RESUMEN: El metabolismo heptico de la glucosa es un jugador clave en

enfermedades como la obesidad y la diabetes, as como en la deteccin de

drogas antidiabtico. Cultura hepatocitos en dos configuraciones dimensionales
se limita modelo in vitro de hepatocitos para funcionar correctamente,
mientras que las plataformas verdaderamente prcticos para llevar a cabo la
cultura (3D) en tres dimensiones no estn disponibles. En este trabajo se
presenta un mtodo de cultivo organoide prctica de hepatocitos para el
esclarecimiento del metabolismo de la glucosa en condiciones nominales y de
estrs. El empleo de este nuevo mtodo de cultivo de clulas dentro de un
reactor de fibra hueca, los hepatocitos se observaron a la auto-ensamblan en
organoides esfricos 3D con la preservacin de las uniones estrechas y
muestran un aumento de las funciones hepticas espec ficas. En comparacin
con los dos cultivo monocapa y sndwich de la cultura, los organoides
hepatocitos muestran un mayor contenido intracelular de glucgeno, el
consumo de glucosa, y la gluconeognesis y se acercaron a los valores en vivo,
como tambin confirmada por la expresin de genes de enzimas clave. Por otra
parte, organoides hepatocitos demostraron sensibilidad ms realista a los
desafos hormonales con insulina, glucagn, y dexametasona. Finalmente, la
exposicin a la glucosa alta demostr toxicidad incluyendo la alteracin del
potencial de membrana mitocondrial, la acumulacin de lpidos, y la formacin
de especies de oxgeno reactivo, similar a las respuestas in vivo, que no fue
capturado por cultivos en monocapa. Colectivamente, organoides hepatocitos
imitaban las funciones in vivo mejor que monocapa de hepatocitos y culturas
sndwich, lo que sugiere la idoneidad para aplicaciones tales como el cribado
de drogas antihiperglucmicos.

PALABRAS CLAVE: hepatocitos de rata; Cultura organoid 3D; fi bra hueca

biorreactor; metabolismo de la glucosa

introduccin

El hgado es uno de los rganos ms importantes en el mantenimiento de las

funciones fisiolgicas normales del cuerpo. A menudo se ha considerado como
un biorreactor complicado para la gestin de los hidratos de carbono, lpidos y
metabolismo de las protenas en el cuerpo (Soboll, 1995). Por ejemplo, el
metabolismo heptico puede regulateblood concentraciones de glucosa dentro
de un rango estrecho (3.9-6.1mM) a travs de ya sea prevenir la hiperglucemia
en el estado alimentado o evitar la hipoglucemia en ayunas bajo la regulacin
adecuada de hormonas como el glucagn y la insulina (Klover y Mooney,
2004 ). Esto se logra por la rpida transformacin de la glucosa en el plasma

en glucgeno heptico en presencia de insulina (respuesta postprandial), y el

revs en presencia de glucagn (respuesta en ayunas). Con el aumento de la
obesidad, la diabetes y otras enfermedades metablicas nutricionales /, la
funcin del hgado ha adquirido mayor importancia en los estudios
fisiopatolgicos, en especial para la investigacin de los trastornos del
metabolismo heptico (Qureshi y Abrams, 2007) y la deteccin de drogas para
el tratamiento eficaz tales trastornos metablicos (Tolman et al, 2009;. YkiJarvinen, 2009). Por lo tanto, el hgado puede ser un rgano extremadamente
importante no slo para los estudios fisiolgicos y fisiopatolgicos, sino
tambin para la evaluacin de frmacos en el tratamiento de trastornos del
metabolismo, como la diabetes y la obesidad.

Cultivos de hepatocitos primarios son modelos valiosos para dilucidar los

fenmenos celulares y moleculares que se producen en el hgado
mecnicamente (Nahmias et al., 2007), y pueden partiallysubstituteforanimal
pruebas. Modelos de cultivo Amongthehepatocyte in vitro, cultivo en monocapa
es el ms convencional, para facilitar la puesta a punto y la manipulacin, y por
lo tanto todava en uso activo de deteccin de drogas estudios metablicos
(Dash et al, 2009;. Lauer et al., 2009). El sistema de cultivo sndwich de
colgeno es ampliamente reconocido como un mejor con fi guracin (Tuschl et
al., 2009), que fue encontrado ms adecuado para mediciones de e fl ujo de
transporte o la excrecin biliar en comparacin con los otros sistemas de
cultivo (Marion et al., 2007). An as, para el estudio de glucosa heptica
metabo-lismo in vitro, monocapa de hepatocitos sigue siendo la cultura con fi
guracin ms comn (Klein et al., 2002; Mashek y Grummer, 2003; Raman et
al., 2004). Sin embargo, los hepatocitos en con monocapa fi guracin son bien
conocidos por la rpida prdida de funciones hepticas espec fi cos (Brandon
et al., 2003) no se muestran cativa gluconeognesis signi fi despus de 2 das
de cultivo (Yamada et al., 1980) e incluso cambiar su patrn metablico hacia
la de las lneas celulares permanentes despus de 3 das de cultivo (Bissell et
al., 1978). El cultivo en sndwich es menos aplicada para estudios de
metabolismo de la glucosa y los informes limitados que emplean este enfoque
tambin sugiere que las clulas no responden plenamente a la estimulacin de
la insulina (Hansson et al., 2004).

Para superar las deficiencias de dos dimensiones la cultura (2D), las tres
dimensiones (3D) hepatocitos cultivados se han desarrollado y utilizado como
funciones heptica espec fi cos se conservan mejor en comparacin con
monocapa (Wu et al., 1999), incluida una mayor sensibilidad a la
hepatotoxicidad inducida por frmacos (Meng, 2010). El uso de la cultura
atrapamiento gel (es decir, la cultura de disco en gel), los hepatocitos expresan

mayores actividades del metabolismo de la glucosa en la sntesis de la glucosa

y la gluconeognesis en comparacin con el cultivo en monocapa (Wen et al.,
2009). Sin embargo, las funciones metablicas claves relacionados con la
glucosa, incluyendo carboxiquinasa fosfoenolpiruvato (PEPCK), as como CCAAT
/ protena de unin al potenciador-a (C / EBP) se redujeron drsticamente en las
24h de la cultura y se ha sugerido que las condiciones de cultivo 3D necesita
una mayor optimizacin (Wen et al., 2009). El impacto de otra cultura 3D en el
contexto de metabolismo de la glucosa, la respuesta a la hormona de
estimulacin de alta y glucosa, as como enfermedades metablicas, en
general, ha sido poco investigado.

En este estudio, hemos construido una organoidculture basado fibra hueca de

los hepatocitos y evaluamos sistemticamente el metabolismo de la glucosa
para evaluar su capacidad para la deteccin de medicamentos para la
diabetes. Metabolismo de la glucosa, la actividad enzimtica, y expresin
gentica en los organoides se compararon con monocapa algo tradicional, as
como la configuracin sndwich. Tambin se examinaron la respuesta hormonal
y patologa para la evaluacin de la plataforma biorreactor 3D organoid.
Materiales y mtodos

El aislamiento de hepatocitos primarios y Cultura

Hombre ratas Sprague-Dawley (Zhejiang Academia de Ciencias Mdicas, China)

con un peso 200-300g y alimentados ad libitum se utilizaron para todos los
estudios. Los hepatocitos se aislaron mediante el mtodo de perfusin de
colagenasa de dos etapas como se describi previamente (Wu et al., 2005). La
viabilidad celular se evalu mediante exclusin con azul de tripano, y
hepatocitos con una viabilidad de> 85% se utilizaron en los estudios.

Para el cultivo de monocapa, los hepatocitos recin aislados se sembraron a

una densidad de 5.104 clulas / cm2, en el collagenseeded a una densidad de
5.104 clulas / cm2, en el colgeno

recubierto (0,3 mg / ml de colgeno tipo I) placas de cultivo (Corning Costar,

Cambridge, MA) para la cultura esttica. Para cultivo en sndwich, los

hepatocitos fueron fi rstly sembraron en placas de colgeno recubierto

gelificados a una densidad de 5.104 clulas / cm2. despus de 24 h

de incubacin a 378c, solucin de colgeno neutralizado (0,01 ml / cm2, 1,5

mg / ml, pH 7,4) se aadi a cada pocillo de las placas. Los cultivos se
incubaron durante 30 minutos a 378c en una incubadora humidi fi cado para
gelificar el colgeno antes de la adicin de medio de cultivo. Para el cultivo
organoide, los hepatocitos recin cosechadas con una densidad de 1.106
clulas / ml se inocularon en un 3: 1 (v / v) mezcla de

colgeno tipo I (0,3 mg / ml) y se concentr cuatro veces medio DMEM (pH
7,4). Entonces toda la mezcla se carg en polisulfona-g-poli (etilenglicol) (PSFg-PEG) fi bra hueca de membrana por inyeccin y se incubaron en un '' placa
de cultivo de ranura '' cubierto con medio de cultivo estndar de 1,5 ml en
cada ranura, as . La placa de cultivo de ranura fue fabricado a medida por
Zhejiang Gongdong Tecnologa Mdica Co., Ltd (Zhejiang, China), de acuerdo
con nuestra patente concedida (patente No. 200610053989.8 CN). Era de con fi
guracin y materiales (poliestireno) similar a las placas de cultivo Costar,
excepto que los pozos mltiples fue reemplazado por una serie de canales de
12-paralled (70510mm,

LWH, separados por barreras con 3mm de ancho).

El PSF-g-PEG fibras huecas fi previamente fabricado nosotros mismos tenan

dimetro interior / exterior de 0,6 / 1,0 mm y la membrana de porosidad de
80% (Shen et al., 2010). El volumen de poro mostr una distribucin gaussiana
entre 10 y 1,000nm con un radio medio de poro de 90.8nm medida por
porosmetro de mercurio automtico (IV AutoPore 9500, Norcross, GA).

Cada cultivo de hepatocitos se llev a cabo en un fenol medio consistente bajo

nivel de glucosa libre de rojo estndar Modi fi ed de Dulbecco Medio Eagle
(Gibco, Gaithersburg, MD) suplementado con glucosa 5 mM, 1% de BSA
(albmina de suero bovino), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina ,
100 mg / ml de estreptomicina, 100 nM de dexametasona, insulina 10 nM, 1 nM
de glucagn (todos de Sigma, St. Louis, MO).

Anlisis morfolgico

La morfologa de los hepatocitos se examin con un microscopio invertido (XD101, Olympus, Japn) y la ultraestructura celular fue investigado por
microscopa electrnica de barrido (SEM) y microscopa electrnica de
transmisin (TEM). Los hepatocitos organoides se extruyeron a partir de fibras
huecas mediante inyeccin con una jeringa de 5 ml lleno de solucin de PBS, y
luego recogieron inmediatamente y fijada durante la noche en 1 mL de 4% (v /
v) glutaraldehdo a 48C antes de SEM (Philips XL-30 ESEM, Eindhoven, Pases
Bajos) y TEM (JEM-1200EX, JEOL, Japn) observacin.

Los ensayos de Hgado-espec fi cas Funciones

Se recogi medio de cultivo en el punto de tiempo indicado tanto para la urea y

el anlisis de la secrecin de albmina. Los ensayos de la urea se realizaron
utilizando un kit de Nitrgeno Urea. Las concentraciones de albmina de rata
se determinaron mediante el ensayo de inmuno-nosorbent ligado a enzimas
(ELISA), como se describi previamente (Shen et al., 2006). Por valor absoluto,
todos los datos se normalizaron a la protena en los hepatocitos como medida
con el (kit de ensayo de protena BCA, Thermo Cient fi co Pierce, Rockford, IL)
bicinchoninic cido (BCA).

El consumo de glucosa, el glucgeno y la glucosa contenido Capacidad

sinttica

Para la determinacin del consumo de glucosa, la concentracin de glucosa del

medio de cultivo recogido en el tiempo indicado se determin usando un kit de
ensayo colorimtrico de la glucosa de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El consumo de glucosa de los
hepatocitos se calcul por las concentraciones de glucosa de los pozos en
blanco restando la glucosa restante en pocillos de clulas-plateado.

Para el ensayo de contenido de glucgeno, los hepatocitos en ambos cultivos

en monocapa y de sndwich se enjuagaron con PBS y se rasparon de los
pocillos con un polica de caucho mientras que las clulas de organoides fueron
liberados de las fibras huecas por inyeccin de la jeringa y se lavaron con

PBSantes de suspendida en 100 ml de 0,2 M de sodio tampn de acetato. Todas

las muestras de clulas se mantuvieron en 708c antes del ensayo. glucgeno
intracelular

contenido se determin mediante el tratamiento de los lisados celulares con

amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3) a pH 4,8 y 408C durante 2 h segn el trabajo
anterior con algunas modi fi caciones (Gmez-Lechon et al., 1996).

Para el ensayo de la capacidad sinttica de la glucosa, los cultivos de

hepatocitos se lavaron con PBS tres veces antes de la incubacin en tampn
libre de glucosa (117.6mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,82 mm Mg2SO4, 1,5 mM
KH2PO4, 20 mM Hepes, 9 mM NaHCO3, 0,1% w / v BSA, y 2,25 mm de CaCl2,
pH 7,4). La tasa de glucogenolisis fue expresada por la generacin de la
glucosa dentro de 1 h de incubacin en el tampn libre de glucosa con o sin
glucagn, mientras que las tasas de la gluconeognesis de los hepatocitos se
determinaron por la generacin de glucosa dentro de incubacin 1 h en el
mismo tampn libre de glucosa con la presencia de piruvato (10 mM) o glicerol
(10 mM) (Loven et al., 2005).

A fin de evitar diferente cantidad de residuo de glucosa en los diferentes

modelos de cultivo, los cultivos libres de clulas se realizaron como un control
para ensayo de glucosa
La expresin de genes
ARN total fue extrado de clulas recin cosechadas o clulas cultivadas con el
reactivo Trizol (SBS Bio, Shanghai, China). ADNc de doble cadena se sintetiz a
partir de 1 mg de RNA total utilizando un cebador hexmero. CDNA obtenido se
utiliz como una plantilla para la transcripcin in vitro utilizando el kit
comercial comprado a Takara (Otsu Shiga, Japn) como se describe antes de
(Wilkening y Bader, 2003) y amplificacin ed por la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR). La expresin del gen de la gliceraldehdo-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) en hepatocitos se utiliz como control (Yin et al.,
2006) .All Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla I.

PEPCK Actividad Determinacin

Actividad PEPCK se determin como se describe por Petrescu et al. (1979). En
el tiempo de cultivo indicados, se recogieron los hepatocitos en cada cultivo

como se ha mencionado anteriormente y despus se homogeneizaron en 48C

en PBS por sonicacin.
El oxaloacetato formado durante la reaccin de la enzima se redujo con malato
deshidrogenasa y NADH. La prdida concomitante de NADH se monitoriz la
absorbancia a 340 nm. La reaccin se dej proceder durante 5 min a 238C.
Cambio en la absorbancia en funcin del tiempo se convirti en mmol de
producto formado por min por medio del coeficiente fi molar de absorbancia de
NADH (6.22cm2 / mmol en

340 nm). Actividad PEPCK se expres como mmol de oxalacetato formado por
mg de protena por minuto.

Ensayo de Respuesta Hormonal

Para el ensayo de la respuesta hormonal, los hepatocitos en cada modelo de

cultivo se preincubaron en un medio estndar de cultivo libre de suero durante
2 das, seguido por cultivo en medio libre de hormonas durante 3 h. Las clulas
se incubaron durante 6h adicional en la presencia o ausencia de hormonas y la
glucosa como se indica en el texto y se sometieron a ensayo de glucgeno
intracelular. La concentracin correspondiente de la insulina, el glucagn, y
dexametasona fueron 10, 1, y 100 nM, respectivamente. Cultivos de
hepatocitos sin adiciones se incluyeron como los grupos de control.

Ensayo de respuesta superior de glucosa

Para la cultura diferente concentracin de glucosa, los hepatocitos en cultivos

en monocapa y organoides se incubaron, respectivamente, en diferentes
concentraciones de glucosa al inicio del cultivo celular. El medio de cultivo se
cambi cada dos das. Despus de 6 das de tratamiento de la glucosa, los
hepatocitos se lavaron, se recogieron y se sometieron a un anlisis de la
viabilidad celular (MTT) (Wang et al., 1996), el potencial de membrana
mitocondrial (MMP) (Masubuchi et al., 2006), las especies reactivas de oxgeno
(ROS) (Qu et al., 2001), Mal-ondialdehyde (MDA) (Londero y Lo Greco, 1996),
tincin con rojo nilo (Donato et al., 2006), y los triglicridos intracelular (TG)
contenido (El-Assal et al., 2004) ensayos.

estadstica

Todos los experimentos se ensayaron con tres repeticiones, con clulas

obtenidas a partir de tres ratas diferentes, si no se indica lo contrario. Los
valores reportados son meansSD. Las comparaciones

entre varios grupos se realizaron con ANOVA y Turqua post hoc procedimientos
de anlisis. Los valores de P <0,05 se consider estadsticamente significativa.

resultados

Rendimiento de hepatocitos en organoide Cultura

Morfologa de los hepatocitos en las fibras huecas se examina bajo el

microscopio a la vez brillante campo (Fig. 1A-C) y microscopa electrnica (SEM
y TEM) (Fig. 1D-F). Despus de 1 da de la cultura, los hepatocitos en contacto
poco a poco entre s y formaron 3D y organoides en forma de columna a lo
largo de toda la fibras huecas (Fig. 1A-C). El dimetro medio de los organoides
formados se determin que era aproximadamente 100 mm mediante el
examen de al menos 60 campos visuales usando una fotomicrografa. Los
organoides estaban envueltos por una capa delgada de fibras de colgeno en
la superficie exterior (Fig. 1E). Los hepatocitos en organoides exhiben formas
poligonales, que posee forma redonda de los ncleos (N), un amplio contacto
clula-clula, numerosas mitocondrias (M) y microvellosidades (m). Abundante
bilis canalculos (bc) como estructuras se observaron entre los hepatocitos (Fig.
1F).

Para el examen de las funciones fi cas de hgado especfico de cada cultura, el

medio de cultivo se recogi respectivamente a los 2, 4, 8, y 14 das en cada
cultura para la gnesis de la urea y el anlisis de la sntesis de albmina. El
resultado muestra que las funciones fi cas de hgado espec
hepatocytesorganoidsmaintainedmuchhigher que cualquiera monocapa o
cultura sndwich (Tabla II). Los hepatocitos en cultivo organoide podran
mantener las funciones de albmina y urea sintticos durante al menos 2
semanas, mientras que los hepatocitos en cultivo en monocapa podran ser
moderadamente mantuvieron durante slo 4 das (Tabla II). A este respecto, se

utiliz 2- o 4-das de cultivo para comparar el metabolismo de la glucosa en los

experimentos posteriores.

Metabolismo de la Glucosa Actividad

Cada cultivo de hepatocitos podra responder a la glucosa en la exposicin de
una manera similar en que se producen a bajas concentraciones de glucosa
(5,5 mm) o glucosa consumida a nivel alto (> 10 mM) (Fig. 2A). Sin embargo, el
consumo o la produccin de glucosa en hepatocitos de cultivo organoide y la
cultura sndwich era relativamente ms alto que en el cultivo en monocapa.
El contenido de glicgeno intracelular se determin respectivamente a las 2 y 4
das de cultivo (Fig. 2B). En la cultura organoide, el contenido de glucgeno
celular era aproximadamente 600 mmol / g de protena, que se acerc
estrechamente a los datos in vivo de 792 / g de protena mmol (obtenido a
partir de las clulas frescas) y permaneci estable durante al menos 4 das. Los
hepatocitos en cultivo sndwich slo tenan sobre el contenido de glucgeno
medio de organoides hepatocitos y monocapas de hepatocitos fueron an peor.
Capacidad sinttica de glucosa se muestra por tanto tasa de glucogenolisis y la
gluconeognesis. Ambas tasas glucogenlisis y la gluconeognesis en
hepatocitos organoides eran casi comparable con la invivodata y eran mucho
ms altos que monocapa hepatocye y cultura sndwich (Tabla III). La actividad
PEPCK tambin se analiz en cada cultivo a los 2 das y 4 das,
respectivamente (Fig. 3). Como se muestra en esta figura, los hepatocitos
mostraron mayor actividad PEPCK en la cultura organoid que en la cultura
sndwich mientras hepatocitos en cultivo en monocapa casi perdi su
gluconeognesis a los 4 das.

Diferencial de genes Expresiones

Se seleccionaron los genes relacionados con el metabolismo de la glucosa y se

analizaron con PCR como se informa en la Tabla I con GADPH fue seleccionado
como un gen de mantenimiento. Las expresiones de genes fueron analizados a
los 2 y 4 das, respectivamente (Fig. 4). Todos los genes relacionados con el
metabolismo de glucosa fueron altamente expresado en los hepatocitos recin
cosechadas. Despus de que el cultivo posterior, los genes relacionados con el
metabolismo de la glucosa fueron drsticamente redujeron reguladas en
monocapa, as como en la cultura sndwich despus de 2 das de la cultura y la
mayora de ellos se perdieron totalmente a los 4 das de cultivo en monocapa.

Relativamente, los organoides de hepatocitos mantienen la expresin gnica

de estas enzimas, con la nica excepcin de GLUT 2.

Diferencial de Respuesta Hormonal

Los efectos de las hormonas en la acumulacin de glucgeno celular fueron

investigados en cada cultura con fi guracin (Fig. 5). Aunque la acumulacin de
glucgeno fue bien regulada por la glucosa en independientemente de modelos
de cultivo, la sensibilidad se increment por la insulina en cultivo organoide en
comparacin con monocapa / cultivo en sndwich (Fig. 5A). La regulacin
inhibitoria de glucagn en la sntesis de glucgeno se observ slo en la
cultura organoid sin tal funcin en cualquiera de los hepatocitos monocapa o
cultura sndwich (Fig. 5B). Del mismo modo, los hepatocitos en cultivo
organoid mostr una mejora de glucgeno en respuesta a la dexametasona,
mientras que la cultura monocapa / sndwich no tena cambios signi fi cativos
de glucgeno contenido bajo tratamientos hormonales mismas (Fig. 5C).

Respuesta de alta glucosa

Las alteraciones celulares en los organoides de hepatocitos inducida por la

hiperglucemia, representados por el estrs oxidativo, disfunciones
mitocondriales, y la acumulacin de lpidos se evaluaron y se compararon con
las respuestas de clulas en monocapa, el mtodo de cultivo estndar para las
pruebas de drogas. No hubo signi fi dao celular significativa despus de 2-4
das de tratamiento de alta glucosa (datos no mostrados), por lo que prolonga
el tratamiento hasta 6 das. La Figura 6 muestra estas respuestas celulares a la
hiperglucemia a los 6 das de tratamiento.

La acumulacin de lpidos, evaluado mediante tincin con rojo Nilo y

determinacin TG se detect en organoides hepatocitos en tratamiento de la
glucosa. Como se muestra en la Figura 6A y B, el contenido intracelular de TG
aument 35% en el tratamiento de alta glucosa a 44.8mM en comparacin con
un tratamiento normal de la glucosa en 5,5 mM. La tincin con rojo Nilo
muestra una tendencia similar en tratamiento hiperglucemia en la cultura
organoid. En marcado contraste, no hubo un aumento en la acumulacin de
lpidos en virtud de hepatocitos monocapa.

El estrs oxidativo se evalu tanto por la generacin de ROS y MDA. ROS y MDA
se incrementaron en cultivos de organoides pero no en cultivo en monocapa,
como se muestra en la Figura 6C y D. Despus del tratamiento, de 44.8mM
inducida signi fi no puede acumulacin de MDA en aproximadamente un 50%
en organoides, mientras que no se detectaron cambios obvios de MDA en
cultivo en monocapa de glucosa.

La viabilidad celular como se indica por MTT no era obviamente alterado en

cada cultivo mientras que el nivel de MMP celular se redujo significativamente
slo en 3D organoide cultivo bajo tratamiento de alta glucosa (Fig. 6E y F).
discusin

Una funcin importante del hgado es el mantenimiento de la homeostasis de

la glucosa en sangre (Klover y Mooney, 2004).

En consecuencia, juega un papel crtico en trastornos del metabolismo de la

glucosa y sus tratamientos (Du et al., 2010). Sin embargo, 2D estndar en
sistemas in vitro tales como monocapa y cultivo en sndwich deja de replicar
completamente la respuesta a la hiperglucemia in vivo. Por lo tanto, el
desarrollo de un sistema de cultivo 3D prctico, tales como el sistema de
biorreactor heptica se presenta en este trabajo, que imita mejor el
metabolismo de la glucosa fisiolgica del hgado in vivo es una herramienta de
urgencia en la investigacin farmacolgica y patolgico.

En este estudio, hemos establecido una cultura organoid 3D de hepatocitos

primarios para el estudio de la investigacin relacionada con la glucosametabolismo. Infusin de mezclas de colgeno / hepatocitos en fibras huecas
llev a auto-ensamblaje de estas clulas en organoides 3D. Se observ que en
la cultura organoide, hepatocitos muestran una forma cuboide, aumento del
nmero de contactos intercelulares y bilis canalculos como estructuras. En
consecuencia, hepatocitos culturas organoides muestran onefold mayor
secrecin de albmina y urea sntesis de los cultivos de hepatocitos con fi
guraciones en 2D, en monocapa y la cultura sndwich (Tabla II).

In vivo, el hgado mantiene la homeostasis de la glucosa mediante la

estimulacin de la glucogenolisis y la gluconeognesis a travs de la activacin
de PEPCK y G6Pasa en estado de ayuno, as como la eliminacin de la glucosa
a travs de almacenamiento de glucgeno o la metabolizacin de ellos a travs
de la gluclisis, en el estado postprandial (Klover y Mooney, 2004). Sin
embargo, los hepatocitos en cultivos en monocapa y sndwich fallaron para
imitar el metabolismo de la glucosa de un hgado intacto, incluyendo el
consumo de glucosa, la glucogenlisis y la gluconeognesis (Tabla III, Figs. 2 y
3). Como se muestra en la Figura 4, la expresin de la mayora de
theglucosemetabolismgenes fueron menores en monocapa o sndwich de la
cultura y no pudo capturar la vivo la expresin gnica en per fi l como se ha
indicado anteriormente (Boess et al., 2003). La rpida regulacin por
disminucin de la va de la gluconeognesis en cultivo monocapa se observa
en la Figura 3 y la Tabla III, como tambin reportado en la literatura tanto en
transcripcional (Baker et al., 2001) y los niveles de fenotipo (Yamada et al.,
1980). Por el contrario, el consumo de glucosa, el almacenamiento de
glucgeno, y la produccin de glucosa y sus expresiones de genes
constantemente todos mostraron que la cultura organoid mantiene mayor
actividad metablica relacionada con la glucosa y se acerc a los valores en
vivo, significativamente mejor que sea monocapa o cultura sndwich. En
particular, la gluconeognesis fue muy alta en las culturas donde la cultura de
organoides asitessentially disappearedafter4daysinmonolayer (Tabla III). Estos
resultados se confirmaron por tanto la actividad enzimtica (Fig. 3) y el nivel de
la transcripcin (Fig. 4) de PCK1, una enzima que controla la velocidad
implicada en la gluconeognesis. Cabe mencionar que mltiples genes estn
involucrados en el metabolismo de la glucosa (es decir, la acumulacin de
glucgeno). Esto podra explicar la-in correspondiente correlacin entre el
mantenimiento de glucgeno (Fig. 2B) y GYS2 la expresin gnica regulacin
(Fig. 4) de organoides de hepatocitos en cultivo de 2 a 4 das. La situacin es la
misma para PEPCK, que no fue mediada por slo PCK1 (Beale et al., 2007) y
por lo tanto podra ilustrar la correlacin incompatibles entre una disminucin
de la actividad PEPCK rpidamente (Fig. 3) y un PCK1 expresin
moderadamente disminuido gen (Fig. 4).

Por otra parte, las hormonas tales como la insulina, el glucagn, y

dexametasona juegan un papel crtico en el hgado durante la homeostasis de
la glucosa con una sensibilidad muy alta a una baja concentracin (nivel pMnM) in vivo (Allan y Titheradge, 1984;. Noshiro et al, 1997). Aunque monocapa
de hepatocitos ha sido utilizado para estudiar la respuesta hormonal in vitro
(Hermsdorf et al., 1999), los efectos de la hormona sobre el metabolismo de la
glucosa no fueron consistentes con in vivo e incluso contradictorias con
diferentes condiciones de incubacin (tiempo medio, ingrediente etc.) (Lpez et
al, 1984;.. Yang et al, 2009). Nuestros resultados (Fig. 5) y la mayor parte de la

literatura anterior (Lpez et al, 1984;.. Yang et al, 2009) confirman la falta de
sensibilidad de los hepatocitos en monocapa y la cultura sndwich a la
estimulacin hormonal. Tambin se ha observado que, en los pocos informes
en la que se muestra la regulacin hormonal positivo, un tiempo corto de
preincubacin (18-24 horas) y una concentracin extremadamente alta (1.000100.000-pliegues superior a nivel fisiolgico) de glucagn (Walker y Grindle,
1977) o dexametasona (Salhanick et al., 1989) eran necesarios para regular
glucgeno en los hepatocitos. Las bajas sensibilidades de monocapas de
hepatocitos fueron parcialmente atribuirse a la prdida de las funciones
hepticas, tales como la disminucin de enzimas del metabolismo de glucosa
(Walker y Grindle, 1977) y receptor de insulina-respuesta (Hansson et al.,
2004). Por contraste, la cultura organoide con las enzimas de metabolismo de
la glucosa bien conservados muestra una buena sensibilidad a la estimulacin
hormonal con la insulina, el glucagn, y dexametasona a niveles de
concentracin fisiolgicos, y adecuadamente reproduce la respuesta
estimulacin de la hormona in vivo (Fig. 5).

Sorprendentemente, el cultivo en sndwich que ha sido bien aceptado en la

literatura para la preservacin de las funciones de C FI-hgado especfica mejor
que monocapa (Toritsuka et al., 2001) mostr mejoras limitadas en imitar el
metabolismo de la glucosa y ninguna diferencia en la replicacin de la
estimulacin hormonal en comparacin con monocapas. Teniendo en cuenta las
complejidades adicionales de esta cultura con fi guracin y el consiguiente
aumento en el tiempo y el consumo de recursos, estos resultados explican por
qu en la industria farmacutica prctica no abandona a los cultivos en
suspensin o en monocapa a favor de la fi guracin sndwich. En nuestra
experiencia, la cultura organoid era ms conveniente para preparar y operar y
muestra una mejor funcin en todos los aspectos que se midieron.

Como se resume en la Tabla IV, hepatocitos sistema organoid fue demostrada

para llevar a cabo ms en vivo como el metabolismo de la glucosa hasta 4 da
y responder con mayor sensibilidad a la estimulacin fisiolgica por las
hormonas. Adems, la patgena en las respuestas del hgado in vivo, tales
como las mitocondrias inducida por la hiperglucemia; lesiones, la acumulacin
de lpidos, y la generacin de especies de oxgeno (Du et al, 2010;.. Ling et al,
2003) estaban bien imitado por la cultura organoid durante culturas de 6 das.
En contraste, los significantes desviaciones signi fi del metabolismo de glucosa
heptica de los niveles in vivo en monocapa es probable que explicar por qu
farmacolgica e fi cacia de medicamentos de antidia diabtica slo se
observan bajo una dosis de frmaco de 100 pliegues ms alta que las
concentraciones en la sangre in vivo (Davies et al ., 1999). Por lo tanto,

llegamos a la conclusin de que la cultura organoid a largo plazo es el sistema

ideal para probar el rendimiento de drogas en vivo.

conclusin

En resumen, los hepatocitos 3D protocolo de cultivo organoide demostr un

mejor metabolismo de la glucosa, la respuesta hormonal, as como la
hiperglucemia inducida por la patologa celular de hgado in vivo. Por tanto,
esta configuracin es un candidato como una plataforma mejorada, la prctica
in vitro para estudios del metabolismo de la glucosa fisiolgicas / patolgicas e
investigaciones farmacolgicas sobre medicamentos contra la diabetes y
similares. Adems, la hueca biorreactor fibra tambin permite la perfusincultivo de las clulas, lo que podra conducir a un mejor desempeo de los
organoides.
La presencia en hgado de la glucosa 6P fosfatasa,hace posible la hidrlisis del
ster fosfato en 6 y liberacin del monosacrido por los hepatocitos.
La glucosa procedente del hgado y la que no es captada por el mismo se
distribuye a otros rganos/tejidos, donde sigue distintas vas metablicas,
determinadas por el estado