UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA DE INGENIERIA QUIMICA
LABORATORIO DE ANALISIS INSTRUMENTAL

Cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC)

Josu Snchez CI. 20077499
Yelibeth Ochoa CI. 20520989
RESUMEN
La cromatografa lquida de alta eficacia se utiliza para la separacin y anlisis cuantitativo
de una amplia variedad de mezclas, especialmente aquellas en las cuales sus componentes
no son voltiles o son trmicamente inestables. Esta tcnica se emple con el propsito de
separar y determinar cuantitativamente el fenol, tolueno y cafena presentes en una muestra
problema, se emple una columna C18, una fase mvil compuesta por metanol:agua y un
detector de absorcin UV/Visible. La identificacin de los compuestos presentes en la
muestra problema se realiz mediante una comparacin con los cromatogramas obtenidos
para una solucin estndar con los mismos componentes. Se optimiz el sistema
cromatogrfico a fin obtener la mejor separacin. Bajo estas condiciones se obtuvo el
cromatograma de la muestra problema, por el mtodo de normalizacin de reas, se calcul
la composicin de la misma obtenindose que la muestra problema present la siguiente
composicin en los compuestos estudiados: 0.1193 g/l de fenol, 0.0248 g/l de cafena y
1.0042 g/l de tolueno.
INTRDUCCION
En las cromatografas clsicas, en las que la fase mvil es un lquido que fluye a travs de
un slido por el efecto de la gravedad para alcanzar alta resolucin sera necesario emplear
columnas excesivamente largas, lo que se traducira en un desarrollo muy lento de los
cromatgramas. Estos inconvenientes se han resuelto con la cromatografa de alta
resolucin, en la que se trabaja con pequeas columnas, muy empaquetadas y forzando el
paso de la fase mvil mediante elevadas presiones, con lo que se consiguen separaciones
muy efectivas en un plazo muy corto de tiempo. [2]
En la cromatografa lquida los componentes de una mezcla son llevados a travs de una
fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase mvil lquida.
Las separaciones estn basadas en las diferencias de la velocidad de migracin entre los
componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su
interaccin con las fases.[4]

Un trmino importante en la cromatografa liquida es la elucin de los componentes de una

muestra, la cual comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase mvil a
travs de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. [1]
La cromatografa lquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid
Chromatografy) es el mtodo ms sofisticado y moderno de la cromatografa lquida, que
utiliza partculas de fase estacionaria para el interior de la columna con dimetros muy
pequeos entorno a 3-10 m, para aumentar la eficiencia, maximizando el tiempo y el rea
de contacto entre el analito y las fases minimizando as la altura del plato, el dimetro. De
esta manera se ha conseguido reducir el tamao de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10
mm de dimetro en la HPLC, y el tiempo necesario para la separacin de minutos a 1h. [4]
Esta tcnica es utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en
diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatgrafica. Adems, la alta presin permite usar relleno de tamao de partcula
reducido para lograr la separacin de componentes a flujos razonables. [5]
El proceso cromatogrfico puede ser considerado como un conjunto de fuerzas que
compiten de manera selectiva por un compuesto (analito o soluto) para, por una parte,
fijarlo al relleno de la columna o fase estacionaria, o llevarlo disuelto en los lquidos que
fluyen a travs de la columna o fase mvil. Los distintos tipos de fuerzas entre fase
estacionaria y solutos definen los distintos tipos de cromatografa. [3]
Tabla 1. Tipos de cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC). [3]

Dependiendo de la fase estacionaria, el mecanismo de separacin puede ser reparto,

adsorcin, tamao molecular (geles) e incluso cambio inico, aunque los mtodos ms
utilizados estn basados en reparto y adsorcin. [2]

En la cromatografa HPLC, se deben cumplir cuatro reglas bsica: Fase mvil y

estacionaria han de ser de polaridad opuesta, todos los solutos han de ser solubles en la fase
mvil (es decir, polaridad similar), todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella
(propagacin) y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migracin
diferencial).[1]
El esquema fundamental de un cromatgrafo de alta resolucin est constituido por un
deposito y un dispositivo de bombeo de la fase mvil que opera a elevada presin (hasta
500 atm.), un sistema de inyeccin de la muestra, columnas resistentes, generalmente e
acero inoxidable, rellenas de fase estacionaria, un detector y un sistema de registro grfico.
La columna y los detectores van introducidos en termostatos. Los detectores ms utilizados
en esta tcnica estn basados en absorciometra UV y en medida de ndices de refraccin,
siendo los cromatgramas obtenidos semejantes a los de cromatografa gaseosa con
detector diferencial. En la figura se muestra el instrumental de la cromatografa HPLC. . [2]

Figura 1. Instrumental de la cromatografa HPLC (High Performance Liquid

Chromatografy). [4]
El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la seal se transforma en una
grfica en funcin del tiempo, un cromatgramas, que consta de una serie de picos
simtricos. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto
cualitativa (posicin en el eje) como cuantitativamente (rea bajo los picos) los
componentes de la muestra. [3]
La cromatografa cuantitativa se basa en una comparacin de la altura o del rea del pico de
un analito con el de uno o ms estndares. Ambos parmetros varan linealmente con la
concentracin. La cromatografa cualitativa se basa en la comparacin de la posicin de los
picos (tiempos determinados de retencin) con cromatogramas estndares. [3]

La efectividad de la columna cromatogrfica para la separacin de solutos depende de las

velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. La eficiencia mxima para la
cromatografa lquida ocurre a muy bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la
eficiencia de la columna si se disminuye el tamao de la partcula del empaque de la
columna, se reduce la viscosidad de la fase mvil o se incrementa la temperatura.[3]
Los experimentos de optimizacin tienen como objetivo reducir el ensanchamiento de
banda o bien modificar las velocidades relativas de migracin de los componentes. Las
variables cinticas incrementan la altura de plato de una columna producen un
ensanchamiento de banda. Por otra parte, las velocidades de migracin son modificadas por
aquellas variables que afectan a los factores de capacidad y selectividad de la solucin. [5]
Se dice que la operacin es optima si tiene tiempo de anlisis corto, alta resolucin, alto
nmero de etapas y cada de presin mnima, para lograr estas condiciones se aplican
ciertos cambios como el de la polaridad de la fase mvil, de flujos, de pH, salinidad,
temperatura y viscosidad y por ultimo cuando nada de esto funciona se recurre al remplazo
de la columna. [1]
Se debe tener cuidados al aplicar cambios, por ejemplo no se puede disminuir y aumentar el
caudal de forma brusca porque se generan cambios de presin importantes. Al disminuir el
caudal se desplazan los picos en el tiempo. Una forma de mejorar la resolucin es aumentar
el nmero de platos tericos de la columna, este recurso es costoso en trminos de tiempo, a
no ser que se aumente mediante una reduccin de la atura de plato, lo cual se puede
conseguir variando el caudal, disminuyendo el tamao de partcula y reduciendo la
viscosidad del disolvente. [1]
La cromatografa HPLC, es especialmente adecuada para compuestos poco voltiles ,
termolbiles e inicos. Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como
aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenos,
plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y una gran variedad de
sustancias inorgnicas. [3]
Entre algunos de los ejemplos de la gran aplicacin de HPLC en la industria de alimentos
se tiene la deteccin y cuantificacin de cafena y teobromina que son alcaloides muy
importantes en el caf, t y el cacao, especialmente por su accin estimulante, en la
determinacin de azcares y determinacin cuantitativa de polisacridos como el almidn,
las dextrinas, los dextranos, el glucgeno, la inulina, la celulosa, las hemicelulosas, las
pectinas, as como sustancias mucilaginosas de algas marinas y las gomas vegetales. A
dems es usada en la separacin de triglicridos, para el estudio de aceites y grasas
adulteradas, y en la determinacin de contenido de Vitaminas A y sus precursores (
caroteno) en margarina y aceites de hgado por fase inversa, y del contenido en Vitamina D
en leche en polvo y cereales por fase normal. [3]

En la industria petrolera, es un mtodo importante, para analizar las composiciones de casi

todos los productos que van saliendo, del cracking, los tipos de gasolinas y separacin de
impurezas presentes en estas, los compuestos orgnicos destinados a sntesis, entre otras
tantas aplicaciones, por lo que se puede decir que es una tcnica muy verstil. [4]
Con la prctica de laboratorio se pretende conocer la aplicabilidad de la cromatografa
HPLC en la determinacin de una serie de compuestos aromticos especialmente la cafena
presente en una muestra problema, estudiar las diferencias moleculares y en propiedades
fisicoqumicas que se aprovechan para la separacin, as como tambin aprender a
seleccionar las condiciones de flujo y composicin de la fase mvil a usar de manera de
optimizar la separacin de los analitos en la columna cromatogrfica.
METODOLOJIA EXPERIMENTAL
El equipo fue manipulado por tcnico del laboratorio, el cual ya por adelantado haba
preparado el equipo y las soluciones a emplear con el fin de agilizar la prctica y dado la
complejidad que tiene el uso del cromatgrafo, el tcnico es el nico encargado de su
manipulacin.
RESULTADOS Y DISCUSION
1. Determinacin del tiempo muerto por inyeccin de K2Cr2 O7.
El K2Cr2O7 es una especie que no es retenida por la columna, por lo tanto a partir de la
inyeccin de una pequea muestra de esta especie es posible determinar el tiempo muerto, a
partir del cromatograma 1, se tiene que:

Donde Tm es el tiempo muerto.

Figura.1 Cromatograma de inyeccin de K2Cr2O7

2. Determinacin de tiempo de retencin ajustado, factor de retencin, factor de

retencin relativa, nmero de platos tericos y resolucin.
Estos parmetros se determinan para el cromatograma 2, el cual se muestra en la Figura.2

Figura.2 Cromatograma 2 Inyeccin de Mezcla Isocrtica.

De este cromatograma se extrae la siguiente informacin:
Tabla 1. Datos Extrados del Cromatograma para cada componente.
Compuesto
K2Cr2O7
Cafena
Fenol
Tolueno

Tiempo
(min)
1,414
1,983
2,301
5,676

de

retencin Ancho (cm)

0,4
0,30
0,5

Tiempo de retencin ajustado.

Por lo tanto para la Cafena

De igual manera se obtienen para los dems componentes.

Tabla 2. Tiempos de retencin ajustado.

Compuesto
A

Cafena

Tiempo
de Tiempo de retencin
retencin (min)
ajustado (min)
1,983
0,569

B
C

Fenol
Tolueno

2,301
5,676

0,887
4,262

Factor de Retencin.

Para la Cafena:

De igual manera se obtienen para los dems componentes.

Tabla 3. Factor de retencin para cada unos de los componentes.
Compuesto
Cafena
Fenol
Tolueno

Factor de retencin
K
0,402
0,627
3,014

Factor de Retencin relativa.

Donde B es el soluto que eluye de ltimo entre dos solutos.

Para Cafena y Fenol:

De igual manera se obtienen para los dems componentes:

Tabla 4. Factor de retencin relativa para cada pareja de solutos adyacentes.
Componentes

Factor de retencin
relativa

Cafena-Fenol

1,559

Fenol- Tolueno

4,805

Nmero de Platos tericos.

(

Para la Cafena:
(

De igual manera se obtienen para los dems componentes.

Tabla 5. Nmero de platos tericos para cada componente.
Compuesto
Cafena
Fenol
Tolueno

Nmero de
Platos
393,2
941,3
2061,9

Resolucin.

Para Cafena y Fenol:

De igual manera se obtienen para los dems componentes:

Tabla 6. Resolucin para cada pareja de solutos adyacentes.
Componentes
Cafena-Fenol
Fenol- Tolueno

Resolucin
0,91
8,44

Resumen de Resultados para el cromatograma 2.

Tabla 7. Resultados para el cromatograma 2.

Compuesto Tiempo de retencin Factor de Nmero

ajustado (min)
retencin de Platos
Cafena

0,569

0,402

393,2

Fenol

0,887

0,627

941,3

Tolueno

4,262

3,014

2061,9

Componentes

Cafena-Fenol

Factor de
relativa

retencin
Resolucin

1,559

0,91

Fenol- Tolueno 4,805

8,44

El mismo procedimiento fue aplicado para el cromatograma 3,4 y 5, obtenindose los

siguientes resultados.
Cromatograma 3.

Figura.3 Cromatograma
(70:30)(80:20)

Inyeccin

de

Mezcla

Resumen de Resultados para el cromatograma 3.

Gradiente.

FM

MeOH:H2O

Tabla 8. Resultados para el cromatograma 3.

Compuesto

Tiempo de retencin Factor de Nmero

ajustado (min)
retencin de Platos

Cafena

0,573

0,405

515,7

Fenol

0,873

0,617

929,8

Tolueno

3,924

2,775

2849,4

Componentes

Factor de retencin relativa

Resolucin

Cafena-Fenol

1,524

0,92

Fenol- Tolueno

4,495

8,72

Cromatograma 4.

Figura.4 Cromatograma 4 Inyeccin de Mezcla Gradiente. FM MeOH:H2O (70:30)

Resumen de Resultados para el cromatograma 4.

Tabla 9. Resultados para el cromatograma 4.
Compuesto

Tiempo
de
ajustado (min)

retencin Factor de Nmero

retencin de Platos

Cafena

0,575

0,407

516,7

Fenol

0,879

0,622

2103,1

Tolueno

2,746

1,942

4430,2

Componentes

Factor de retencin relativa

Resolucin

Cafena-Fenol

1,529

1,11

Fenol- Tolueno

3,124

8,30

Cromatograma 5.

Figura. 5 Cromatograma 5.Inyeccin de muestra problema.

Resumen de Resultados para el cromatograma 5.

Tabla 10. Resultados para el cromatograma 5.
Compuesto

Tiempo de retencin Factor de Nmero

ajustado (min)
retencin de Platos

Cafena

0,571

0,404

700,5

Fenol

0,876

0,620

1342,5

Tolueno

2,68

1,895

6704,3

Componentes

Factor de retencin relativa

Resolucin

Cafena-Fenol

1,534

1,11

Fenol- Tolueno

3,059

8,02

3. Determinacin de la concentracin de la muestra problema.

Siguiendo el procedimiento que se describe a continuacin para determinar la
concentracin de los estndares.
Para la preparacin de estndares debe pesar aproximadamente 0,6500 g de Tolueno, 0,156
g de Fenol y 0,0625 g de Cafena, y disolver con Etanol en un baln aforado de 50 mL y
diluir a volumen. Tendr solo tres estndares para la elaboracin de la curva de calibracin.
Para el primer estndar, tomar un volumen de 2 mL de la solucin anterior en un baln
aforado de 25 mL y diluir a volumen con fase mvil. Para el segundo estndar debe tomar
un volumen de 1 mL de la solucin inicial, trasvasar a un baln aforado de 25 mL y diluir a
volumen con fase mvil. Tendr solo tres estndares para la elaboracin de la curva de
calibracin.
Para el tercer estndar debe tomar un volumen de 0,5 mL de la solucin inicial, trasvasar a
un baln aforado de 25 mL y diluir a volumen con fase mvil.
Siguiendo las reglas de dilucin y toma de alcuotas se determina la concentracin de
patrn.

Para el Tolueno:

Del baln de 50ml se toman 2ml y se diluye en un baln aforado de 25ml.

Para el Fenol:

Del baln de 50ml se toman 1ml y se diluye en un baln aforado de 25ml.

Para la Cafena:

Del baln de 50ml se toman 0,5 ml y se diluye en un baln aforado de 25ml.

A partir del cromatografo 4, con los valores de rea correspondiente al pico para cada
componente se calcula el factor de respuesta.
Tabla 11. Datos del Cromatograma 4
Componentes
Cafena
Fenol
Tolueno

Pico
1
2
3

rea
3320,33374
359,51184
1466,08813

A partir del cromatografo 5, con los valores de rea correspondiente al pico para cada
componente se calcula la cantidad inyectada de cada componente.
Tabla 12. Datos del Cromatograma 5
Componentes
Cafena
Fenol
Tolueno

Pico
1
2
3

rea
3295,03125
343,83981
1415,76111

El anlisis por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) aplicada a una muestra de
Fenol, Cafena y Tolueno, se realiz en una columna C18 (qumicamente enlazada) y una
fase mvil compuesta por una mezcla de metanol-agua; por lo que se est en presencia de
una cromatografa en fase reversa. As que, el primer compuesto en eluir es el que presenta
mayor afinidad a la fase mvil esto es, el ms polar, cafena luego el fenol y por ltimo el
tolueno.

Figura 1 . Estructura del fenol, tolueno y cafena respectivamente.

En los cromatogramas obtenidos se emple como sistema de deteccin, luz UV/Visible,
porque los tres compuestos estudiados absorben a longitudes de onda cercanas a 254nm.
La identificacin de los compuestos presentes en la muestra problema se realiz mediante
una comparacin con los cromatogramas obtenidos para una solucin estndar con los
mismos componentes, encontrndose que los factores de retencin de cada componente
estudiado son: para el fenol 2880.7 l/g, la cafena 132813.35 l/g y el tolueno 1409.70 l/g.
El sistema cromatogrfico se optimiz a partir de un sistema de elucin por gradiente, en
el cual la composicin de la fase mvil cambia en el tiempo. As que para optimizar el
sistema En primer lugar, se aument el flujo de fase mvil desde 0,8 a 1,5ml/min (Figura 5
Anexa), resultando que el componente ms afn a la fase estacionaria (tolueno) eluye en un
menor tiempo, mejorando el sistema cromatogrfico al disminuir el tiempo de anlisis. En
segundo lugar, se modific la composicin de la fase mvil, de una relacin metanol:agua
de 70:30 a 80:20, por lo que aumenta el poder eluyente de la fase mvil, disminuyendo
una vez ms el tiempo al cual eluye la muestra menos polar (Figura 3). Bajo estas
condiciones se obtuvo un nuevo cromatograma a partir del cual, por el mtodo de
normalizacin de reas, se calcul la composicin de la muestra problema. Es importante
destacar la eficiencia del mtodo y su importancia a nivel industrial ya que este tipo de
cromatografa es muy utilizada para anlisis en control de calidad en diferentes reas como
alimentos, frmacos, contaminantes y otros.

CONCLUSION

Es posible separar compuestos aromticos, tales como tolueno, fenol y cafena, de

una muestra por medio de cromatografa liquida de alta precisin (HPLC).

La separacin de los analitos por cromatografa HPLC puede optimizarse mediante

el uso de una elucin en gradiente, variando el flujo y la composicin de la fase
mvil.

Para el sistema estudiado se alcanz una mejor separacin en un menor tiempo, con
un mayor nmero de etapas y con menor altura de la etapa utilizando una mezcla
metanol: agua 80:20 y un flujo de 1,5ml/min.

La diferencia en la polaridad de las molculas de fenol, tolueno y cafena debido a

grupos sustituyentes en su estructura aromtica, permite que puedan ser separados
mediante una cromatografa liquida HPLC.

En la separacin de aromticos como fenol, tolueno y cafena por cromatografa

liquida es posible utilizar un detector de absorcin de UV/visible, ya que dichas
molculas absorben a longitudes de onda cercana a 259nm gracias a los grupos
insaturados que contienen dichas molculas.

La cromatografa liquida de alta precisin (HPLC) tiene mltiples aplicaciones en la

industria qumica, farmacutica, en medicina para control de calidad de los
productos, para caracterizacin de efluentes, para la determinacin de gran cantidad
de compuestos presentes en la sangre, entre muchas ms.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] Skoog y Holler. (2001) Principios de Anlisis Instrumental. McGraw-Hill
Interamenricana de Espaa, S.A.U. Madrid, Espaa. Capitulo 26.
[2] http://elac.uca.edu.ni/pd/karlschen/files/745/2416/Cromatografia.pdf
[3]http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_teo_y_apli
caciones.pdf
[4]http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_principios
_y_aplicaciones.pdf
[5] http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/trabajos09-10/trabajo4.pdf