La activacin del complejo NLRP3 inlfamasoma no es requerido para la

muerte por estrs inducido de islotes pancreticos

Abstracto
La diabetes tipo 2 produce la perdida de las clulas beta del pncreas. El estrs
ER, el estrs oxidativo y las altas concentraciones de glucosa producen la
apoptosis de las clulas de los islotes, y no solo eso sino que tambin pueden
activar el inflamasoma NLRP3 que conduce a la produccin de interleucina IL1beta y caspasa-1 dependiente de pyroptoisis.
*pyroptosis: es una estrategia antimicrobiana porque de ciertas molculas, donde una
clula husped infectada, muerte para alertar las clulas vecinas sanas a la presencia
de un intruso bacteriano.

Sin embargo, est en duda que la activacin de interleucina IL-1beta y el

inlfamasoma NLRP3, sean factores intrnsecos a la muerte de las clulas beta.
As se examin a un ratn que carecen de NLPR3 o caspasa-1, el cual se
expuso a perxido de hidrogeno, rotenona o thapsigargin que lo condujeron a
la muerte tal como uno salvaje. Esto sugiere que el estrs oxidativo o estrs del
ER no causan la muerte celular mediad por inflamasoma. Del mismo modo la
carencia de los componentes de inflamasoma NLPR3 no proporciona ninguna
proteccin frente a la glucosa, ribosa o glucolipotoxicidad. Finalmente, la
activacin gentica de NLPR3, no aumento la produccin de Interlucina o la
muerte celular. En resumen, el aumento de glucosa, el estrs ER y el oxidativo,
no son dependeitende de la activacin del inflamasoma.
INTRODUCCIN
Segn estudios en humanos y algunos animales, la prdida de masa de las
clulas beta del pncreas se produce debido a la diabetes tipo 2, algunas
muestras histolgicas, dejan en evidencia una reduccin de la masa de las
clulas beta y el aumento de desoxinucleotidil transferasa terminal (tnel), que
es mtodo para detectar ADN fragmenteado mediente el etiquetado del
extremo terminal de acidos nucleicos. La glucosa plasmtica elevada es
caracterstica de los diabticos y la exposicin crnica a estas concentraciones
causa la apoptosis de las clulas beta, la cual se debe a la activacin de la va
intrnseca de apoptosis. El proapopttico BH3, solo en protenas, sus
activadores BIM y PUMA, junto con sus efectores BAX, son importantes
mediadores de la toxicidad de la glucosa, los cuales se observaron en los
islotes con diabetes de tipo 2. Se ha informado que la exposicin a altas
concentraciones de glucosa induce a la produccin de IL-1beta, la cual es el
resultado de la activacin del inflamosoma, la cual depende de dos seales:
-La seal 1, aumenta la concentracin de pro IL-1beta, en respuesta a la unin
de ligandos a receptores tipo toll (TLR), los cuales activan la produccin de
citoquinas. Este ligando en estudios in-vitro, pueden ser lipopolisacaridos (LPS),
mientras que el colesterol LDL o acidos grasos libres pueden ser un seres vivos.
-La seal 2, permite el ensamblaje del inflamosoma NLPR3 o o la formacin del
complejo NlPR3-ASC-porcaspasa-1, para la activacin de caspasa-1, la cual
pasa la proIL-1beta a IL-1beta, que puede ser secretada por la celula.
Sustancias como cristales de colesterol, nigericina, alumbre y cido urico han
demostrado que activan el inflamosoma.
Algunas sustancias como la glucosa, algunas drogas como thapsigargin,
tunicamicina o rotenona, pueden producir tanto la seal 1 como la 2.

La acumulacin de radicales libres (ROS) produce la separacin de TRX

(tiorredoxina) interactuando con TXNIP, el cual libre se una a NLRP3
activndolo.
Ademas la activacin del inflamosoma, puede conducir a la piroptosis, debido a
la activacin de caspasas y liberacin de IL-1beta. Esta se caracteriza por la
fragmentacin del ADN, hinchazn celular y formacin de poros en la
membrana.
La activacin de molculas IRE1-alfa y PERK en el estrs del
reticuloendoplasmico, tambin pueden activar en inflamosoma, a travs de la
regulacin positiva de TXNIP. Sin embargo, la participacin de este gen es
controversial. Mientras la anulacin de TXNIP en la lnea INS-1 de la celula beta
reduce la toxicidad de thaspigargin, los islotes de ratones que carecen de esta
no estaban protegidos.
Los macrfagos expresan componentes del inflamosoma, como NLPR3, ASC y
caspasa-1, y lo activan en respuesta a agentes patgenos. Sin embargo, se ha
demostrado que su expresin en los islotes pancreticos es mucho mas bajo en
comparacin con los macrpgfacos derivados de la medula osea. Adems,
aunque la expresin deTLR4 e IL-1b se ha informado anteriormente en
humanos y en islotes de ratn y clulas beta MIN6, la activacin del
inflamasoma no se ha demostrado en las clulas beta convincentemente.
Adems, un estudio reciente report ausencia de TLR4 en beta de rata las
clulas, haciendo que la comprensin del papel de estos factores en las clulas
beta sea ms complicada.
Por lo tanto, decidimos directamente examinar si la supresin de los
componentes de inflamasoma en los islotes protege contra la muerte celular.
Nuestros resultados muestran que la supresin de los componentes del
inflamasoma no afecta a la apoptosis de los islotes en las clulas en respuesta
a la glucosa o productos qumicos que inducen apoptosis oxidativa, Estrs ER,
y que la activacin de NLRP3 en las clulas beta no lo hace contribuir a la
produccin de IL-1b y la muerte celular de los islotes.
Mtodos
Ratones
Los ratones deficientes en caspasa-1 se obtuvieron en Laboratorios Jackson en un
fondo NOD/Lt (NOD.129S2 (B6) - Casp1tm1Sesh / LTJ) y retrocruzados en el fondo
gentico C57BL/6 durante 10 generaciones por el Dr. Ben Croker (WEHI). Se generaron
ratones mutantes hypomorficos NLRP3 (Nlrp3A350VneuR) por el Dr. Susannah Brydges
y el Dr. Hal Hoffman.
Estos ratones son efectivamente una mutacion con prdida de funcin al ser criados
como homocigotos sin CRE recombinasa. Por simplicidad de nomenclatura, estos
ratones han sido llamados NLRP32/2 en este artculo. Ratones mutantes NLRP3A350V /
A350V fueron criados con RIP-Cre de los Laboratorios Jackson (B6.Cg-Tg (Ins2-cre)
25Mgn / J) para generar los ratones con el aumento de la actividad funcional NLRP3 en
el pncreas clulas beta. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en
cumplimiento con el "cdigo Australiano para el cuidado y uso de animales para fines
cientficos "y fueron aprobadas por el San Vicente de
Comit de tica del Hospital de Animales (AEC nmero de protocolo 016 /11).
Reactivos

D-glucosa (utilizado en 33,3 mM) y D-ribosa (50 mM) fueron adquiridos de Invitrogen
(Invitrogen Corporation, Gran Island, Nueva York) y Sigma-Aldrich (St Louis, MO),
respectivamente.
Concentraciones similares de L-glucosa o L-ribosa se utilizaron como hiperosmolaridad
controles (datos no mostrados) [6]. Tapsigargina (utilizado en 5 mM) se adquiri de
Calbiochem (Darmstadt, Alemania) e IL-1Ra (utilizado en 5 mg / mL) se obtuvo de
Amgen (Thousand Oaks, CA). El perxido de hidrgeno (H2O2, Sigma- Aldrich) se utiliz
a 0-40 mM, rotenona (Sigma-Aldrich) a 100 nm y lipopolisacrido (LPS, Sigma-Aldrich
L2630, a partir de Escherichia coli 0111: B4) a 100 nM. Estos reactivos se ensayaron a
travs de una gama de concentraciones en los islotes de tipo salvaje para determinar
la concentracin ptima a usar para experimentos adicionales. El control de
condiciones contena la misma concentracin de diluyente (DMSO para rotenona y
etanol para thapsigargin) en medio completo. Palmitato (Sigma-Aldrich) se utiliz a 1
mM acoplados a cido graso libre 1% de BSA (Roche, Mannheim, Alemania) y se aadi
a 10% de suero que contiene medio para el tratamiento de los islotes.
Aislamiento de islotes, cultivo y ensayo de fragmentacin de ADN.
Se aislaron islotes de Langerhans tal como se describe anteriormente. Los islotes se
lavaron, recogidos a mano, y durante la noche se cultiv a 37uC en 5% de CO2 en
CMRL medio-1066 (Invitrogen) suplementado con 100 unidades/ml de penicilina, 100
mg/ml de estreptomicina, 2 mmol/L glutamina, y 10% de FCS (JRH Biosciences, Lenexa,
KS) (denominado a continuacin completa CMRL). Medio CMRL contiene Glucosa 5,5
mM que es similar a los islotes concentraciones de glucosa estn expuestos a in vivo.
Tras la incubacin con diferentes reactivos, 100 islotes por muestra se tripsinizaron y
DNAla fragmentacin se analiz por tincin con yoduro de propidio y anlisis de
citometra de flujo como se ha descrito previamente. Las clulas NIT-1 se derivan de
ratones NOD transgnicos que expresan el SV40 antgeno T grande en las clulas beta
pancreticas bajo el control del promotor de insulina de la rata. Las clulas se
mantuvieron en 10% de CO2 a 37uC en DMEM (Invitrogen) suplementado con
aminocidos no esencial, antibiticos y 10% de FCS.
PCR genotipo
El ADN se prepar a partir de islotes purificados, y se someti a PCR con los siguientes
cebadores:
Nlrp3A350VF:
CCCTGCATTTTGTTGTTGTTG,
Nlrp3A350VR:
CCTGCTTCTCACATGTCGTC,
NeoF:
GAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTA
y
NeoR:
CGGGAGCGGCGATACCGTAAAGC.
ELISA
Despus del aislamiento, los islotes se cultivaron durante la noche a 37 C en medio
CMRL. Al da siguiente 400 islotes/muestra fueron extradas y se cultivaron en 1 ml de
medio completo CMRL durante 2,5 das. Alternativamente, los macrfagos fueron
preparados por cultivo de mdula sea de ratn en la M-CSF durante 7 das, replateado en 105 por pocillo en placas de 96 pocillos, seguido de la estimulacin con
palmitato conjugado con BSA durante la noche. A la conclusin del cultivo, se elimin el
exceso y se almacen a 280C para su uso posterior. ELISA para la IL-1b se realiz
segn las instrucciones del fabricante (R & D Systems, Minneapolis, MN).
Western Blot
Cuatrocientos islotes/muestra se cultivaron en 1 ml de 1% de BSA medio completo que
contiene CMRL y se trat con una combinacin de LPS (100 nM), glucosa (33,3 mM) y
palmitato (1 mM) durante 2,5 das. Islotes de control se cultivaron en el mismo medio
que contena 100 nM LPS. Islotes lisados se prepararon a continuacin en tampn RIPA
como se describe anteriormente. Los macrfagos tambin fueron tratados con la
misma concentracin de LPS, glucosa y palmitato durante 24 h y despus se lisaron
directamente en tampn de muestra reductor (muestra de buffer reductor). El Western

Blotting se realiz utilizando anti-caspasa-1 (p20) a partir de Adipogen (Casper-1,

Adipogen International, San Diego, CA).
Lactato deshidrogenasa (LDH) de ensayo
Los islotes se cultivaron y se trataron como se ha descrito anteriormente para los
experimentos de Western Blot. Los sobrenadantes se obtuvieron en el final de los
cultivos y las concentraciones de LDH se determinaron. Un kit disponible
comercialmente de Roche se utiliz para el ensayo de LDH.
El anlisis estadstico
Anlisis estadstico se realiz utilizando GraphPad Prism Software (San Diego, CA).
Todos los datos que se muestran en forma de grficos de barras son el promedio +
SEM. Los datos fueron analizados por una va o dos ANOVA con Bonferroni de Dunnett o
de post test para la comparacin de varias columnas (segn sea apropiado).

Resultados
Estrs oxidativo y el estrs ER no causan muerte celular de islotes mediada por
el NLRP3 inflamasoma.
Muerte celular causada por estrs oxidativo no es mediado por inflamosomas.
El estrs oxidativo se ha demostrado que causa la activacin de la
inflamasoma NLRP3. En particular, existen pruebas de que ROS mitocondrial es
un potente activador del complejo NLRP3 en clulas no islotes. Se estudi el
papel de la activacin inflamasoma mitocondrial en la muerte celular mediada
por ROS en ambas lneas celulares, beta e islotes primarios. NIT-1 clulas beta
sensibles al estrs oxidativo fueron tratadas con 100 nM rotenona para inducir
la produccin de ROS mitocondrial. Aunque la rotenona es capaz de
proporcionar tanto la seal 1 y 2, las clulas nunca fueron pre-tratadas con 100
ng / ml de LPS para aumentar al mximo el almacenaje celular de la pro-IL-1b.
La muerte celular se cuantific por la fragmentacin del ADN, que es comn a
todas las formas conocidas de muerte celular programada. La inhibicin de la
actividad de IL-1b con el antagonista del receptor de IL-1b (IL-1Ra, 5 mg / ml)
no proporcion ninguna proteccin contra la fragmentacin del ADN inducida
por rotenona. Esto demuestra que ROS mitocondrial no causa la muerte
dependiente de IL-1R en las clulas beta (Figura 1A). Sigue siendo posible que
la activacin inflamasoma podra ocurrir en los macrfagos residentes de los
islotes u otras clulas no beta, dando como resultado la secrecin de IL-1b y
toxicidad para las clulas beta. Por lo tanto, islotes aislados de tipo salvaje,
Nlrp32 / 2 y la caspasa 12/2 fueron expuestos a rotenona durante 2 das. La
fragmentacin del ADN fue similar en tipo salvaje y NLRP3 o islotes deficientes
en caspasa-1 lo que sugiere que el estrs oxidativo Mitocondrial causa la
muerte de clulas de islote travs de vas independientes de inflamosomas
(Figura 1B y C). Para investigar ms a fondo la posible contribucin del estrs
oxidativo, islotes de ambos, Nlrp32 / 2 y ratones caspasa-12/2, fueron expuesto
a ROS sistlicos cultivndolas con perxido de hidrgeno. La fragmentacin de
ADN inducida por perxido de hidrgeno fue similar en islotes de tipo salvaje y

knock-out, lo que indica que el NLRP3 inflamasoma no es un mediador de la

muerte celular de islotes inducida por ROS citoslico (Figura 1D).
Muerte inducida por el estrs ER no es mediada por inflamasoma.
Para examinar si el estrs ER podra causar muerte de clulas de islote
mediada por inflamasoma, islotes de tipo salvaje fueron tratados con
thapsigargin e IL-1Ra. La adicin de IL-1Ra no protegi los islotes de la
toxicidad thapsigargin (Figura 1 B & E) lo que indica que la muerte celular
inducida por estrs ER en islotes no est mediada por la secrecin de IL-1b.
Para mayor confirmacin, islotes Nlrp32 / 2 y la caspasa-12/2 fueron incubados
con 5 mm thapsigargin durante 5 das. No hubo diferencia. Se observ la
fragmentacin del ADN entre los de tipo salvaje y Nlrp32 / 2 o caspasa-12/2, lo
que demuestra la toxicidad del estrs ER inducido en islote no implica la
activacin del inflamasoma NLRP3. (Figura 1F).

Figura 4. mutacin en la activacin de NLRP3 no induce la escisin de caspasa1 en los islotes. (A) Cuatrocientos islotes aislados de tipo salvaje o Cre / +
Ratones NLRP3A350V / A350V fueron cultivadas en 1 ml de medio que contena
glucosa 33,3 mM o 50 mM ribosa durante 2,5 das y la concentracin de IL-1b
en el sobrenadante se cuantific por ELISA. Islotes de control se incubaron en
un medio que contiene glucosa 5,5 mM. Macrfagos tratados durante la noche
con 1 mM de palmitato fueron utilizados como control positivo. Los resultados
son la media SEM de n = 3-4 experimentos independientes. (B)
Cuatrocientos islotes / muestra fueron cultivados en medio de control que
contiene 1% de BSA y 100 LPS nm o un medio que contiene 1% de BSA, 100
nm LPS, glucosa 33,3 mM y palmitato de 1 mM durante 2,5 das. Los lisados se
prepararon en tampn RIPA y Western blot para la caspasa-1 (entero, FL o
troceados, p20) se realiz. Los genotipos 1:
+ / + NLRP3 + / +, 2: Cre / + NLRP3 + / +, 3: + / + NLRP3A350V / A350V y 4:
Cre / + NLRP3A350V / A350V. Como control positivo, los macrfagos de tipo
salvaje (A) y caspasa-12/2 (B) fueron tratados con LPS + BSA + glucosa +
Palmitato de 24 h o LPS + nigericina para 1 h.

Una alta concentracin de glucosa no causa muerte celular mediada por NLRP3
inflamasoma en islotes.
La posibilidad de que la muerte inducida por la glucosa fuera por la activacin
inflamasoma en los islotes fue estudiada. Adems de glucosa, hemos probado
la toxicidad de los islotes a la ribosa azcar reductor, similar a la glucosa,
induce la muerte de clulas de islote a travs glicacin y la formacin de ROS
[35]. Islotes que carecen de NLRP3 o caspasa-1 funcional no fueron protegidos
de la toxicidad de la ribosa (Figura 2 A, B y C). Para descartar cualquier
posibilidad de una dbil seal-1, islotes tambin se cultivaron en la presencia
de LPS para aumentar la concentracin de la pro-IL-1b. Sin embargo, la adicin
de LPS no hizo aumentar la muerte celular de los islotes inducida por la ribosa
en comparacin con los de tipo salvaje; no vimos ningn tipo de proteccin en
islotes CASPASE12 / 2 tratados con LPS + ribosa (Figura 2D). Islotes enteros
tambin fueron tratados con palmitato de 1 mM (conjugado a 1% de BSA en
medio que contiene 10% de suero) en presencia o ausencia de glucosa 33,3
mM para estudiar si la presencia combinada de glucosa y palmitato
(glucolipotoxicity) se requiere para causar la secrecin de IL-1b significativo. No
vimos la muerte celular sustancial en islotes enteros despus de la exposicin
a palmitato solo, sin embargo, la exposicin de islotes de palmitato y glucosa
juntos caus mayor muerte celular. Supresin de la caspasa-1 a partir de
islotes no le hizo proporcionar ninguna proteccin contra glucolipotoxicity
(Figura 2E). Estos resultados, junto con nuestros resultados anteriores de que la
deficiencia de receptores IL-1 no protegan islotes de la toxicidad de la glucosa
[6], muestran que ni la activacin del complejo-NLRP3 inflamasoma, ni ILProduccin 1b median la muerte de clulas de islote en respuesta a la alta las
concentraciones de la glucosa.
Mutacin en la activacin de NLRP3 especfico de clulas beta no resulta en la
produccin de IL-1b o amplifica toxicidad de la glucosa
Para determinar si la activacin constitutiva de NLRP3 en beta clulas
exacerbaran toxicidad de la glucosa, aislamos islotes de ratones con una
mutacin activadora de NLRP3 humana golpeado en locus NLRP3 del
raton(NLRP3A350V / A350V) [30]. Esta mutacin es controlada por la enzima
Cre, por lo que mediante el cruce de la NLRP3A350V / A350V ratones mutantes,
que expresan Cre bajo el control de la rata promotor de insulina (RIP-Cre),
hemos generado ratones mutantes de NLRP3 en niveles endgenos pero slo
en las clulas beta del pncreas. La expresin con xito de NLRP3 mutante en
las clulas beta del ratn fue confirmado por PCR usando ADN de islotes
purificados (Figura 3A). Esta mutacin es claramente activa, ya que los ratones
cruzados a LysM-Cre no sobrevivieronn ms all de 14 das, sin embargo los
ratones NLRP3A350V / A350V / RIP cre no tienen cualquier fenotipo manifiesto
(datos no mostrados). Si las clulas beta son capaces de producir IL-1b
significativa en respuesta a la glucosa o la exposicin ribosa, a continuacin,
islotes con NLRP3 constitutiva deberan producir incluso mayores cantidades de
IL-1b que resulta en la amplificacin de la glucosa o la toxicidad de la ribosa.
Contrariamente a esta expectativa, se observ que los islotes con NLRP3
mutante no lo hicieron, no mostraron aumento en la toxicidad de la ribosa en
comparacin con los controles (Figura 3B). Se midi la IL-1b producido
mediante el cultivo de 400 islotes en 1 ml medio de cultivo con 50 mM ribosa o
glucosa 33,3 mM durante 2,5 das. Se ha demostrado previamente que las

altas concentraciones de glucosa ni inducen secrecin de IL-1b, ni afectan su

expresin en clulas dendrticas cultivadas [18]. Por lo tanto, los macrfagos de
tipo salvaje cultivados con palmitato se incluyeron como un control positivo. Se
recogi el sobrenadante y la concentracin de IL-1b se determin por ELISA. Al
igual que en nuestra anterior conclusin [6], fuimos incapaz de detectar
cualquier IL-1b en sobrenadantes de islotes de tipo salvaje tratados con ribosa
o glucosa. Adems, la concentracin de IL-1b mantenido por debajo del umbral
de deteccin incluso en los sobrenadantes de islotes mutantes NLRP3 tratados
con ribosa o glucosa (Figura 4A). En contraste, 113.8647.9 pg / ml de IL-1b (n =
4) fue detectado en los sobrenadantes de macrfagos tratados con palmitato
(Figura 4A). Para probar glucolipotoxicity, islotes fueron tratados con 33,3 mM
de glucosa y 1 mM de palmitato al conjugarse con 1% de BSA en la presencia
de 100 nM LPS durante 2,5 das. Islotes de control fueron tratados con LPS y
1% de BSA. IL-1b era detectable en extremadamente bajos niveles en los
sobrenadantes de los islotes de tipo salvaje. En islotes mutantes de NLRP3,
esta concentracin IL-1b se mantuvo sin cambios
(Figura S1 A). Estos resultados indican que las clulas beta carecen de la
capacidad para producir suficiente IL-1b que podra hacer una notable
contribucin a la muerte celular mediada por palmitato junto con glucosa.
Mutacin en la activacin de NLRP3 especfico de clulas beta no causa la
escisin de caspasa-1 en los islotes
Por ltimo, se analiz si la activacin de NLRP3 intrnseca podra causar
escisin de caspasa-1 y, por lo tanto, resultar en pyroptosis de las clulas beta.
Se detect Pro-caspasa-1 en los islotes LPS tratados, pero la adicin de
palmitato y glucosa al medio de cultivo no indujo la escisin en cualquiera de
los tipos salvaje o los que expresan mutacin NLRP3 (Figura 4B). En contraste,
se observ escisin de caspasa-1 en los macrfagos sensibilizados con LPS y
luego se trat con glucosa y palmitato, o nigericin como control positivo (Figura
4B). La fragmentacin de ADN es una caracterstica de pyroptosis y no se vio
anteriormente una reduccin en la fragmentacin del ADN en los islotes
deficientes de caspasa-1 (Figura 2B-E). El tratamiento con glucosa y palmitato
durante 2,5 das dio lugar a una mayor concentracin de LDH en el
sobrenadante, pero la muerte celular fue similar en tipo silvestre, as como
islotes NLRP3 mutantes (Figura S1B). Estos hallazgos indican que
glucolipotoxicity no induce pyroptosis de las clulas beta.
Discusin
En este estudio, hemos investigado si la exposicin de los islotes al estrs
podra causar la muerte de clulas de islote mediada por inflamasoma. No se
encontr un papel significativo para los inflamasoma NLRP3 o IL-1b en la
destruccin de clulas de los islotes en respuesta a las altas concentraciones
de glucosa o productos qumicos que inducen el estrs ER o el estrs oxidativo.
Estudios previos mostraron que la exposicin de islotes humanos a glucosa
33,3 mM durante 5 das dan lugar a un nivel muy bajo de la secrecin de IL-1b
[9,12]. Del mismo modo en los islotes de ratn, las concentraciones altas de
glucosa o el estrs ER inducido por la droga thapsigargin caus una produccin
de modesta cantidad de IL-1b (20 a 40 pg / ml) que fue derogada en los islotes
que carecen NLRP3 o TXNIP. Estos estudios sugirieron que todo el IL-1b
producido como resultado de la incubacin con glucosa o thapsigargin fue

responsable de la muerte de clulas de los islotes. Sin embargo, el

fundamental experimento de incubacin de islotes que carecen de
componentes inflamasoma o IL-1 receptores con el estmulo txico no se hizo.
Cuando nosotros realizamos este experimento, se encontr que la prdida de
funcionalidad en factores inflamasoma, NLRP3 o caspasa-1, no inhibieron la
toxicidad de la glucosa, el estrs ER o la muerte por estrs oxidativo de clulas
de los islotes. Estos resultados estn de acuerdo con los datos previos que
demuestran que los islotes que carecen receptores IL-1 no estn protegidos de
la toxicidad de la glucosa. De acuerdo con nuestros resultados, otro estudio
mostr que el tratamiento de islotes humanos aislados con alta concentracin
de glucosa para un mximo de 7 das, no inducan la secrecin de IL-1b ni
afectaba la expresin de genes IL-1b. Nuestros datos tambin estn de acuerdo
con el concepto de que los islotes de ratones no son susceptibles a la
destruccin por IL-1b por s solos, sino que requieren la adicin de IL-1b + IFNC
para inducir la muerte celular significativa. Sin embargo, con las diferencias en
la fuente (humana vs. ratn) de islotes, el nmero de islotes, condiciones de
cultivo, las concentraciones de frmaco, diferencias entre las diversas lneas de
clulas beta y ensayos usados para medir la muerte celular y la actividad
inflamasoma no se puede descartar como posibles explicaciones para las
diferencias entre nuestros datos y los resultados de algunos de los estudios
previos. Por ejemplo, Maedler y sus colegas cultivaron islotes humanos durante
2 das en placas de matriz recubierta extracelulares permitiendo que las clulas
se adhirieran y expandieran antes de tratar los islotes con glucosa que llev a
la secrecin de IL-1b. Por otro lado tenemos, entre otros, islotes cultivados en
placas de Petri no revestidos y los trataban con diversos reactivos despus de
24 hora de aislamiento. El ensayo de fragmentacin del ADN que se utiliz en
nuestros experimentos tiene la ventaja de que analizamos 10.000 clulas por
muestra, lo que hace de este un mtodo altamente sensible para recoger datos
sutiles. A pesar de que clulas trypsinizing hace a algunos inducir la muerte
celular (ADN de fondo fragmentado siempre por debajo del 10%), la proporcin
de clulas muertas como resultado de trypsinizing fue consistente en todos los
grupos de tratamiento. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de
que los pequeos aumentos en la muerte celular de los islotes inducida por IL1b podra haber sido enmascarada por la muerte celular inducida por
tripsinizacin. Otra advertencia es el uso de LPS en nuestro estudio para
inducir la seal 1 en los islotes, donde es posible que otros agentes, tales como
Pam2CSK4 puedan proporcionar una mejor seal. La historia se puede
complicar an ms durante la diabetes en vivo durante el cual los macrfagos
reclutados al islote podran aumentar IL- Produccin 1b. En comparacin con
los macrfagos, la expresin de NLRP3 inflamasoma es muy baja en las clulas
beta de los islotes, y producen solamente una modesta cantidad de IL-1b
despus del tratamiento con glucosa. Incluso cuando utilizamos islotes de las
clulas beta con una mutacin en la expresin activadora de NLRP3, la
produccin de IL-1B estaba casi indetectable y la toxicidad de la glucosa
permaneci similar a la de los islotes de tipo salvaje. Mientras que los
macrfagos residentes de los islotes pueden ser una potencial fuente de islote
IL-1b, la deficiencia de cualquiera de NLRP3 o caspasa-1, ambos componentes
del inflamasoma NLRP3 requeridos para el procesamiento IL-1b en los
macrfagos, no afect a la toxicidad in vitro de glucosa la destruccin mediada
de islotes completo.

Estudios en animales y humanos han demostrado que la alta concentracin de

glucosa induce estrs oxidativo y estrs ER en los islotes. Aumento de la
produccin mitocondrial de ROS en clulas no de islotes, tales como
macrfagos THP1 o derivados de la mdula sea provocaron la activacin del
inflamasoma y liberacin de IL- 1b. Del mismo modo, la liberacin de IL 1b de
los islotes de glucosa tratada fue inhibida por el tratamiento con inhibidores de
ROS [13]. Estrs ER inducido por reactivos tales como thapsigarin y
tunicamicina tambin causa la liberacin de IL-1b de las clulas no islotes,
lneas de clulas beta e islotes primarias. Adems de la liberacin de IL-1b,
TXNIP fue regualada por estos productos qumicos. Estos estudios concluyeron
que el estrs ER y la activacin, inducida por inflamasome , de estrs oxidativo
en los islotes es mediada por TXNIP,sin embargo, una relacin directa entre
TXNIP y activacin inflamasoma no se demostr formalmente en los islotes.La
activacin de inflamasoma TXNIP-dependiente puede no ser importante para la
toxicidad de los islotes. La deficiencia de TXNIP hizo proteger a los islotes de la
toxicidad de la glucosa, pero esto puede ser debido a la mayor actividad
antioxidante de tiorredoxina en la ausencia de TXNIP, independiente de
cualquier efecto sobre la inflamasoma. En conclusin, nuestros resultados
muestran claramente que la activacin de la inflamasoma no media la muerte
celular de los islotes en respuesta a la alta concentraciones de glucosa, estrs
ER o el estrs oxidativo. Podra ser posible que los islotes produzcan pequeas
cantidades de IL-1b en respuesta a estos estmulos, pero por s mismo no es
suficiente para causar la muerte sustancial in vitro. Pequeas cantidades de IL
1b pueden aumentar la expresin de quimiocinas como CXCL1 en las clulas
beta, facilitando as la reclutamiento de clulas inmunes en los islotes. Ms
trabajo ser requerido para determinar si la activacin de inflamasoma bajo el
flujo de toxicidad de la glucosa o el estrs ER tiene efectos adversos sobre la
funcin de las clulas beta, incluyendo la biosntesis de insulina y la liberacin
de insulina estimulada por glucosa. En la diabetes tipo 2, hay un aumento en la
concentracin de sustancias tales como glucosa, cidos grasos saturados y
cidos grasos insaturados, IAPP, y citoquinas circulantes. Es probable que estos
tambin sean capaces de inducir la produccin de IL-1b por macrfagos en el
tejido adiposo y otros tejidos tal como islotes. Sin embargo, nuestros datos
muestran que, si bien estos factores circulantes afectan la viabilidad de los
islotes directamente, es menos probable que causen la muerte de clulas de
islote mediante la produccin de IL-1b de manera autnoma en las clulas
beta.