 1 volumen de
phenol/cloroformo/alcohol isoamlico (1:1:4), vortex y centrifugar 1 minuto a
13,000 rpm. Transferir la fase acuosa (arriba) a un microtubo estril y
aadir 2 volumenes de alcohol absoluto (etanol 100%). Mezclar invirtiendo
el tubo y dejar incubando por 5 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar por 5minutos a 13,000 rpm y descartar el sobrenadante. Lavar
el sedimento aadiendo1ml de alcohol al 70 % (etanol) y mezclar
invirtiendo. Dejar secar el sedimento no mas de 5 min. Resuspender el
sedimento en 50 l de TE 1X y aadir 1 l de RNAasa A. Guardar a -200
C.

Birnboim HC, Doly J Nucleic Acids Res. 1979 Nov 24;7(6):1513-23.

http://www.uprm.edu/biology/profs/rios/labman.pdf

Transformacin gentica:
La transformacin gentica es un proceso por el que el ADN libre se
incorpora en una clula receptora y lleva a cabo un cambio gentico. El
descubrimiento de de la transformacin gentica en bacterias fue uno de los
acontecimientos ms destacables en biologa, ya que condujo a
experimentos que demostraron que el ADN es el material gentico. Est
descubrimiento se convirti en la piedra angular de la biologa molecular y la
biologa moderna.
1. Qu es una clula competente?
Una clula que es capaz de tomar de una molcula de ADN y ser
transformada se dice que es competente. Solo ciertas cepas de bacterias
son competentes; esta capacidad parece ser una propiedad determinada
genticamente. En de las bacterias que se pueden transformar
genticamente, la competencia est regulada y hay protenas que juegan un
papel en el transporte y procesamiento del ADN.
2. Qu es la competencia natural e inducida? Da al menos un
ejemplo(bacterias) de cada una:
La competencia natural se da cuando una bacteria es capaz de tomar una
molcula de ADN sin necesidad de de alterar su medio, razn por la cual se
da su nombre debido a que se da en condiciones naturales del medio en el
que se encuentra la bacteria, sin embargo la competencia natural solo
ocurre en algunas bacterias como: Acinetobacter, Azotobacter, Bacillus,
entre otras.
La competencia inducida se presenta cuando algunos procariontes presenta
poca o absolutamente nada de transformacin en condiciones naturales,
entonces a estos procariontes se les induce mediante algunos mtodos
existes a que sean competentes. Un claro ejemplo de este tipo de
competencia inducida es el procarionte Gram negativo Escherichia coli.
3. Menciona algunos mtodos para hacer clulas competentes

a) Tratamiento con iones de calcio: Cuando fue necesario encontrar un

mtodo para hacer competente a Escherichia coli, un organismo Gram
negativo, se descubri que cuando E. coli se trata con altas concentraciones
de iones de calcio y luego se mantiene en fro, se convierte en competente
con baja eficiencia.
b) Transferencia de ADN por electroporacin: La electroporacin es una
tcnica en el que las clulas se exponen a campos elctricos pulsados para
abrir pequeos poros en sus membranas. Cuando existen molculas de
ADN fuera de las clulas durante un pulso elctrico, pueden entrar en las
clulas a travs de estos poros. La electroporacin requiere un suministro
de potencias sofisticado, ya que los pulsos deben de ser controlados
cuidadosamente y duran tan slo milisegundos.
4. Por qu son tiles las bacterias competentes en las tcnicas de biologa
molecular?
Ests bacterias competentes son tiles en los mtodos empleados por la
biologa molecular para cruzar cepas de organismo que tienen diferentes
genotipos y fenotipos y buscar recombinantes, cabe mencionar que con
este tipo de bacterias es posible estudiar la recombinacin gentica y el
comportamiento del ADN dentro de la clula procarionte.
Bibliografa:
Michael T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker BROCK BIOLOGA DE
LOS MICROORGANISMOS 10a edicin, editorial. Pearson-Prentice Hall.

TRANSFORMACIN DE ESCHERICHIA COLI CON ADN PLASMIDICO

I. INTRODUCCIN
Las bacterias pueden transmitir la informacin gentica verticalmente
mediante la divisin celular y reparto equitativo del material gentico o
bien de forma horizontal entre clulas que coexisten
La transferencia horizontal de genes,
tambin conocida como
transferencia lateral de genes, es por tanto un proceso en el que el
organismo transfiere material gentico a otra clula no emparentada.
Este mecanismo se considera fundamental en la evolucin de los

procariotas.
Es el principal mecanismo por el cual las bacterias diseminan genes de
resistencia a los antibiticos.

1. Mecanismos
transferencia
material gentico
1.1.

Conjugacin

de Existen
tres
mecanismos
de
de transferencia horizontal de informacin
gentica:
la
conjugacin
la
transduccin y la transformacin.
La conjugacin es la transferencia de
material gentico a travs del contacto
clula-clula y mediado por factores de
fertilidad (plsmidos de fertilidad). Es un
proceso de transmisin sexual de
informacin gentica.
Encontrar informacin ms completa
sobre la conjugacin bacteriana en los
apuntes on line del Profesor D. E. Iaez

1.2.

Transduccin

La transduccin es el proceso de
transferencia de material gentico desde
una bacteria donadora a otra receptora
mediada por partculas de bacterifagos
(virus bacterianos) que contienen ADN
del genomio de la bacteria donadora.
Encontrar informacin ms completa
sobre la transduccin en los apuntes on
line del Profesor D. E. Iaez

1.3.Transformacin

La transformacin gentica es el
intercambio de material gentico
producido cuando una bacteria es capaz

de captar fragmentos de ADN de otra

bacteria que se encuentran dispersos en
el medio donde vive y expresar los genes
transferidos.
Solo algunas bacterias pueden ser
transformadas. Las que pueden serlo se
dice que son competentes.
Encontrar informacin ms completa
sobre la transformacin bacteriana en los
apuntes on line del Profesor D. E. Iaez
Estado de competencia
para la transformacin

Para que se produzca la transformacin

de una bacteria sta debe encontrarse en
un estado fisiolgico denominado de
competencia. Las clulas competentes
son aquellas susceptibles de ser
transformadas y, por lo tanto, tomar ADN
externo e introducirlo en su citoplasma.
El ADN asimilado de esta forma puede
expresar sus genes en la bacteria
transformada.

II. MTODOS
1.Material necesario
Dos tubos Eppendorf con 40 l de clulas
competentes de Escherichia coli
2 placas de medio LB agar sin ampicilina
2 placas de medio LB agar con ampicilia
1 tubo Eppendorf con 1-2 g de plsmido
pGEM-T que es portador de un gen de
resistencia a la ampilicila.

 Micropipetas de diferentes volmenes

(2,50,100 y 500 l)
Puntas de micropipetas estriles
Tubo con medio LB caldo
Bao a 42C
Incubador a 37C
Contenedor con hielo picado
Tubos Eppendorf estriles
2.

Caldo de LB: (Luria

Bertani broth)

Medio lquido para ensayos generales de

gentica molecular con Escherichia coli.
Composicin por Litro:
Peptona de casena

10g

Extracto de levadura

5g

ClNa

5g

pH 7.2

2.1. Preparacin de las

placas de LB y LB con
ampicilina

Para solidificar este medio (Agar LB) aadir

15 g de agar bacteriolgico por litro.
Autoclavar y repartir en placas
Para las placas de LB agar con ampicilina
proceder igual que en la anterior y una vez
autoclavado el medio, mantener a 50C

para aadir el antibitico (ampicilina).

Preparacin de la Ampicilina: Preparar una
solucin madre 1000x de ampicilina
(disolver 100mg en 1ml de agua destilada).
Esterilizar por filtracin.
Aadir la solucin de ampicilina (1 l por ml
de medio) al medio LB agar a 50C y
repartir en placas
3.Preparacin de las
clulas competentes de
Escherichia coli

La mayora de las clulas deben ser

manipuladas para que se vuelvan
competentes o capaces de tomar ADN de
medio.
Cultivar E. coli en medio LB
Cuando los cultivos estn en fase
exponencial se centrifugan.
Desechar el sobrenadante y lavar las
clulas repetidamente con solucin de
CaCl2 100mM
Suspender las clulas en un volumen 10
veces inferior al del cultivo
Mantener tubos Eppendorf en hielo
Repartir alcuotas en los tubos Eppendorf
preenfriados
Almacenar rpidamente las suspensiones
a -70C hasta que las clulas vayan a ser
transformadas

4. Tcnica de transformacin
1. Introducir dos tubos Eppendorf
estriles en hielo marcar uno como
+ADN y el otro como -ADN

3.

Aadir a cada tubo 40 l de la

suspensin de clulas competentes

4.

Aadir a la suspensin marcada como

+ADN 2 l de solucin de plsmido
pGEM-T (la otra suspensin se
somete a la misma manipulacin para
verificar al final del experimento que
las clulas competentes son sensibles
al antibitico).

5.

Incubar ambas suspensiones en hielo

durante 2 minutos

6.

Colocar ambas suspensiones en un

bao a 42C durante no mas de 60
segundos. Hemos sometido a las
clulas a un choque trmico durante el
cual se debe producir la entrada del
ADN plasmdico en las clulas
competentes.

7.

Enfriar las suspensiones en hielo

durante 2 minutos

8.

Aadir 400 l de caldo LB a ambos

tubos

9.

Incubar a 37C en agitacin a 150 rpm

durante 1 hora. Durante este periodo
se reinicia la actividad metablica y se
expresarn los genes introducidos.

5. Deteccin de transformantes
Diseminar 50 l de la suspensin de clulas
transformadas (ADN+) en ambos medios de
cultivo LB agar selectivo (con ampicilina) y
no selectivo.

2. Diseminar 50 l de la suspensin de
clulas no transformadas (ADN-) en
ambos medios de cultivo LB agar
selectivo (con ampicilina) y no
selectivo.

3. Incubar las placas a 37C durante 24

horas

III. Resultados
La aparicin de colonias en el medio
selectivo Agar LB con ampicilina indica las
clulas que han adquirido resistencia a la
ampicilina por transformacin con el
plsmido de resistencia

IV. AUTOEVALUACIN:
1. Qu es la transferencia horizontal de genes?
a. Es la transferencia de material gentico a la descendencia
b. Es la transferencia de material gentico a otra clula no
descendiente.
c. Aquella que ocurre durante la fase logartmica de crecimiento
2. Cmo pueden
transformacin?

obtenerse

clulas

competentes

a. Mediante la incubacin a bajas temperaturas

b. Mediante tratamiento con Cl2Ca
c. Mediante sonicacin

para

la

3. Qu es la transformacin gentica?
a. La transferencia de material gentico entre bacteria a travs de
bacteriogafos
b. La transferencia de material gentico por contacto fsico de las
clulas
c. La transferencia de materia gentico del medio