Entrecruzamiento

Este tipo de inmovilizacin consiste en la formacin de una gran estructura

tridimensional compleja entre las mismas molculas de la enzima por medios
fsicos o qumicos (Xie y col., 2009). Por lo general en los mtodos qumicos se
forman enlaces de unin covalente empleando ciertos agentes como el
glutaraldehdo, cido dicarboxlico o tolueno disocianato. Por mtodos fsicos se
utilizan agentes floculantes como poliaminas, polietilenamina, sulfonatos de
poliestireno y fosfatos (Elnashar, 2010). Este mtodo tambin es denominado
cross-linking (Figura 2), es una tcnica que ha sido ampliamente utilizada en la
estabilizacin de muchas enzimas (Wong y col., 1992). El entrecruzamiento de
una enzima fue descrito por primera vez Quiocho y Richards en 1964 (Quiocho y
col., 1964), utilizando glutaraldehdo para estabilizar los cristales de una enzima y
realizar estudios de difraccin de rayos X, adems, tambin se mantuvo la
actividad cataltica de la enzima.
Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha sido
ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas (7). El mtodo del
reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones
intermoleculares entre las molculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se
pueden emplear dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e,
incluso, diaminas si estn activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado
son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir
condiciones extremas de pH y temperatura.

El co-reticulado, permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica debidas a

efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una
protena sin actividad enzimtica y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la
albmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilizacin muy comn consiste
en inmovilizar la enzima por adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un
soporte polimrico (con lo que se consigue una elevada carga enzimtica) y
posteriormente aadir el reactivo bifuncional.

Actualmente el mtodo ms novedoso de cross-linking consiste en la cristalizacin

de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehdo (Cross-Linked Enzyme
Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtencin de un
entramado cristalino, donde las molculas de enzima estn rodeadas
exclusivamente por otras molculas de protena. De esta manera la propia enzima
acta como soporte, y su estructura terciaria est estabilizada por las uniones
covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscpicos

(20-50) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima

donde se cataliza la reaccin. Estos cristales pueden soportar temperaturas
elevadas y pH extremos, as como la accin de las proteasas. Esta tecnologa se
ha aplicado a enzimas muy diferentes, las cuales se han utilizado en la obtencin
de compuestos enatiomricamente puros y en la sntesis de pptidos.

Mtodos de inmovilizacin :

Entrecruzamiento
Definicion: Formacion de enlaces covalentes entre las moleculas de enzima, por
medio de reactivos bi- o multifuncionales, formando agregados entrecruzados
tridimensionales.
Metodos: Adicion de una cantidad apropiada de agente entrecruzante a una
solucion de enzima bajo condiciones que den un aumento en la formacion de
enlaces covalentes multiples.