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FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
Directora:
Prof. Dra. Coralia Osorio Roa
LISTA DE ABREVIATURAS
ABTS
APCI
CC
Cromatografa en columna
CCC
CCD
CP
Cromatografa en papel
DPPH
2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
EM
Espectro de masas
EPR
ESI
Ionizacin Electrospray
HPLC
HPLC-DAD
HPLC-EM
RMN
TOF
Tiempo de vuelo
CONTENIDO
Pgina
RESUMEN
INTRODUCCIN
1
1.1
1.2
ANTOCIANINAS
1.2.1 Generalidades.
11
16
19
21
23
30
35
36
METODOLOGA
41
41
41
42
43
44
44
45
TEAC-espectroscopa UV-Vis.
2.5.3 Determinacin de la actividad Antioxidante frente al radical
45
46
47
48
49
RESULTADOS Y DISCUSIN
49
59
59
61
65
CONCLUSIONES
78
BIBLIOGRAFIA
84
LISTA DE TABLAS
Pagina
Tabla 1. Composicin antocinica de algunas frutas tropicales
14
15
51
55
57
Tabla 6. Actividad antioxidante de los ERAS de las cuatro frutas frente a los radicales ABTS
y DPPH
60
Tabla 7. Constantes (K) de velocidad de atrapamiento de los radicales libres de los ARE de
las cuatro frutas (expresadas en unidades arbitrarias (a.u)) por los mtodos ABTS y
DPPH
65
69
70
Tabla 10. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de
almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de mora
71
Tabla 11. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de
almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de uva de rbol
72
LISTA DE FIGURAS
Pagina
Figura 1. Mora (Rubus megalococcus Focke)
Figura 4. (a). Estructura bsica de las antocianidinas (b). Estructura de los monosacridos
ms comunes encontrados en las estructuras de las antocianinas
10
11
12
17
21
Figura 10. Espectros UV-Vis de las antocianinas aciladas y 3,5-glucosiladas (lnea continua);
no aciladas y 3-glucosiladas (lnea discontinua)
22
24
27
28
Figura 14. (a) Reaccin del DPPH con el mtodo del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (b)
Esquema de reaccin entre 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y Trolox.
33
Figura 15. (a) Formacin del radical ABTS (b) reaccin del catin radical ABTS+ con
compuestos fenlicos.
Figura 16. Modelo de color CIELAB
34
38
Figura 17. Anlisis por HPLC de los ERA de a) Coral, b) Motiln. La identificacin de cada
pico corresponde con la tabla
50
53
53
Figura 20. Anlisis por HPLC del ERA de mora pequea. La identificacin de cada pico
corresponde con la tabla 4.
55
Figura 21.Anlisis por HPLC del ERA de Uva de rbol. La identificacin de cada pico
corresponde con la tabla 5
57
Figura 22. Estructuras qumicas de los compuestos encontrados en las cuatro frutas. (1)
Delfinidina-3-O-glucopiranosa. (2) Delfinidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil-glucopiransido). (3) Cianidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido.
(4) Petunidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido(5) Cianidina 3-O-glucopiranosido
59
Figura 23. Set de espectros EPR individuales del ARE de Motiln registrados a diferentes
tiempos de reaccin en presencia de los radicales libres (a) ABTS y (b) DPPH. 62
Figura 24. Concentracin relativa de a) ABTS y b) DPPH en presencia de los extractos de las
cuatro frutas. Referencia * = solucin de radical libre sin antioxidante
64
Figura 25. Espectros UV-Vis de los ERA (1mg/10mL) de las cuatro frutas estudiadas
a pH 1.5
66
Figura 26. (a)Variacin del color en los ERAS de las frutas a diferentes valores de pH en
tiempo=0. (a) Motiln (b) Coral. (c). Uva. (d). Mora
67
Figura 27. Evaluacin del color durante el almacenamiento de los extractos ARE a pH 1.5.
(a).Motiln, (b). Coral, (c), Uva (d) Mora
73
Figura 28. Cambios en a: claridad (L*); b: el croma (C*ab) y c: el tono (hab) de los extractos
crudos con respecto al pH.
76
AGRADECIMIENTOS
Al Profesor Dr. Francisco Heredia y a la Profesora Dra. Lourdes Gonzlez Miret del
grupo Color y Calidad de Alimentos, del Departamento de Farmacia de la
Universidad de Sevilla (Espaa) por la valiosa colaboracin y asesora en las medidas
objetivas de color.
RESUMEN
Colombia produce una amplia gama de frutas tropicales, de las cuales existen muy
pocos estudios qumicos. La investigacin en el campo de los pigmentos naturales
provenientes de frutas, permite establecer el potencial de ellas como alimento con
propiedades biofuncionales y el desarrollo de productos con valor agregado que
puedan ser usados como colorantes naturales. En este trabajo se realiz el anlisis
cualitativo y cuantitativo de los pigmentos antocianicos en cuatro frutas tropicales
colombianas: uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery), coral
(Hyeronima macrocarpa Mull. Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y
motiln (Hyeronima macrocarpa Mull. Arg). Se obtuvieron los extractos
enriquecidos en antocianinas (AREs) por adsorcin selectiva sobre Amberlita XAD-7
del extracto metanlico de las frutas. Estos extractos se analizaron por cromatografa
lquida acoplada a un detector de arreglo de diodos (LC-DAD) y cromatografa
lquida acoplada a espectrometra de masas con interfase electrospray (LC/MS-ESI).
Estos anlisis junto con la coinyeccin con patrones permitieron elucidar la estructura
de la mayora de los compuestos. La cuantificacin se realiz mediante el mtodo de
estndar externo.
Con estos resultados se comprob que las frutas estudiadas son una fuente
promisoria de pigmentos naturales, siendo ms interesantes el motiln y la uva de
rbol debido a su contenido de antocianinas, actividad antioxidante y estabilidad del
color de los extractos.
INTRODUCCION
Entre estos compuestos, las antocianinas son pigmentos naturales que se clasifican
dentro del grupo de los flavonoides. Se encuentran ampliamente distribuidas en la
naturaleza y son responsables de los colores rojo, violeta y azul de frutas, bayas y
flores. En las plantas la principal funcin que cumplen es la de atraer seres vivos
(principalmente insectos y pjaros) para propsitos de polinizacin y dispersin de
semillas2. Estos compuestos polifenlicos son solubles en agua, lo cual facilita su
incorporacin en una gran variedad de sistemas alimenticios acuosos.
efectivas para atrapar especies reactivas del oxgeno (ROS), adems de inhibir la
oxidacin de lipoprotenas y la agregacin de plaquetas.
y motiln (Hyeronima
1.1
Esta especie pertenece al gnero Rubus, el cual comprende unas 250 especies que se
distribuyen en todo el mundo. Las frutas de esta especie son conocidas por ser ricas
en vitaminas A, B y C, y se afirma que las races y las hojas tienen propiedades
medicinales10. Recientes investigaciones han reportado la presencia de antocianinas
en la fresa y en la mora en proporciones de 6 mg/kg y 508 mg/kg de cianidina-3glucsido, respectivamente
11 , 12
antocianinas son responsables del color rojo de dichas frutas en un espectro visible
max=506 nm,
ANTOCIANINAS
10
15
11
La fenilalanina amonio liasa (PAL), primera enzima en la ruta, juega un papel central
en dirigir la sntesis hacia metabolitos secundarios y por ello ha sido extensamente
estudiada. Un estudio realizado por Aoki et al27., Demostr que la actividad PAL en
frutos de fresa maduros es mucho mayor que en frutos verdes. As, se encontr una
correlacin muy estrecha entre la actividad de PAL y la concentracin de
antocianinas, que se incrementa durante la maduracin28.
12
cantidades
para
13
Jussara
Nombre Cientfico
Pourouma cecropiifolia
Malphigia emarginata
Syzygium cumini
Euterpe edulis
Antocianina
Dp-3-O--glucopiransido
Cy-3-O--glucopiransido
Cy3-O--(malonil) glucopiransido36
Cy-3-ramnsido, Pn-3-ramnsido
Dp-3-galactpiranosido,Pt-3-galactopiransido
Dp-3-(6-acetil) galactopiransido.
Pt-3-(6-acetil) galactopiransido, Dp-3-(6acetil) glucsido, Pt-3-(6 succinil) ramnsido,
Pn-3-(6succinil) ramnsido
Dp-3-5, diglucsido, Cy-diglucsido, Ptdiglucsido, Pn-diglucsido, Mv-diglucsido-3sambubisido, Cy-3-glucsido, Cy-3-rutinsido,
Pg-3-glucsido,
Pg-3-rutinsido,
Cy
3ramnsido.
Dp-3-O--glucopiransido, Cy-3-O-glucopiransido, Pt-3-O--glucopiransido
Pg-3-O--glucopiransido, Pn-3-O-glucopiransido, Mv-3-O--glucopiransido37
Guajiru
Chrysobalanus icaco
Bacuau
Eugenia umbelliflora
Manzana
estrella
Surinam cherry
Chrysophyllum
Cainito
Eugenia uniflora
Cy-3-O--glucopiransido
Cy-O--glucopiransido
Cy-3-O--glucopiransido
Jaboticaba
Myrciaria Cauliflora
Dp-3-O--glucopiransido38
Mango
Chirimoya
Mangifera indica
Annona cherimolia
Mill.
zapote
Calocarpum zapota
Cy-3-O--glucopiransido
Pg-3-glucsido,
Pg-3-rutinsido,
ramnsido.Error!
Bookmark
Cy-3-
not
defined.
corozo
Bactris guineensis
Cy-3-sambubisido,
cy-3-glucsido,
cy-3rutinsido, Pn-3-glucsido, Pn-3-rutinsido, Cy3-(6-O-malonil) glucsido.39
14
Nombre comn
Vaccinium
uliginosum L.
Rubus occidental L.
V. parvifolium
R. nigrum cv
Sambucus nigra
V. vinifera
Citrus sinensis
Arndano alpino
Frambuesa negra
Arandano rojo
Grosella negra
Cauco negro
Uva de vid
Naranjo dulce
Mv: malvidina, Cy: Cianidina, glu: Glucosa
Concentracin
(mg/ 100g fruta )
256
Estndar
Referencia
Mv-3-glu
Andersen (1987)42
627
34
411
200-1000
30-750
200
Cy-3-glu
Cy-3-gl
Cy-3-glu
Cy-3-glu
Cy-3-glu
Cy-3-glu
La metodologa para el estudio de los pigmentos de las cuatro frutas: uva de rbol (),
coral (Hyeronima macrocarpa Mull.Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke)
y motiln Hyeronima macrocarpa Mull.Arg), fue
Para la obtencin de la concentracin de antocianinas (Tabla 2), se utiliza la frmula
de pH diferencial:
15
A= (A vis-max A 700)
pH1
En donde A
vis-max
(A
vis-max
A 700)
pH 4.5
De acuerdo con su estructura, el color de las antocianinas vara segn los grupos que
se encuentren unidos a ella como hidroxilo, metoxilo, azcares azucares acilados.
As por ejemplo el aumento nmero de hidroxilos en el anillo B de la antocianidina
causa un desplazamiento batocrmico en la longitud de onda de mxima absorcin de
las antocianinas, en el caso de la pelargonidina se observa un cambio de color desde
el naranja ( mx. 520 nm) hasta la delfinidina azul-violeta ( mx. 545 nm).48 Por
otro lado, la glicosilacin y la acilacin de los azcares tambin aumentan la
estabilidad.49
16
17
se limita a alimentos cidos con pH inferior a 3.5 51, 52. La prdida de color a medida
que el pH aumenta, puede ser evaluada registrando el espectro de absorcin del
pigmento con un espectrofotmetro. En la figura 8, en el espectro de absorcin de
cianidina-3-ramnoglucsido se observa una disminucin en el espectro a 510 nm a
medida que el pH aumenta, lo que indica que hay una prdida del color rojo,
existiendo un equilibrio entre las dos formas de la antocianina (catin flavilio y base
carbinol)53.
18
Degenhardt et al
58
19
20
21
22
23
24
La adquisicin mediante un QqQ ofrece una gran versatilidad dependiendo del modo
en que opera cada uno de los dos cuadrupolos (Q1 y Q2). Cada uno de estos modos
de adquisicin presenta unas caractersticas que lo hacen idneo para un objetivo
concreto.
26
Otros instrumentos que tienen los analizadores de tiempo de vuelo acoplado trampa
de iones como MS-IT-TOF permiten obtener fragmentos de hasta MSn. El uso de la
trampa de iones permite que los iones sean atrapados y fragmentados para
posteriormente pasar al de tiempo de vuelo en donde se separan segn su relacin
masa carga en un tiempo determinado dentro del TOF (Figura 13)73.
27
28
pelargonidina
3-O--glucopiransido,
peonidina
3-O--
29
1.3
Los radicales libres son los responsables de los daos causados sobre los lpidos y
protenas por medio del fenmeno de la oxidacin, el cual compromete la integridad
del ADN de los seres humanos y son ampliamente reconocidos como una de las
causas de enfermedades degenerativas como el cncer 79 . Los antioxidantes son
sirven como inhibidores de los procesos neoplsicos y protegen a las clulas del
proceso corrosivo de la oxidacin80.
30
Existen varios mtodos colorimtricos muy usados hoy en da, entre estos se pueden
mencionar los siguientes:
31
El mtodo del DPPH se basa en la reduccin del radical DPPH por los antioxidantes
de la muestra. El radical es estable y tiene una coloracin prpura que se pierde
progresivamente cuando se aade la muestra conteniendo sustancias antioxidantes
(Figura 14a). La decoloracin del radical se determina a una de 515 nm hasta
alcanzar el equilibrio (Figura 14 b). Entre las ventajas de usar este mtodo, se tiene
que el ensayo DPPH es un mtodo rpido y sencillo y que no requiere de un
equipamiento sofisticado. La desventaja que tiene este mtodo es que slo puede
disolverse en medio orgnico y en algunos casos la interpretacin resulta complicada,
ya que algunos antioxidantes pueden causar interferencias si poseen un espectro de
absorcin similar al DPPH83.
(a)
32
(b)
Figura
33
Figura 15 (a) Formacin del radical ABTS (b) reaccin del catin radical ABTS+
con compuestos fenlicos. 86
34
1.4
Los radicales libres son muy reactivos ya que tienden a captar un electrn de
molculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad electroqumica. Una vez que
ste ha conseguido sustraer el electrn que necesita, la molcula estable que se lo
cede se convierte a su vez en un radical libre por quedar con un electrn desapareado
inicindose as una verdadera reaccin en cadena que produce alteraciones en las
clulas y puede conducir a diversas enfermedades degenerativas.
La espectroscopa EPR mide las diferencias de energa entre los estados originados
por el desdoblamiento que se genera al poner un sistema con electrones desapareados
en un campo magntico externo (efecto Zeeman). La diferencia de energas entre dos
estados ser de la forma g B HZ, donde g es el factor de Land, B es el magnetn de
Bohr y H el campo magntico aplicado. La denominada condicin de resonancia para
obtener en el espectro un pico de resonancia es:
h v = gj B HZ
Y este campo es HZ ser el campo de resonancia. De aqu puede despejarse el factor
de Lande g. Este factor g puede llegar a ser muy til a la hora de identificar la
muestra88.
35
El color es una respuesta mental al estmulo producido en la retina por una radiacin
luminosa visible, pero la medida de este estmulo depende de las condiciones que lo
rodean. As, para lograr unificar dichas medidas se han definido unas condiciones
36
El estmulo cromtico est compuesto por tres sensaciones bien diferenciadas, que
dan al color su carcter tridimensional: matiz o tono, luminosidad y saturacin o
pureza. El matiz o tono es la propiedad por la cual un color se identifica como rojo,
azul, etc., y est relacionado con las diferencias de absorbancia de la energa radiante
a diferentes longitudes de onda; es decir, es el atributo cualitativo del color. La
luminosidad es el atributo en virtud del cual los colores pueden considerarse
equivalentes a alguno de los miembros de la escala de grises, entre el negro y el
blanco. Es una medida relativa de la luz reflejada frente a la absorbida. La saturacin
o pureza se define como la proporcin de luz cromtica en la percepcin total, o
como el grado de diferencia entre el punto de color en cuestin y el correspondiente
al punto gris de la misma luminosidad.
Estos tres atributos, tono, luminosidad y saturacin definen cualquier color. Esta
consideracin tridimensional del color es el fundamento de la teora tricromtica. Las
leyes experimentales de la igualacin del color se resumen en un principio conocido
como generalizacin tricromtica.93
37
La escala en la cual se mide el color basada en estos aspectos, esta basada en la teora
de Hering en la cual los conos del ojo estn codificados para recibir seales de luzoscuridad, rojo-verde y amarillo-azul, segn lo cual un color no puede ser al tiempo
rojo y verde. En este modelo se representan en coordenadas rectangulares las
expresiones: claridad (L*), croma (C*ab), matiz o tono (hab) y a*b*. As se fija un eje
a cuyos extremos a y a sern colores rojo y verde respectivamente. De la misma
manera el eje b tendr extremos b y b azul y amarillo. La luminosidad se
representa a lo largo de una coordenada L que es perpendicular a las dos anteriores y
sus extremos son el blanco y el negro puro. El matiz se mide como el ngulo que va
en sentido opuesto a las manecillas del reloj, partiendo de +a. (Figura 16).
38
El color, puede ser expresado como un punto en un espacio vectorial definido por las
coordenadas angulares L*, a* y b* por sus coordenadas angulares, croma (C*ab ) y
tono (h ab), definidos por a* y b* as:
h ab = tan-1 (b/a)
C ab = (a2 + b2)1/2
Por lo tanto un color que se encuentre ms cercano al origen de coordenadas
presentar un color apagado mientras que uno ms lejano presentar mayor vividez.
Las antocianinas poseen coloraciones rojizas las cuales se encuentran con ngulos de
matiz desde 0 hasta 60, las de matices cercanos o menores que 0 poseen
coloraciones violeta y las cercanas a 60 tienen coloraciones anaranjadas. Por medio
del modelo CIELAB se han caracterizado y comparado los colores de extractos y
compuestos puros de antocianinas, por ejemplo, en derivados de pelargonidina 96 ,
derivados de malvidina-3-glucsido, 97 antocianinas en flores, 98 antocianinas en
rbano y papa99. Estos estudios demuestran que aplicar sistemas colorimtricos de
espacio uniforme es de gran utilidad en la caracterizacin de las propiedades del color
de los pigmentos.
En un
100
40
METODOLOGA
La metodologa para el estudio de los pigmentos de las cuatro frutas: uva de rbol
(Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery), coral (Hyeronima macrocarpa Mull.Arg),
mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y motiln Hyeronima macrocarpa
Mull.Arg), fue desarrollada en tres etapas: primero la obtencin del extracto crudo
enriquecido en antocianinas, seguido por la identificacin y cuantificacin de los
pigmentos tipo antocianina, luego evaluacin de la actividad antioxidante de los
extractos crudos; y finalmente el estudio de la estabilidad del color a diferentes pHs.
2.1
MATERIAL VEGETAL
Las frutas tropicales uva de rbol y coral objeto de este estudio se recolectaron en la
zona sur occidental del pas en Timbio (Cauca), el motiln en la Unin (Nario) y la
mora pequea en el Hatillo Albana (Santander) y se seleccionaron de acuerdo a los
parmetros de madurez establecidos por su color. La identificacin taxonmica de las
muestras de estos frutos silvestres se realiz en el Instituto de Ciencias Naturales de
la Universidad Nacional de Colombia de la siguiente manera: uva de rbol (Myrciaria
aff cauliflora (Mart.)D.Bery) (COL 531920),
Para la mora pequea, se tom la fruta entera (295 g), de la uva de rbol solo la
cscara (134 g), y en el motiln y el coral se us la fruta sin semilla (98 y 123 g
41
Chemical Co., Milwaukee, WI) de 80 x 4 cm. La columna se lav con agua, y los
compuestos adsorbidos se eluyeron con 1 L de metanol/cido actico (19:1, v / v), de
acuerdo con el procedimiento descrito por Degenhardt et al58.
Japn).
Las
fracciones
se
eluyeron
con
metanol/agua/TFA
2.3
ANLISIS
POR
CROMATOGRAFA
LQUIDA
DE
ALTA
EFICIENCIA (HPLC-DAD).
Se us un cromatgrafo Agilent Technologies serie 1200, detector DAD (barrido de
200 nm-700 nm), con una columna Zorbax-SB C18 5m 4.6 x 250mm (Phenomenex
USA). Como eluyente, se usaron los solventes acetonitrilo/agua/cido frmico en
42
Los extractos en conjunto con los estndares, se analizaron con el fin de confirmar la
presencia de las antocianinas; las antocianinas: delfinidina 3-glucsido y petunidina
3-rutinsido provenientes de Transmit (Marburg, Alemania), cianidina 3-glucsido y
cianidina 3-rutinsido de Sigma (Aldrich); y la antocianina cianidina 3-rutinosido
aislada y purificada de la fruta tomate de rbol101.
2.4
Tanto los ERA como las fracciones obtenidas se disolvieron en metanol (1mg/mL), y
se analizaron utilizando un cromatgrafo lquido acoplado a un espectrmetro de
masas Shimadzu LCMS-IT-TOF (Kyoto, Japn). Para la separacin cromatogrfica,
se utiliz una columna Luna RP-18 5m (150 x 2,0mm d.i., Phenomenex). Como
eluyente se uso el solvente A compuesto de acetonitrilo/agua/ cido frmico 3:87:10,
43
2.5
44
2.5.2 Determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo TEACespectroscopa UV-Vis. El anlisis espectrofotomtrico TEAC est basado en la
habilidad del antioxidante para capturar el catin radical ABTS.+. El ensayo se llev a
cabo de acuerdo con el mtodo desarrollado por Re, et al. 86 El catin radical ABTS. +
se produjo por la reaccin entre ABTS (7mM) en agua y persulfato de potasio (2,45
mM) en 10 ml de agua destilada, manteniendo la solucin en la oscuridad a
temperatura ambiente por 12 horas (solucin stock). Luego esta solucin se diluy en
metanol para obtener la de trabajo (0.18 mM), la cual se ajust a una absorbancia de
0.7 0.2 a 734 nm. Se prepararon soluciones patrn de Trolox (Fluka) Chemie
GmbM (Steinheim, Suiza) en etanol en concentraciones de 0.5, 1, 1.5, 2 y 2.5 mM.
Para la determinacin de la actividad antioxidante, a 1ml de la solucin de trabajo se
le adicionaron 10 L de cada muestra y se midi la absorbancia a 734 nm
exactamente a los 6 minutos. Para tal fin se utiliz un espectrofotmetro UV-Vis
Thermo Scientific evolution 300. Se uso cido ascrbico (Merck, Dam stadt
Alemania) como compuesto de referencia. Se interpolaron los datos en la curva y se
expresaron como TEAC (Trolox-equivalent antioxidante capacity). El valor TEAC se
define como el nmero de milimoles de Trolox que tienen el mismo porcentaje de
inhibicin que un gramo de fruta (peso seco).
2.5.3 Determinacin de la actividad Antioxidante frente al radical DPPH por
espectroscopa UV-Vis. El DPPH es un radical estable de color violeta, cuya
absorbancia disminuye al ser reducido por un antioxidante (AH):
DPPH+AH
DPPH- H + A
45
de absorbancia a un tiempo cero y despus cada diez segundos hasta obtener el valor
inicial reducido a la mitad. La actividad antioxidante se expres como EC50 valor que
expresa la concentracin de la muestra necesaria para inhibir el 50% de los radicales
libres DPPH (EC50 = concentracin de la prueba en estado de equilibrio).
2.6
POR
46
Donde, DIEPR
respectivamente.
Tomando en cuenta estudios previos.103 Se asumi que el modelo cintico para estas
reacciones era de orden 2. As para determinar la constante de velocidad, la expresin
(1/Ct 1/Co) se grafic versus tiempo (min) y se realiz el anlisis de regresin lineal
de acuerdo con la ecuacin:
(1/Ct) (1/Co) = Kt
2.7
47
Los parmetros CIELAB (L*, a*, b*) de los extractos, se determinaron de acuerdo
con las especificaciones CIE usando el software CromaLab (Heredia et al, 200495).
Las diferencias de color E*ab se calcularon entre el pH inicial (pH 1.5) y la muestra
despus del tratamiento (incremento de pH).
2.8
ANLISIS ESTADSTICO
48
RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1
Coral y Motiln. Los perfiles obtenidos para las dos frutas, por HPLC-DAD se
presentan en la Figura 17 Con base en el patrn de fragmentacin se identificaron
cuatro antocianinas: delfinidina-3-rutinsido, petunidina-3-rutinsido, cianidina-3rutinsido y delfinidina-3-glucsido (tabla 3).
49
Figura 17. Anlisis por HPLC de los ERA de a) Coral, b) Motiln. La identificacin de cada pico corresponde con la tabla
50
Pico
No
Tiempo de
Tiempo de
retencin
retencin
Motiln(min)
Coral(min)
HPLC-ESI
HPLC-ESI/
/MS-MS
MS-MS
Frmula
Ion molecular
Experimental
Masa exacta
M+ (m/z)
(m/z)
(m/z)
465.1033
303 [M-162] + d
611.1612
465[M-146] + /303[M146-162] + e
287[M-162-146] + f
Iones fragmento
Identificacin
9,1
8,3
C21H21O12
465.0906
10,6
9,5
C27H31O16
611.1623
14,4
13,8
C27H31O15
595.1636
595.1663
17,9
17,4
C28H33O16
625.1599
625.1768
611/317[M-162-146] +
(mg/g fruta)
(mg/g fruta)
peso
peso hmedo
humedo
(coral)
Delfinidina-3-Oglucopiransidob
Delfinidina-3-Orutinsidob
Cianidina- 3-Orutinsidob
Petunidina3-Orutinsidob
0,58 1,30a
2,870,07 a
12,04 1,30 a
10,980,07 a
2,07 1,30 a
7,580,07 a
2,49 1,30a
8,210,07 a
Reportado como delfinidina-3-rutinosido, b se confirmaron por coinyeccin con estndar Rut: rutinsido; Glu: glucosido; d,e,f,g, se
obtuvo por MS/MS a partir del correspondiente in molecular
51
(motiln)
El motiln, present las mismas antocianinas que el coral, lo cual concuerda con el
hecho de que las dos frutas pertenecen a la misma especie Hyeronima macrocarpa
Mull.Arg. La principal diferencia radica en que la concentracin total de estas
antocianinas es mayor en el motiln (29.64 mg/g) que en el coral (17.18 mg/g).
El compuesto mayoritario en las dos frutas fue identificado como delfinidina-3-O-6O--ramnopiranosil--glucopiransido delfinidina-3-rutinosido. En el espectro de
masas (Figura 18), se tiene el in molecular en m/z 611, junto con un in fragmento
en m/z 465 correspondiente a la perdida de una hexosa [M-162]+. Por MS/MS a partir
del in molecular se obtuvo el in producto 303 [M-162-146], concordante con la
presencia de dos unidades de azcar, una hexosa y una pentosa unidas a la
antocianidina. En este caso el in molecular obtenido por espectrometra de masas de
alta resolucin (HRMS) fue 611.1623, concordante con la frmula C27H31O16
(611.1612 valor terico). En el motiln tambin se pudo observar la presencia de un
flavonol a una de 371 y a un tiempo de retencin de 23 minutos (Figura 17 b). El
espectro de masas de este compuesto (Figura 19) present un in pseudomolecular en
m/z 611.1657 [M+H]+ y un in aducto en m/z 633.1468 [M+Na]+, que indica un peso
molecular de 610 u. Los iones fragmento en m/z 465 [M-146]+, 303 [M-146-162]+
sugieren la presencia de quercetina unida a una hexosa y una pentosa.
52
Figura 19. Espectro de masas del flavonol presente en la fruta motiln ( tR 23min)
Esta es la primera vez que se reporta la composicin en estas especies. Es importante
mensionar que en otras especies, de la familia Euphorbiaceae, Ricinus communis
L104, se identificaron las antocianinas novedosas: cianidina 3-O--xilopiranosido-5O--glucopiransido,
cianidina
3-O--xilopiranosido-5-O-(6'''-O-malonil--
53
presencia de una cianidina unida a una hexosa y probablemente acilada con cido
malnico. Estudios realizados en frutas del gnero
Rubus muestran
que la
As por ejemplo,
Qingguo Tian et al105., reportaron las antocianinas cianidina 3-glucsido, cianidina 3sambubiosido, cianidina 3 - (2G-xilosilrutinosido) y cianidina 3-rutinsido en la
especie Rubus occidentalis con un contenido total de antocianinas entre 170 - 430
mg/100g de fruta fresca. Hurtado101 encontr que las antocianinas mayoritarias en
mora de castilla (Rubus glaucus Benth), eran: cianidina-3-O-(2-O--xilosil-6-O-ramnopiranosil--glucopiransido),
cianidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil)--
glucopiransido y pelargonidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido). Es
importante resaltar que en el extracto ERA de mora pequea no se detectaron la
presencia de flavonoles ni antocianinas polimricas.
54
Figura 20. Anlisis por HPLC del ERA de mora pequea. La identificacin de cada pico corresponde con la tabla 4.
Tabla 4. Identificacin y cuantificacin de antocianinas en Mora (Rubus megalococcus Focke)
Pico
No
Tiempo de
retencin (min)
HPLC-ESI/MSMS
12,2
3
6
14,2
23,6
Frmula
Ion molecular
Experimental
Masa
exacta
Iones fragmento
M+ (m/z)
C21H21O11
449,1082
C27H31O15
595,1660
C24H23O14
535,1100
Identificacin tentativa
cianidina 3-Oglucopiransido a
366,462,3 a
cianidina 3-O-rutinsido b
4,602,3 a
Cianidina-hexosa-malnico
64,722,3 a
(m/z)
449.1084
595.1663
287[M-162]+
449[M-146]+
/287[M-146-162]+
d
535.1087
Reportado como cianidina -3-glucosido; a y b confirmados con estndar; c,d,e se obtuvo por MS/MS del in molecular
55
glucsido (Figura 21) (tabla 5). En concordancia con otras investigaciones, en esta
especie se han reportado la presencia de las antocianinas cianidina 3-glucsido y
delfinidina3-glucsido 106.
56
Figura 21. Anlisis por HPLC del ERA de Uva de rbol. La identificacin de cada pico corresponde con la tabla 5
Tabla 5. Identificacin y cuantificacin de antocianinas en Uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.))
Tiempo de
Pico retencin (min)
No HPLC-ESI/MSMS
Frmula
Ion
Masa exacta Iones fragmento
molecular
(m/z)
(m/z)
8,7
C21H21O12
465.1003
465.1033
303 [M-162] +c
11,7
C21H21O11
449.1044
449.1084
287[M-162]+d
Identificacin
tentativa
Delfinidin-3-Oglucopiransidob
Cianidina 3-Oglucopiransidob
26,291,1a
143,511,1 a
Reportado como Cianidina-3-glucsido; bconfirmado con coinyeccin con estandar. c,d se obtuvo por MS/MS del in molecular
57
(1)
(2)
(3)
(4)
58
(5)
Figura 22. Estructuras qumicas de los compuestos encontrados en las cuatro frutas.
(1)Delfinidina-3-O-glucopiranosa. (2)Delfinidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido).
(3) Cianidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido. (4)Cianidina 3-O--glucopiranosido.
(5) Petunidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido
Los espectros de masas obtenidos para cada una de las antocianinas (no explicadas en
este texto), se3 encontradas en las cuatro frutas, se presentan en el anexo 1.
3.2
59
Tabla 6. Actividad antioxidante de los ERAS de las cuatro frutas frente a los
radicales ABTS y DPPH
ABTS (mmol
Trolox/g fruta)
Coral
Uva
Motiln
Mora
0,1360,036a
0,3450,029b
0,4260,004c
0,2230,022d
% DPPH
27,131.36a
25,720,77ab
23,721,08b
26,840,78
remanente/g
fruta
Letras diferentes en las filas indican diferencias significativas (Tukey, p<0.05) en los valores
reportados todos los experimentos se realizaron por triplicado.
60
uva y la mora, en tanto que el ERA de coral presento el menor valor de actividad
antioxidante en comparacin con las otras frutas.
Es importante resaltar que la actividad antioxidante del coral es mucho menor que la
del motiln a pesar de que fueron clasificadas como de la misma especie. Esto se
puede explicar teniendo en cuenta el contenido total de antocianinas presentes en las
dos frutas (29.7 mg/g) en el motiln y (17.2 mg/g) en el coral.
3.2.2 Espectroscopia EPR. Los mismos extractos de las cuatro frutas as como las
soluciones de radicales libres empleadas en UV-Vis se usaron para evaluar la
actividad antioxidante por EPR. Esta tcnica permite una evaluacin directa en la
disminucin en la concentracin de radicales libres por efecto de la presencia de
sustancias antioxidantes. La estabilidad de las soluciones de radicales libres se
61
verifico previamente haciendo medidas durante treinta minutos del rea. Se obtuvo
una grfica de EPR diferente para ABTS y DPPH, esto debido a sus diferencias en
estructura qumica (Figura 23). Tambin se observo que el rea disminua con el
tiempo debido a la disminucin en la concentracin de radicales libres por efecto de
los antioxidantes.
(a)
5,E+07
4,E+07
3,E+07
2,E+07
1,E+07
0,E+00
-1,E+07
-2,E+07
-3,E+07
-4,E+07
-5,E+073420
3440
3460
3480
3500
3520
3540
(b)
8,E+07
Tiempo= 1.5 min
6,E+07
Tiempo= 3.5 min
4,E+07
2,E+07
Tiempo= 13.5
min
0,E+00
-2,E+07
-4,E+07
3420
-6,E+07
3440
3460
3480
3500
3520
3540
-8,E+07
Figura 23. Set de espectros EPR individuales del ARE de Motiln registrados a
diferentes tiempos de reaccin en presencia de los radicales libres (a) ABTS y (b)
DPPH.
62
63
(a)
1
0,8
Crel
0,6
0,4
0,2
0
0
5
Uva ABTS
10
Mora ABTS
15
20
Coral ABTS
25
Motiln ABTS
30
Referencia
35
min
(b)
1
0,8
Crel
0,6
0,4
0,2
0
0
5
Uva DPPH
10
Mora DPPH
15
20
Coral DPPH
25
Motiln DPPH
30
Referencia
35
min
64
K (L.mol-1.min-1)
Coeficiente de
correlacin (r)
Muestra
ABTS
1.93 x 106
0.929
Mora
7.71 x 10
0.852
Motiln
1.35 x 107
0.994
Coral
1.93 x 106
0.972
1.56 x 106
0.937
Mora
5.85 x 10
0.862
Motiln
1.36 x 107
0.952
Coral
7.80 x 105
0.952
Uva
DPPH
Uva
3.3
65
Figura 25. Espectros UV-Vis de los ERA (1mg/10mL) de las cuatro frutas
estudiadas a pH 1.5
Estas mediciones espectrales fueron importantes para observar las caractersticas de
absorcin en el visible de los extractos crudos de las cuatro frutas; sin embargo, estas
mediciones, por si solas no aportan informacin suficiente sobre el color de las
antocianinas presentes en estos. Por lo tanto, con el propsito de obtener informacin
ms precisa sobre las caractersticas del color de los extractos crudos, se evalu su
estabilidad en diferentes condiciones y durante su almacenamiento por medio de
medidas de colorimetra triestmulo. En la Figura 26, se presenta la variacin del
color en los ERAS de las cuatro frutas a diferentes valores de pH en un tiempo (0).
En cuanto al motiln se observa que en el menor valor de pH (pH 1.5) el tono se
encuentra alrededor de 40 lo que indica que presenta tonalidades naranja-rojizas.
Tambin se observa que a este pH se encuentran los mayores valores de croma
debido a que a este pH se favorece el equilibrio hacia la formacin de la especie
catin flavilio desplegando la mxima intensidad de color. Cuando el pH se
increment a 3.5, el matiz del extracto crudo de la fruta gradualmente cambia hacia
un tono rojo-violeta lo cual puede deberse a la antocianina delfinidina-3-rutinsido la
cual se encuentra como compuesto mayoritario en esta fruta. En el intervalo de pH
5.5 7.5 el tono del extracto de la fruta vari poco (entre 40 y 60); un tono un poco
ms amarillo, lo que explica la formacin de chalconas de tono amarillo. Se observa
66
que en tanto mayor es el pH, el croma disminuye, la claridad aumenta y el matiz varia
en un rango tpico para los valores reportados para antocianinas entre 0 y 60.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 26. (a)Variacin del color en los ERAS de las frutas a diferentes valores de
pH en tiempo=0. (a) Motiln (b) Coral. (c). Uva. (d). Mora
67
68
Tabla 8. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de almacenamiento de los extractos crudos
aislados del fruto de motiln
pH
TIEMPO
L*
a*
b*
Cab
Hab
1.5
1.5
1.5
1.5
3.5
3.5
3.5
5.5
5.5
5.5
5.5
5.5
7.5
7.5
7.5
7.5
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
47,769
49,553
49,042
49,233
80,050
69,080
56,320
75,251
75,982
75,560
83,662
80,760
68,485
66,733
76,283
68,535
69,337
71,604
71,601
71,099
20,445
25,163
62,568
24,774
5,985
6,971
5,542
6,156
17,906
21,711
12,695
33,526
53,885
53,500
55,175
54,331
1,640
8,315
21,251
11,825
16,150
18,294
19,356
13,699
13,485
22,490
26,955
23,150
87,813
89,383
90,393
89,481
20,512
26,501
66,080
29,687
17,239
19,599
20,151
15,620
22,444
31,912
29,956
45,101
37,853
36,766
37,617
37,385
4,589
18,286
18,756
40,148
69,217
69,056
73,883
59,388
38,918
47,081
64,577
43,674
69
Tabla 9. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de almacenamiento de los extractos crudos
aislados del fruto de Coral
pH
TIEMPO
L*
a*
b*
Cab
Hab
1.5
1.5
1.5
1.5
3.5
3.5
3.5
3.5
5.5
5.5
5.5
5.5
7.5
7.5
7.5
7.5
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
59,324
64,496
64,433
64,864
72,683
77,373
78,589
81,874
77,649
84,152
86,789
84,947
81,780
83,949
87,226
87,341
57,081
61,583
60,912
60,192
25,362
21,390
24,735
18,548
6,553
7,602
5,718
6,427
2,901
6,753
5,676
5,934
17,404
16,767
16,705
16,474
3,903
6,381
6,159
5,629
7,299
9,825
9,086
9,425
7,980
10,285
8,599
7,954
59,676
63,824
63,162
62,406
25,661
22,323
25,491
19,384
9,809
12,423
10,736
11,408
8,492
12,303
10,303
9,924
16,956
15,231
15,336
15,307
8,753
16,623
13,999
16,883
48,083
52,271
57,817
55,707
70,021
56,710
56,571
53,274
70
Tabla 10. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de almacenamiento de los extractos crudos
aislados del fruto de mora
pH
TIEMPO
L*
a*
b*
Cab
Hab
1.5
1.5
1.5
1.5
3.5
3.5
3.5
3.5
5.5
5.5
5.5
5.5
7.5
7.5
7.5
7.5
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
59,302
53,787
58,583
57,003
90,095
70,277
83,232
77,026
89,700
79,610
82,070
82,493
81,858
75,732
78,33
79,362
67,993
63,642
67,551
65,185
4,228
6,990
5,791
5,731
5,519
5,441
6,606
6,146
5,568
6,128
5,55
4,944
61,448
57,439
58,253
56,402
11,979
14,604
14,178
15,992
4,573
13,865
13,163
12,533
9,002
18,609
18,78
16,678
91,646
85,730
89,199
86,199
12,703
16,191
15,323
16,988
7,167
14,895
14,728
13,959
10,585
19,592
19,59
17,395
42,105
42,067
40,773
40,868
70,561
64,423
67,778
70,285
39,641
68,574
63,347
63,879
58,260
71,773
73,53
73,489
71
Tabla 11. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de almacenamiento de los extractos crudos
aislados del fruto de uva de rbol
pH
1.5
1.5
1.5
1.5
3.5
3.5
3.5
3.5
5.5
5.5
5.5
5.5
7.5
7.5
7.5
7.5
TIEMPO
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
L*
a*
b*
Cab
Hab
70,132
71,106
73,302
73,214
75,361
75,630
70,040
75,475
82,791
86,022
80,497
72,865
70,460
78,08
46,756
48,681
49,177
48,647
22,937
20,313
23,955
23,134
3,933
2,532
4,316
5,209
6,541
4,80
20,008
19,455
19,280
19,558
14,752
15,690
17,247
15,593
17,519
25,944
29,170
31,829
31,282
43,85
50,857
52,425
52,822
52,432
27,273
25,667
29,519
27,898
17,955
26,067
29,488
32,253
31,959
44,11
23,167
21,784
21,407
21,902
32,758
37,687
35,765
33,982
77,348
84,426
81,584
80,691
78,189
83,75
79,040
78,734
4,510
4,459
45,493
41,756
45,716
41,993
84,338
83,905
72
En general, los extractos crudos de las antocianinas aislados de las frutas coral,
motiln, mora y uva de rbol, presentan diferencias importantes respecto al
comportamiento, frente a los cambios de pH, en aspectos como tono, croma y
claridad.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 27. Evaluacin del color durante el almacenamiento de los extractos ARE a
pH 1.5. (a).Motiln, (b). Coral, (c), Uva (d) Mora
73
74
75
a)
100,0
L*
Motiln
90,0
Coral
80,0
Uva
70,0
Mora
60,0
50,0
40,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
pH
b)
100,0
90,0
80,0
Motiln
Coral
C*ab
70,0
60,0
Uva
Mora
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
1,0
3,0
5,0
7,0
9,0
PH
h* ab
c)
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
Motiln
Coral
Uva
Mora
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
pH
Figura 28. Cambios en a: claridad (L*); b: el croma (C*ab) y c: el tono (hab) de los
extractos crudos con respecto al pH.
76
77
CONCLUSIONES
A pesar de que las frutas motiln y coral presentan las mismas antocianinas la
actividad antioxidante del motiln fue mayor con respecto a la del coral, lo cual no se
78
El anlisis por colorimetra triestmulo de los extractos crudos de las cuatro frutas,
permiti observar diferencias substanciales en la calidad y estabilidad del color frente
a los cambios de pH y almacenamiento. Se comprob que el color de los extractos
crudos es ms estable en el intervalo de pH ms cido (1.5).
La uva de rbol present menos dispersin en los puntos de color con respecto a los
cambios de pH lo cual se puede atribuir a que la antocianina mayoritaria presente en
esta fruta es la cianidina-3-glucsido.
79
PRODUCCION ACADEMICA
Artculos cientficos
L. Santacruz, J. G. Carriazo, O. Almanza, C. Osorio. Anthocyanin composition of
wild tropical Colombian fruits and antioxidant activity measurement by electron
paramagntetic resonance (EPR). J. Agric. Food Chem. Manuscrito en preparacin.
80
Anexo 1
81
82
3,5E-06
(1/Ct )-(1/CO)
3,0E-06
2,5E-06
2,0E-06
1,5E-06
1,0E-06
5,0E-07
0,0E+00
0
10
Mora
Coral
15
Motiln
20
uva
25
30
Tiempo (min)
4,5E-06
4,0E-06
(1/Ct )-(1/CO)
3,5E-06
3,0E-06
2,5E-06
2,0E-06
1,5E-06
1,0E-06
5,0E-07
0,0E+00
0
Mora
5
Coral
10
Motiln
15
uva
20
25
30
Tiempo (min)
Constantes (K) de velocidad de atrapamiento de los radicales libres de los ARE de las
cuatro frutas. a) con el radical ABTS+ b) DPPH+ con el radical DPPH+
83
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