Cultivos

Semana 4

Al finalizar el tema el estudiante

podr:
1. Definir medios de cultivo, sealar los diferentes
constituyentes bsicos de un medio de cultivo e
indicar la funcin de cada uno de ellos.
2. Clasificar los medios de cultivo, segn: el estado
fsico, la naturaleza de sus constituyentes y los
propsitos de uso.
3. Definir medios de enriquecimiento, medios
selectivos y medios diferenciales y dar ejemplos de
cada uno de ellos.

4. Explicar el efecto de la temperatura, pH,

actividad del agua (aw), presin osmtica y oxgeno,
sobre el crecimiento de los microorganismos.
Mencionar la importancia de los mismos en el
crecimiento microbiano.
5. Seleccionar las condiciones adecuadas para el
cultivo de microorganismos de acuerdo a sus
requerimientos.
6. Comparar los principales mtodos de cultivo
utilizados para los diferentes tipos de
microorganismos.

 El diagnstico microbiolgico es el conjunto de

procedimientos
y
tcnicas
complementarias
empleadas para establecer la etiologa del agente
responsable de una enfermedad infecciosa y poder
as proceder a su tratamiento y a tomar, en caso de
que fuera necesario, las medidas correspondientes
para evitar la diseminacin del patgeno.

 Para llevarlo a cabo, se parte de la informacin

acumulada por el mdico y que se recoge en
la historia clnica del paciente en forma de
sntomas, signos y diagnstico clnico ms
probable a su entender.

El diagnstico microbiolgico en bacteriologa puede

clasificarse en distintos tipos:

Directos: Implican la demostracin del agente

patgeno, sus metabolitos o alguno de sus
componentes antignicos en los fluidos
orgnicos del paciente.
Indirectos: Implican la demostracin de la
huella que el agente patgeno ha dejado en
su contacto con el sistema inmunocompetente
del paciente.

 A la hora de llevar a cabo la identificacin es

imprescindible la labor del laboratorio, que
nos aportar datos preliminares o definitivos
sobre los agentes patolgicos causantes de la
afeccin. Para ello, se lleva a trmino un
procedimiento ordenado que comprende:

 1.- Toma de muestras (esputo, sangre, heces, tejidos) que

dependern de la sospecha de procedencia de la afeccin.
2.- Observacin al microscopio, si procede, de la muestra
3.- Obtencin de colonias aisladas, cultivo.
4.- Identificacin del gnero y de la especie mediante test
bioqumicos, genticos, inmunolgicos.
5.- Test de sensibilidad a los antibiticos (punto de corte,
antibiograma, MIC)
6.- Informe al clnico, quien proceder a establecer el
tratamiento fundamentado en el diagnstico
microbiolgico o a modificar un tratamiento emprico
administrado debido a la gravedad de la infeccin.

 A la hora de tomar las muestras microbiolgicas,

debemos de hacerlo con el mayor rigor posible,
siendo para ello muy importante el cumplimiento de
los siguientes requisitos que permitirn garantizar el
resultado correcto del estudio:

 Elegir el material que refleje el proceso patolgico.

Evitar contaminacin con la flora del paciente.
Obtener volumen suficiente para observacin microscpica y
cultivo.
Obtener la muestra, si es posible, antes de iniciar la terapia
antimicrobiana.
Transportar la muestra rpidamente al laboratorio.

 Una vez tenemos las muestras adecuadas,

podemos comenzar a realizar las tcnicas
diagnsticas correspondientes. Dentro del
diagnstico microbiolgico incluiremos:
1.- Examen microscpico
2.- Crecimientos en cultivos
3.- Evidencia indirecta del crecimiento
4.- Tcnicas inmunitarias

CRECIMIENTOS EN CULTIVOS
Denominamos cultivo al proceso de laboratorio por
el que se induce el crecimiento cuantitativo de los
agentes patgenos. Para conseguir su crecimiento de
manera artificial es necesario un aporte nutritivo
suficiente as como las condiciones fsicas adecuadas
para su desarrollo. Para ello se utilizan los medios de
cultivo.

 Por lo general, todos los microorganismos

necesitan unos elementos imprescindibles que
incluyen fuentes de energa, de carbono, algunas
sales y elementos y por supuesto agua. Algunos
requieren adems otras sustancias adicionales
como vitaminas o aminocidos esenciales para
cada especie.

 Al igual que ocurre con su nutricin, no todos

necesitan las mismas condiciones fsicas para crecer,
por lo que hay que individualizar la temperatura, la
humerdad, el pH y otras caractersticas si queremos
que nuestros cultivos salgan adelante.

MEDIOS DE CULTIVO
De manera general se denomina
medio de cultivo

a cualquier material
adecuada combinacin
permitir el crecimiento
nmero de clulas
microbiana.

que presente una

de nutrientes para
o el incremento del
de una poblacin

CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS

Medios de cultivos.
Mtodos bsicos de cultivo de las bacterias,
mohos, levaduras, rickettsias, clamidias y
virus.

 En los Laboratorios de Microbiologa se utiliza

una gran variedad de medios de cultivos para
mantener las cepas, aislar o identificar
microorganismos con varias finalidades:

1. determinar la existencia de:

contaminacin de alimentos,
medicamentos
cosmticos
diagnosticar alguna enfermedad
elaboracin de vacunas virales y bacterianas,
entre otras

 En los laboratorios de microbiologa podemos encontrar

medios de cultivo lquidos y slidos.

En los medios lquidos las sustancias nutritivas se encuentran

disueltas mientras que los slidos llevan habitualmente una
base de agar que es lquido a altas temperaturas y solidifica al
enfriarse.
Este medio mantiene la humedad y conserva los nutrientes
necesarios, permitiendo que los organismos formen colonias
sobre l.

 Es por esto que los cultivos slidos tienen una serie de

ventajas que se resumen en la posibilidad de
cuantificar el nmero de unidades formadoras de
colonias (previa dilucin) y en la capacidad para
identificar preliminarmente un microorganismo
basndonos en las caractersticas de la colonia formada
(tanto color como morfologa).

Fuentes de energa
Orgnicas: carbohidratos, protenas,
polisacridos, grasas, cidos orgnicos, etc.
Inorgnicas: Ej. amonio, nitritos, azufre, etc.
Luz.

Componentes estructurales celulares

Componentes principales:
Carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno,
azufre, fsforo, potasio, magnesio,
calcio, hierro y sodio.
Elementos trazas:
Cobalto, zinc, molibdeno, cobre y manganeso.

Factores de crecimiento:
Se llama as a cualquier compuesto orgnico que
un microorganismo requiere como precursor o
constituyente de su material orgnico celular,
pero que no puede sintetizarlo a partir de sus
fuentes de carbono ms simples, por lo que se le
debe proporcionar como nutriente.
Ej. aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas.
Ciertas bacterias patgenas requieren sangre o
hem. Ej. Gnero Haemophilus

 Otros:
agua

CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE

CULTIVO
Segn su estado fsico
Lquidos
Usualmente se denominan caldos ya que
contienen los nutrientes disueltos en agua.
Permiten obtener suspensiones con un
elevado nmero de microorganismos.
Ej. Caldo nutritivo.

 Slidos
Se pueden preparar a partir de medios
lquidos a los cuales se les aaden agentes
solidificantes como agar, gelatina o slica gel.
Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y
mantenimiento de los microorganismos en el
laboratorio.
Ej. Agar nutritivo.

Segn la naturaleza de sus

constituyentes
Medios naturales o complejos
Estn constituidos por sustancias complejas
de origen animal o vegetal y usualmente se
complementan con el aadido de minerales y
otras sustancias.
No se conocen todos los componentes del
medio de cultivo, ni las cantidades exactas en
que estn presentes.
Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras.

Medios sintticos o qumicamente definidos

Se preparan a partir de ingredientes
qumicamente puros y por lo tanto se puede
conocer exactamente su composicin cuali y
cuantitativa.
Por su costo slo se emplean en
procedimientos especiales.

Segn sus propsitos de uso

Medios de enriquecimiento
Se llama enriquecimiento a cualquier cultivo
en medio lquido que resulte en un
incremento en el nmero de un tipo dado de
microorganismo en relacin con el nmero de
otros tipos de microorganismos que puedan
estar en el inculo.

 Un medio de enriquecimiento puede contener

sustancias que favorezcan el crecimiento del
microorganismo que nos interesa o que
inhiban el crecimiento de los otros tipos de
microorganismos presentes.

 La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no est

determinada nicamente por la composicin qumica del
medio usado, sino que en un medio dado puede ser variada
significativamente modificando otros factores tales como:
temperatura
pH
fuerza inica,
Iluminacin
aireacin.
Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento de
las especies del gnero Salmonella provenientes de
muestras de heces, orina, agua o alimentos.

Medios selectivos
Son bsicamente iguales a los de
enriquecimiento, se diferencian por ser
medios slidos y estn diseados para el
aislamiento de microorganismos especficos.
Ej. Agar desoxicolato citrato utilizado para el
aislamiento de patgenos entricos.

Medios diferenciales
No contienen sustancias inhibidoras, es decir,
permiten el crecimiento de muchos tipos de
microorganismos, pero si contienen indicadores
de productos derivados de la actividad
metablica de los microorganismos sobre algunos
de los componentes del medio.
Se utilizan para la identificacin de los
microorganismos.
Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar
fermentacin de carbohidratos.

Medios selectivos diferenciales

A veces se combinan en un mismo medio las
caractersticas de ser selectivo y diferencial.
Ej.: el agar Mac Conkey contiene sales biliares y
cristal violeta, que inhiben el crecimiento de las
bacterias gram positivas.
Pero como tambin contiene lactosa y un
indicador de pH permite distinguir entre las
bacterias fermentadoras de lactosa y las que no
lo son.

CONDICIONES AMBIENTALES QUE

AFECTAN EL CRECIMIENTO DE LOS
MICROORGANISMOS

1. Temperatura
Cada microorganismo tiene una temperatura
ptima en la cual su crecimiento es ms
rpido.
Una temperatura mnima por debajo de la
cual no crece y una temperatura mxima por
encima de la cual el crecimiento no es posible,
estas tres temperaturas se denominan
temperaturas cardinales y son caractersticas
de cada microorganismo.

 El rango de temperaturas entre las que un

microorganismo puede crecer es variable, hay
microorganismos con un rango estrecho
llamados ESTENOTERMALES y se encuentran
en hbitat de temperatura relativamente
constante.

 Los microorganismos de rangos ms amplios

se encuentran en medios ambientales donde
la temperatura vara considerablemente y
stos son llamados EURITERMALES.

 De acuerdo con el rango de temperatura a la que

crecen, los microorganismos se dividen
en:
Psicrfilos:
Microorganismos capaces de crecer a bajas
temperaturas.
Existen varias definiciones de psicrfilos, en un
inicio se defina como Psicrfilo a cualquier
microorganismo que poda crecer a 0 C. Sin
embargo, parecen haber dos grupos diferentes
que pueden crecer a esa temperatura.

 El primer grupo est constituido por los

psicrfilos estrictos o aquellos microorganismos
que pueden crecer a 0 C pero cuya temperatura
ptima es de 15 C.
El otro grupo los constituyen aquellos
microorganismos que pueden proliferar a 0 C
pero que tienen temperaturas ptimas ms
elevadas 20 - 30 C llamados psicrfilos
facultativos
Ej. Pseudomonas.

Mesfilos
Microorganismos cuya temperatura ptima de
crecimiento se encuentra dentro de un rango de
25 40 C.
Dentro de este grupo se encuentran la mayora
de los microorganismos contaminantes de los
productos farmacuticos, alimentos y cosmticos
y los microorganismos patgenos para el hombre.
Ej. Neisseria gonorrhoeae

Termfilos
Microorganismos cuya temperaturas ptima
es de 50 - 60 C, hay algunos con
temperaturas ptimas an ms altas 80 - 121
C, a estos se les denomina hipertermfilos o
termfilos extremos
Ej. Thermus aquaticus (temperatura ptima 72
C; crece entre 50 - 80 C)

Actividad del agua (aw)

Como los microorganismos dependen del
agua para la sntesis de sus componentes
celulares, es necesario que sta se encuentre
disponible en el medio de cultivo para que los
microorganismos la puedan utilizar para su
crecimiento.

 La cantidad disponible de agua para los

microorganismos en un medio de cultivo, no
depende slo de la cantidad que se ha
aadido, ya que en estos medios se pueden
encontrar sustancias slidas disueltas que
disminuyen su disponibilidad.

 Otros microorganismos necesitan para crecer elevadas

concentraciones de solutos, a stos se les denomina
osmoflicos
Hay otros microorganismos que se han llamado
haloflicos o halfilos estrictos, stos requieren iones
Na+ para crecer y lo hacen ptimamente en medios a
los que se les ha aadido NaCl para obtener valores de
aw menores de 0,80 y los halfilos facultativos que
crecen a concentraciones de sales capaces de inhibir a
la mayora de las bacterias.

pH
La acidez o alcalinidad de un medio de cultivo se
expresa por su pH.
Para la mayora de las bacterias el pH ptimo de
crecimiento est entre 6,5 y 7,5 aun cuando
algunas pocas especies pueden crecer en los
extremos del rango de pH.
Las levaduras y los mohos pueden crecer a
valores de pH ms bajos.

 Cuando se cultivan los microorganismos en un

medio de cultivo originalmente ajustado a un
pH dado, 7 por ejemplo, es probable que este
pH cambie como resultado del metabolismo
de esos microorganismos, el cambio de pH
puede ser tan grande que eventualmente
podra inhibir el crecimiento de esos
microorganismos.
Para mantener un pH relativamente constante
durante el crecimiento microbiano, se le
aaden sustancias buffer a muchos medios de
cultivo.

Oxgeno
Segn sus requerimientos de oxgeno los
microorganismos pueden ser:
Aerobios estrictos: requieren oxgeno para
crecer.
Ej. Mycobacterium tuberculosis

 Anaerobios facultativos: pueden crecer en

presencia o en ausencia de oxgeno.
Ej. Levaduras, enterobacterias.

 Anaerobios estrictos: crecen en ausencia de

oxgeno.
En presencia de oxgeno su crecimiento cesa,
algunos mueren rpidamente.
Ej. Especies del gnero Clostridium

 Anaerobios aerotolerantes: crecen en

ausencia de oxgeno, pero la presencia de
oxgeno no perjudica su crecimiento.

Ej.: Especies del gnero Lactobacillus.

 Microaeroflicos: requieren pequeas

concentraciones de oxgeno para crecer.
Ej.: Especies del gnero Spirillum.

CULTIVO DE OTROS MICROORGANISMOS ESPECFICOS

MICOPLASMAS (BACTERIAS SIN PARED CELULAR)
Los micoplasmas tienen requerimientos nutricionales
especiales.
Los medios de cultivo se deben enriquecer con suero
animal (caballo o conejo) o lquido asctico humano.
Estos lquidos aportan los cidos grasos no saturados y
los esteroles que se requieren para la sntesis de la
membrana citoplasmtica.
El medio de cultivo ms utilizado para los micoplasmas
contiene: caldo cerebro-corazn suplementado con
0,5% de glucosa, 0,2% de arginina, 10% de extracto de
levaduras, 20% de suero de caballo, rojo fenol,
penicilina o acetato de talio (250 g/ml) y agar 0,60,8%.

HONGOS (ORGANISMOS CELULARES

HETERTROFOS CON PARED CELULAR)
Los hongos se pueden estudiar usando los mismos mtodos
generales de cultivo de las bacterias.

Casi todos crecen aerbicamente en los medios de cultivo

usuales de bacteriologa, a temperaturas entre 20 y 30 C;
como crecen mas lento que las bacterias, cuando se quieren
aislar de un inculo que posea ambos tipos de
microorganismos, es necesario ajustar las condiciones de
manera de inhibir el crecimiento de las bacterias y favorecer
el de los hongos, esto puede hacerse de varias maneras:

a) Acidificando el medio (pH 5,6).

b) Incorporando al medio una concentracin de azcar
relativamente alta (4%).
c) Aadindole al medio un agente antibacteriano.

El medio ms utilizado para el cultivo de los hongos es

el de SABOURAUD, que tiene un contenido alto de
azcar y un pH ligeramente cido.
Los hongos patgenos a menudo son ms exigentes
para su cultivo y requieren medios enriquecidos.

RICKETTSIAS, CLAMIDIAS Y VIRUS (PARSITOS

INTRACELULARES OBLIGADOS)
Debido a que son parsitos intracelulares obligados,
es necesario cultivarlos en tejidos de animales
susceptibles.
Las rickettsias y clamidias usualmente se cultivan en
el saco vitelino de embrionesde pollo o en cultivos
de tejidos.

 Para el cultivo de los virus hace algunos aos se

utilizaban animales completos, entre ellos: perros,
gatos, conejos, ratas, acures, pollos y primates.
La va de administracin del virus (intraperitoneal,
intravenoso, sub-cutnea, intracraneal, intranasal, etc.)
depende del tipo de virus.
El uso de animales completos presentaba ciertas
desventajas tales como: incomodidad, elevado costo,
etc.
En la actualidad se utilizan embriones de aves, por
ejemplo, pollo, pato, etc. los cuales se pueden inocular
por diferentes vas: va alantica, va corioalantoidea,
cavidad amnitica y saco vitelino.

Algunos de los medios de cultivo ms

utilizados en el laboratorio son:
a)

El

agar

sangre

el

agar

chocolate

Son los medios ms frecuentemente empleados y entran

dentro de la categora de medios generales.
Estn formados por nutrientes, agar y sangre de caballo o
carnero que constituye un suplemento.
La nica diferencia entre ambos es que en el agar chocolate
la sangre est hemolizada (los nutrientes quedan a
disposicin de los microorganismos).

 b) Agar de Sabouraud.
Es un medio de cultivo para hongos ms cido y que
contiene ms hidratos de carbono que los usados para las
bacterias.
Se siembra utilizando la tcnica de aislamiento (levaduras)
y se cultiva (28-34C) para observar las caractersticas de
las colonias (forma, color, bordes, brillo, textura).
Los hongos filamentosos (o miceliales) crecen ms
lentamente 7-15 das

 c) Otros medios
El agar McConkey es un medio selectivo para gram
negativos. Tambin existen los medios de manitol
salado, caldo selenito, agar Campylosel (para
Campylobacter) o el medio CIN (para Yersinia).
El medio de Schaedler es un medio slido que se utiliza
para el cultivo de microorganismos anaerobios
mientras que los medios de Mueller-Hinton con y sin
sangre son los estandarizados en la realizacin de
pruebas de antibiograma.